Un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes adapté à l’étude de la régulation génique dans les fibres musculaires par immunoprécipitation de la chromatine est présenté.
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Article de méthode
Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les auteurs décrivent un protocole efficace et reproductible pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes, un tissu résistant physiquement avec une teneur élevée en protéines structurales. Disséqué les muscles de souris adultes sont physiquement perturbés par homogénéisation mécanique, ou une combinaison de hacher et de douncing, dans un tampon hypotonique avant la fixation de formaldéhyde du lysat cellulaire. Les noyaux fixes sont purifiés par des cycles supplémentaires d’homogénéisation mécanique ou douncing et filtrations séquentielles pour éliminer les débris cellulaires. Les noyaux purifiés peuvent être sonication immédiatement ou ultérieurement après congélation. La chromatine peut être efficacement sonication et est approprié pour les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, comme le montrent les profils obtenu pour des facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et modifications d’histone covalente. Les liaison des événements détectés à l’aide de la chromatine, établie par le présent protocole sont principalement ceux qui se produisent dans le noyau de la fibre musculaire malgré la présence de la chromatine des autres satellites associés aux fibres et les cellules endothéliales. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation génique dans le muscle squelettique de souris adulte.
Introduction
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplée à la PCR quantitative (qPCR) et séquençage à haut débit (ChIP-seq) sont devenues les méthodes de choix pour étudier la transcription et de la régulation épigénétique de l’expression génique dans divers tissus et types de cellules1. Cette technique permet de tout le génome de profilage de modifications de la chromatine covalent, occupation variant d’histone et transcription factor binding2,3.
Interprétant des puces de cellules cultivées est bien établie, une puce de tissus de mammifères reste plus difficile. ....
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Protocole
souris ont été conservés conformément aux orientations institutionnelles concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et conformément à des directives nationales de soins des animaux (Commission européenne directive 86/609/CEE ; Français le décret n° 87-848). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique national Français.
1. isolement des tissus musculaires
souris- Sacrifice un adulte 6 à 8 semaines par dislocation cervicale. Sterlise le membre en le rinçant avec l’éthanol à 70 % et disséquer les muscles de la patte arrière (muscle gastrocnémien, muscle jambier antérieur, Quadriceps) à l’aide....
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Résultats
Pour isoler les noyaux, nous avons effectué homogénéisation mécanique du tissu musculaire disséqués et hachée pour 15 ou 45 s, à 18 000 et 22 000 tr/min (voir Table des matières). Dans toutes les conditions, les noyaux pouvaient être séparés des débris tissulaires, mais le rendement est optimal à l’aide de la vitesse inférieure (Figure 1 a-B). Noyaux pourraient aussi être préparés par douncing pendant 3-5 min (
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Discussion
Nous décrivons ici un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine des muscles squelettiques des souris adultes et montrent que cette chromatine est appropriée pour les expériences de puce détectant les liaison de facteur de transcription et des modifications d’histone covalente dans les noyaux des fibres musculaires. Ce protocole implique plusieurs étapes cruciales. La première est la perturbation de tissus qui peut être effectuée soit par dounce par cisaillement mécanique. Tonte mécanique est plus rapide et p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Nous remercions tout le personnel de l’installation de séquençage à haut débit IGBMC, membre du consortium « France Génomique » (ANR10-INBS-09-08) et tous les services généraux de l’IGBMC, en particulier le personnel de l’animalerie de l’IGBMC. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le CNRS, l’INSERM, l’AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, les Français l’état des fonds par le biais de l’ANR au titre du programme Investissements d’avenir étiquetés ANR-10-IDEX-0002-02, le Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 et la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, déc....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Inhibiteur de protéase Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Perles de sépharose | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Crépines cellulaires 70um | Corning BV | 431751 | |
| Filtres cellulaires 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldéhyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| levure ARNt | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogène Bleu | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Anticorps | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Anticorps | Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP | Anticorps Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Ultrasoniseur Focalisé | Covaris E220 | ||
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Articles supplémentaires | |||
| Ciseaux | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml et 50 ml Tubes | |||
| 14 ml Tubes | |||
| 1,5 ml et 2 ml Tubes | |||
| 70 &mu ; m et 40 &mu ; Croires à cellules m (Corning) |
Références
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interac....
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Réimpressions et autorisations
