Article de méthode

Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris

DOI :

10.3791/56504

⸱

6 novembre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes adapté à l’étude de la régulation génique dans les fibres musculaires par immunoprécipitation de la chromatine est présenté.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs décrivent un protocole efficace et reproductible pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes, un tissu résistant physiquement avec une teneur élevée en protéines structurales. Disséqué les muscles de souris adultes sont physiquement perturbés par homogénéisation mécanique, ou une combinaison de hacher et de douncing, dans un tampon hypotonique avant la fixation de formaldéhyde du lysat cellulaire. Les noyaux fixes sont purifiés par des cycles supplémentaires d’homogénéisation mécanique ou douncing et filtrations séquentielles pour éliminer les débris cellulaires. Les noyaux purifiés peuvent être sonication immédiatement ou ultérieurement après congélation. La chromatine peut être efficacement sonication et est approprié pour les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, comme le montrent les profils obtenu pour des facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et modifications d’histone covalente. Les liaison des événements détectés à l’aide de la chromatine, établie par le présent protocole sont principalement ceux qui se produisent dans le noyau de la fibre musculaire malgré la présence de la chromatine des autres satellites associés aux fibres et les cellules endothéliales. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation génique dans le muscle squelettique de souris adulte.

Introduction

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Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplée à la PCR quantitative (qPCR) et séquençage à haut débit (ChIP-seq) sont devenues les méthodes de choix pour étudier la transcription et de la régulation épigénétique de l’expression génique dans divers tissus et types de cellules1. Cette technique permet de tout le génome de profilage de modifications de la chromatine covalent, occupation variant d’histone et transcription factor binding2,3.

Interprétant des puces de cellules cultivées est bien établie, une puce de tissus de mammifères reste plus difficile. Préparer la chromatine ChIP implique plusieurs étapes essentielles qui doivent être optimisées pour chaque type de tissus et de cellules. Chromatine peut être préparée à partir les lysats cellulaires des cellules cultivées ou purification suivante de leurs noyaux. Dans le cas de tissus de mammifères, lyse efficace, fixation de formaldéhyde et de purification des noyaux sont essentiels pour assurer un recouvrement optimal de la chromatine. En outre, le choix s’il convient de fixer les noyaux avant ou après leur purification doit être déterminée expérimentalement. Malgré ces obstacles, ChIP a été effectué avec succès des tissus tels que le foie, testicules ou cerveau4,5,6. Dans le cas du muscle squelettique, perturbation d’un tissu résistant physiquement, qui présente une teneur élevée en protéines de structure et l’isolation de ses noyaux est particulièrement difficile. Compte tenu de cette spécificité, protocoles optimisés pour les autres tissus ne donnent pas des résultats satisfaisants pour les muscles squelettiques.

Nous décrivons ici un protocole afin d’isoler la chromatine ChIP-grade du tissu de muscle squelettique de souris qui consiste à perturber physiquement le tissu, la fixation de formaldéhyde et puis l’isolement des noyaux et sonication. L’efficacité de cette méthode pour préparer la chromatine convenant à la puce de ce tissu a été démontrée en effectuant la puce-qPCR et ChIP-seq pour divers facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et covalents histone modifications7.

Cette nouvelle technique est beaucoup plus rapide qu’un protocole a déjà été indiqué8 comprenant depuis longtemps des mesures de digestion de collagénase au cours de laquelle, les changements dans la localisation génomique des facteurs de transcription et les altérations de l’expression des gènes peuvent avoir lieu. La rapidité avec laquelle les noyaux sont isolées et fixe rend la méthode décrite ici particulièrement attractif pour préparer la chromatine qui capte plus fidèlement l’état d’occupation génomique native. En outre, bien que les autres méthodes pour l’extraction de la chromatine isolement ou des protéines de tissu musculaire ont ont été décrit8,9,10 et utilisés pour des expériences de puce-qPCR sur certains gènes, aucun ChIP-seq données a été signalées à les utiliser. La méthode rapportée ici convient pour transcription factor et histone modification ChIP-seq et par conséquent doit être également adaptée aux 3 / 4C ou les applications de capture conformation de la chromatine HiC.

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Protocole

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souris ont été conservés conformément aux orientations institutionnelles concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et conformément à des directives nationales de soins des animaux (Commission européenne directive 86/609/CEE ; Français le décret n° 87-848). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique national Français.

1. isolement des tissus musculaires

souris
  1. Sacrifice un adulte 6 à 8 semaines par dislocation cervicale. Sterlise le membre en le rinçant avec l’éthanol à 70 % et disséquer les muscles de la patte arrière (muscle gastrocnémien, muscle jambier antérieur, Quadriceps) à l’aide de ciseaux de la pointe fine et forceps.
    Remarque : Une souris devrait produire environ 500 mg de tissu.
  2. Hachez les muscles dans un tube à essai 2 mL contenant 1 mL de tampon hypotonique glacée d’une préparation homogène des petits (< 2-3 mm 3) morceaux à l’aide de fins ciseaux et laisser le tube tremblaient sur un agitateur de dessus de banc à 4 ° C pendant 5-10 min.

2. La lyse des tissus

Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.

  1. Transférer l’homogénat dans un tube de fond rond de 14 mL et remettre en suspension dans 5 mL de tampon hypotonique froid (sans EDTA inhibiteur de protéase cocktail et PMSF).
    1. Homogenise le tissu de muscle hachées à l’aide d’un lâche dounce (20-30 coups de moins de 3 min) ou un homogénéisateur tissu mécanique pour 15-30 s en tubes fond rond 14 mL.
      Remarque : L’efficacité de la lyse peut être évaluée à ce stade en microscopie photonique, et le cas échéant, des perturbations supplémentaires peuvent être effectuées.
  2. Transférer l’homogénat pour tubes de 15 mL et remplir le volume à 10 mL à l’aide du tampon hypotonique froid. Difficulté de l’homogénat tel que décrit ci-dessous avant de procéder à la prochaine souris.

3. Fixation

  1. Ajoutez le formaldéhyde à concentration finale de 1 % et agiter pendant 10 min à température ambiante.
  2. Ajouter glycine à une concentration finale de 0,125 M dans chaque tube pour arrêter la fixation et agiter pendant 5-10 min à température ambiante.

4. Préparation des noyaux

Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.

  1. Homogenise le lysat fixe utilisant un dounce lâche (5 à 10 fois).
    1. Transfert à un tube de 15 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir des noyaux et des débris cellulaires.
  2. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans tampon hypotonique frais 5 mL. Filtrer le lysat à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube de 50 mL. Re-filtrer le filtrat à travers un tamis de cellule de 40 µm.
  3. Transvaser le filtrat dans un tube de 15 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 minutes à 4 ° C pour obtenir le culot nucléaire.
    Remarque : À ce stade, les noyaux peuvent être immédiatement sonication ou snap gelé comme une pastille sèche dans l’azote liquide et conservé à -80 ° C.

5. Sonication

  1. évaluer le volume du culot nucléaire (environ 50 µL d’homogénéisation mécanique tant dounce) et il remettre en suspension dans un tampon de sonication jusqu'à 3 à 4 fois de volume nucléaire emballé et laisser agir pendant 10-15 min à 4 ° C en utilisant un sonicateur .
    Remarque : La chromatine peut être analysée immédiatement comme décrit ci-dessous (6) ou congelée et conservée à -80 ° C.

6. Évaluer la taille de Fragment de chromatine après Sonication

Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.

  1. De-crosslink, prendre 30 µL de la chromatine dans une éprouvette de 1,5 mL et ajouter 20 µL 5 M NaCl. Compléter le volume à 500 µL et incuber à 65 ° C pendant la nuit.
    1. Le lendemain, effectuer un traitement avec de protéinase K 1 µL (stock de 20 mg/mL), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 et 10 µL d’EDTA 0,5 M pendant 1 h à 42 C. effectuer un phénol-chloroforme/chloroforme extraction et précipiter l’ADN avec 1 volume de sodium acetat e (3 M) et 2 volumes d’éthanol à 100 % pour 1 heure à-80 ° C ou une nuit entre -20 ° C.
  2. L’ADN de granule par centrifugation à 13 500 g pendant 15 min. décanter le liquide surnageant et laver le culot soigneusement avec l’éthanol 70 % froid et centrifuger à nouveau pendant 5 min. décanter le liquide surnageant et sécher le culot.
  3. Resuspendre le culot dans le volume original (30 µL) de tampon TE. Mesurer la concentration d’ADN dans un spectrophotomètre par absorption à 260 nm/280 nm. Pipeter 500-1 000 ng d’ADN avec une échelle de taille d’ADN sur des voies séparées d’un gel d’agarose de 1,5 % et effectuer l’électrophorèse pour évaluer la taille des fragments de chromatine.
    Remarque : Taille du Fragment doit être comprise entre 200 à 500 paires de bases et il ne devrait y avoir aucun fragment détectable de haut poids moléculaire correspondant au non - ou mal-fragmentation ADN. Si nécessaire, la solution de la chromatine (étape 5) peut être re-sonication pendant un certain temps et puis analysée de nouveau comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtention de la taille optimale.

7. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.

  1. Sépharose perles de bloquer la protéine G par aliquotage 1 mL de la boue de 50 % dans l’éthanol. Pellet les perles par centrifugation à 400 g pendant 1 min dans une table de travail centrifuger et laver avec 1 mL de centrifugeuse tampon TE à 400 x g et répéter le Wash.
    1. Après que la seconde centrifugation, de remettre en suspension dans 1 mL de tampon de dilution de puce avec 25 µL de BSA (stock 20 mg/mL) et de 20 µL tRNA (stock 10 mg/mL) de levure. Bloquer les perles au moins 2 h avant son utilisation en rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C.
    2. Diluer 50 µg de chromatine (étape 5) 8 à 10 fois en utilisant le tampon de dilution de puce. Ajouter 50 µL de lisier perle bloqués et incuber pendant 2 h rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C. Centrifuger à 400 x g à 4 ° C pour obtenir la chromatine préapprouvée et le transférer dans un nouveau tube.
  2. Pour l’immunoprécipitation, ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaire (p. ex., 1 à 2 µg / 10 µg de chromatine) et incuber pendant la nuit avec rotation à 4 ° C.
    NOTE : La quantité optimale d’anticorps peut être recommandée par le fournisseur ou peut être déterminée empiriquement en effectuant la puce-qPCR avec différentes quantités d’anticorps jusqu'à ce que l’enrichissement optimum est observée. Aussi G protéine Sépharose peut être remplacé par protéine A Sépharose selon le sous-type de l’anticorps utilisé.
  3. Ajouter les perles bloqués le lendemain et incuber pendant 1 heure avec rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C. Centrifuger à 400 x g pendant 20-30 s pour les perles de granule, éliminer le surnageant et commencer la puce se lave.
  4. ChIP lavages : effectuer les lavages suivants avec les tampons : une fois avec le tampon salin faible, puis deux fois avec le tampon salin haute, deux fois avec le tampon de LiCl et enfin deux fois avec le tampon TE.
    1. Effectuer chaque lavage pendant 10 min avec rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C et -pellet les perles entre chaque lavage par centrifugation à 400 x g pendant 20-30 s dans une centrifugeuse de paillasse.
  5. Pour l’élution, enlever le dernier lavage et remettre en suspension les perles dans 250 µL de tampon d’élution (fraîchement préparé) pendant 15 min à température ambiante en agitant.
  6. Centrifugeuse à 400 x g et recueillir l’éluat dans un nouveau tube. Effectuez cette étape deux fois, puis de-crosslink l’éluat du jour au lendemain avec 20 µL NaCl 5 M et 1 µL RNase A (10 mg/mL), traiter avec la protéinase K et phénol-chloroforme/chloroforme extragir comme dans l’étape 6.
  7. Remettre en suspension dans 50 µL de tampon TE et utiliser des aliquotes pour puce-qPCR selon les protocoles standard 15 pour vérifier la qualité de la puce.

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Résultats

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Pour isoler les noyaux, nous avons effectué homogénéisation mécanique du tissu musculaire disséqués et hachée pour 15 ou 45 s, à 18 000 et 22 000 tr/min (voir Table des matières). Dans toutes les conditions, les noyaux pouvaient être séparés des débris tissulaires, mais le rendement est optimal à l’aide de la vitesse inférieure (Figure 1 a-B). Noyaux pourraient aussi être préparés par douncing pendant 3-5 min (

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Discussion

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Nous décrivons ici un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine des muscles squelettiques des souris adultes et montrent que cette chromatine est appropriée pour les expériences de puce détectant les liaison de facteur de transcription et des modifications d’histone covalente dans les noyaux des fibres musculaires. Ce protocole implique plusieurs étapes cruciales. La première est la perturbation de tissus qui peut être effectuée soit par dounce par cisaillement mécanique. Tonte mécanique est plus rapide et p...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions tout le personnel de l’installation de séquençage à haut débit IGBMC, membre du consortium « France Génomique » (ANR10-INBS-09-08) et tous les services généraux de l’IGBMC, en particulier le personnel de l’animalerie de l’IGBMC. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le CNRS, l’INSERM, l’AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, les Français l’état des fonds par le biais de l’ANR au titre du programme Investissements d’avenir étiquetés ANR-10-IDEX-0002-02, le Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 et la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. S.J a été appuyée par la Ligue Nationale contre le Cancer et le ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 et V.U par le Ministère de l’enseignement et de la Recherche. ID est une « équipe labellisée » de la Ligue Nationale contre le Cancer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
T 25 digital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Inhibiteur de protéase Cocktail-EDTA FreeRoche Diagnostics11873580001
Protein G Perles de sépharoseSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinase KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Crépines cellulaires 70umCorning BV431751
Filtres cellulaires 40umCorning BV352340
Formaldéhyde EM gradeEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific12091039
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
levure ARNtSIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Glycogène BleuAMIBIONAM9516
Pol II ChIP AnticorpsSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP AnticorpsMotif39133
Tead4 ChIPAnticorps Aviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Ultrasoniseur FocaliséCovaris E220
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
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Références

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Mots-clés

Pr paration de la chromatinehomog n isation m caniquefixation au formald hydepurification des noyauxprotocole de sonicationextraction de l ADNs quen age ChIPliaison des facteurs de transcription

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