Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

Résumé

Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.

Résumé

Un certain nombre de méthodes ont été décrit pour établir des lignées de cellules NK/T de patients atteints de syndrome lymphoprolifératif ou de lymphome. Ces méthodes employées des cellules nourricières, les cellules NK ou T purifiées autant que 10 ml de sang ou une dose élevée d’il-2. Cette étude présente une nouvelle méthode avec une stratégie simple et puissante pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant le périphérique du sang des cellules mononucléaires (PBMC) avec l’ajout d’il-2 de recombinante humaine (rhIL-2) et utilise aussi peu que 2 mL de sang total. Les cellules peuvent proliférer rapidement dans les deux semaines et être maintenues pendant plus de 3 mois. Avec cette méthode, 7 lignes de NK ou les lymphocytes T ont été établis avec un taux de réussite élevé. Cette méthode est simple, fiable et applicable à l’établissement de lignées cellulaires de plus de cas de lymphome à cellules NK/T ou de CAEBV.

Introduction

Virus d’Epstein - Barr (EBV) est omniprésent et infecte non seulement B cellules, mais aussi T et natural killer (NK), ce qui provoque un certain nombre de maladies de Syndromes lymphoprolifératifs associés à l’EBV NK/T (LPD) et Lymphome/leucémie, telles que l’activation macrophagique associés à EBV familiale, hydroa vacciniforme type lymphome, lymphome à cellules NK/T extraganglionnaires, type nasal et NK agressive cellule leucémie^1,2,3. Parmi ceux-ci est la maladie chronique grave actif EBV (SCAEBV), qui est incident principalement en Asie du sud-est, et qui est maintenant considéré comme un LPD causée par une expansion clonale d’infectées par l’EBV T ou NK cellules^{4,5,6, 7}, mais sans l’immunodéficience apparente présent dans la mononucléose infectieuse (MNI)-comme symptômes, y compris la fièvre, une hépatosplénomégalie, une lymphadénopathie et dysfonction hépatique persistante ou récurrente, ainsi que EBV-ADN haute charge dans la sang périphérique^8,9. Patients atteints de CAEBV ont un mauvais pronostic^10,11et sa pathogenèse, et ignore le rôle de l’EBV. Donc, lignées dérivées de maladies lymphoprolifératives associés à EBV NK/T de cellules et de lymphomes sont très utiles comme modèles cellulaires pour clarifier le mécanisme d’EBV induit la prolifération NK et des lymphocytes T et sa relation à forte incidence de la leucémie ou lymphome.

A ce jour, plusieurs lignées cellulaires ont été établies avec différentes techniques^{12,13,14,15,16}. Une lignée humaine de cellules NK, NK-YS, créait de leucémie/lymphome à cellules NK, co-culture avec une lignée de cellules stromales de souris comme conducteur et en présence de rhIL-2 à une concentration de 20U par tranche de¹⁵mL. KAI3 était une autre lignée de cellules NK, établie à partir de patients présentant une allergie sévère moustique ou SCAEBV avec la lignée lymphoblastoïde autologue (LCL), les lymphocytes B transformés par EBV, sous forme de cellules nourricières et ajout de rhIL-2 à 100U/mL¹⁶. SNK6 et SNT8 ont été dérivées de tissus de tumeur nasale patients de lymphome de cellules NK/T en ajoutant de fortes doses de rhIL-2 (700U/mL)¹². Avec une technique similaire, la cellule de SNK-1 était de patients CAEBV, cultivées de PBMC en enlevant les cellules T et ajoutant 700U/mL rhIL-2^13,,¹⁷. SNT13 et SNT15 ont été créés en supprimant les CD4 + et CD8 + cellules¹⁸. Jusqu'à présent, autres lignées cellulaires de cellules T et NK de patients EBV-NK/T LPD ont tous été conçues avec cette méthode¹⁹.

Les inconvénients des méthodes existantes mentionnées ci-dessus comprennent l’emploi de cellules nourricières, l’exigence d’une forte dose de IL-2, l’utilisation d’autant que 10 mL de sang total ou la purification des cellules NK/T, qui est très difficile dans la clinique due à la nécessité de vérifier quels types de cellules que EBV latentes infecte avant de commencer à la culture. CAEBV se produit principalement chez les enfants en Asie, 10 mL de sang n’est pas facile à acquérir dans toutes les régions. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode simple avec un taux de réussite élevé pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant des PBMC de patients CAEBV en utilisant une faible dose de rhIL2 et un volume de 2 mL de sang total sans cellules nourricières. Les résultats de cette méthode ont prouvé sa grande efficacité et gain de temps.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut de génétique et biologie du développement, Académie chinoise des Sciences, et le protocole suit les lignes directrices pour le bien-être de l’humanité.

Remarque : Voir la Figure 1 pour un schéma du flux de travail.

1. isolement des PBMC de Patients CAEBV

1. Purifier les PBMC primaire de 2 mL de sang total des patients CAEBV en dégradé (par exemple, gradient de Ficoll-plaque) centrifugation en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, décongelez les PBMC cryoconservé d’azote liquide avec milieu RPMI 1640.
2. Ajouter 2 µL de bleu trypan (0,4 %) à 18 µL de la suspension cellulaire, attendez pendant 3 min à cellules, transférer la suspension à la plaque de renfort de cellule et mesurer la concentration des cellules et la viabilité avec un compteur de cellules automatisées.
3. Préparer la suspension de cellules à une densité de 2-3 × 10⁶ cellules/mL additionné de milieu de culture RPMI 1640 complet contenant 20 % de sérum humain (chaleur inactivée à 56 ° C), 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 µg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline). Semences de 1 mL de suspension PBMC par puits dans les plaques de culture cellulaire de 24 puits.
4. Ajouter 150 U rhIL-2 / puits.
5. Placer les plaques de culture dans un incubateur à₂ CO 5 % à 37 ° C.
6. Jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope (grossissement de 200 X) ; les cellules sont en bon état lorsqu’elles sont lumineuses et rond.

2. l’expansion des cellules et les cellules viables de numérotation

1. Observer la morphologie des cellules au microscope (grossissement de X 200) et surveiller la condition de la croissance cellulaire en numérotant les cellules avant de changer de milieu : ajoutez 2 µL de bleu trypan (0,4 %) à 18 µL de la suspension cellulaire, puis calculer la concentration des cellules (voir 1.2, Figure 2).
2. Jeter 500 µL de milieu dans une plaque 24 puits et ajouter 500 µL frais milieu culture complet. Ajouter 150U rhIL-2 / puits.
3. Changer le milieu deux fois par semaine comme à l’étape 2.2.
4. Tracer la courbe de croissance cellulaire (Figure 3).
5. Lorsque concentration les cellules viables dépasse 5 × 10⁶par millilitre, diviser les cellules en nouveaux puits à une concentration de 1 à 2 × 10⁶ cellules/mL dans chaque puits. Ce processus prend de 2 à 4 semaines.

3. cellule phénotypage par cytométrie en flux

1. Lorsque les cellules ont développé, collecter 1 × 10⁶ cellules pour déterminer les phénotypes des lignées cellulaires. Centrifuger à 240 x g pendant 5 min à température ambiante, les cellules (cellules NK/T vont précipiter au fond du tube).
2. Jeter le surnageant, laver la précipitation en ajoutant 7 mL de PBS. Centrifuger pendant 5 min à 240 x g à la température ambiante. Répéter une fois.
3. Ajouter 200 µL de sérum humain dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
4. Centrifuger les cellules à 240 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 1 × 10⁶par millilitre avec la LNPP froid (PBS+0.2%BSA). Diviser des cellules en 5 tubes, chaque tube contenant 2 cellules de⁵ × 10.
5. Cellules de centrifugeuse à 240 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec un tampon LNPP ou LNPP contenant 10 µL PE (ou PE-Cy7) et 10 µL FITC marqué anticorps pour souiller des récepteurs des cellules T ou NK sur glace comme l’indique la Figure 4. Cellules suspendues avec le tampon de la LNPP sont utilisés comme contrôle négatif.
6. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20-30 min sur la glace dans l’obscurité.
7. Laver les cellules deux fois avec la LNPP froid, remettre en suspension les cellules avec 300 µL LNPP froid.
8. Analyser le phénotype cellulaire avec un cytomètre en flux.
   1. Mettre en place le cytomètre de flux en état de « Créer la feuille de calcul ». Mettre en place le modèle expérimental, avec un terrain de dot qui s’affiche avant dispersion (FSC) versus diffusion latérale (SSC).
   2. Chargez le tube isotype de contrôle afin d’optimiser les tensions FSC et SSC et optimiser la valeur de seuil FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population de cellules d’intérêt. Supprimer tous les paramètres sauf FSC, SSC, FITC, PE et PE-Cy7.
   3. Effectuer une compensation en utilisant le contrôle de l’isotype et un seul contrôle positif dans chaque groupe d’analyse de 2 couleurs.
   4. Charger des échantillons et créer HLA-DR VS CD19, CD4 CD8 VS, CD56 VS CD16 et CD3 VS CD16 dot emplacements montrant les différentes populations de cellules.
      NOTE : PBMC ont été utilisés pour effectuer une compensation en utilisant le contrôle négatif/isotype et le seul contrôle positif. 2 couleurs immunofluorescence avec cytomètre en flux a été utilisé couramment pour analyser l’expression des marqueurs de surface. Les anticorps suivants sont inclus : anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugué avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 conjugué à la phycoérythrine (PE) et anti-CD19 conjugué avec PE-Cy7.

4. expansion et la cryoconservation des cellules NK/T

1. Changer le support lors de l’analyse du phénotype cellulaire est terminée. Avec précaution, retirer la moitié du liquide surnageant et évitez de toucher les cellules au fond de la plaque. Ajouter le même volume de milieu de culture frais contenant 300 U/mL rhIL-2 pour les plaques de la cellule.
2. Changer la moitié de la moyenne tous les 3 jours (comme 2.2) jusqu'à la cellule grappes sont clairement visibles au microscope (Figure 2). En général, ce processus prend 2-3 semaines.
3. Transférer les cellules de plaques 24 puits à T25 flacons de culture après le mélange des différents puits de la même lignée. Doubler le volume de milieu de culture qu’il se colore en jaune jusqu'à ce que le volume du milieu se développe à 10-15 mL. Ajouter rhIL-2 avec la concentration de 150 U/mL.
4. Changer de milieu 24 h avant de les congeler après 2-3 semaines de plus en plus, lorsque la cellule de masse peut être observée à le œil nu. Mesurer la concentration cellulaire avec un compteur de cellules.
5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g et Resuspendre le culot cellulaire à une densité de 5-10 x 10⁶ cellules/mL avec la solution mère congelée, qui contient le sérum de veau fœtal 90 % et 10 % diméthylsulfoxyde (DMSO). Gel à raison de 1 ° C / min jusqu'à-80 ° C et puis les transférer directement dans l’azote liquide.

Résultats

Après que 3 jours culture lors de la création de lignées cellulaires, les cellules polymorphes commencent à apparaître (Figure 2). Après 7 jours, les cellules se développent rapidement, comme le numéro et la viabilité des cellules croissent à un rythme élevé (Figure 3). Petits amas de cellules sont clairement visibles après 10-14 jours de plus en plus, lorsque la concentration en cellules peut dépasser les 3 à 6 × 10⁶....

Discussion

Dans ce protocole, une nouvelle technique pour l’établissement de lignées de cellules NK/T de sang des patients CAEBV a été développée. Comparaison avec les méthodes existantes, l’avantage majeur de cette méthode est sa simplicité et son exigence de seulement une petite quantité de sang, alors qu’il présente un taux de réussite élevé et de bonnes conditions de viabilité des cellules. En outre, les lignées de cellules NK/T peuvent être établies en cultivant des PBMC sans déterminer les types de cellules l’EBV latentes inf...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps Hu HLA-DR FITC	BD		pour FACS
Hu CD4 FITC	BD	555346	anticorps pour FACS
Hu/NHP CD8 PE	BD	557086	anticorps pour FACS
Hu CD3 PE	BD	555340	Anticorps pour FACS
Hu CD16 FITC 3G8	BD	555406	anticorps pour FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31	BD	Anticorps 556647	pour FACS
hu/CD19 PE-Cy7	BD	560728	pour FACS
IL-2 humain	Roche	11147528001
humain	MRC	CCC118-125
Incubateur CO2	SANYO
Centrifuge	Techcomp	CT6T	Microscope de centrifugation
	OLYMPUS CKX53	CKX53
Compteur de cellules automatisé	Countstar	IC 1000	Pour le comptage
24 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3524	Plaques de polystyrène
25cm2 flacon de culture cellulaire	Nest	707001	Polystyrène
FBS	Gibco	10270	Composant du milieu
cellulaire RPMI Milieu 1640	22400089 de vie		Pour le milieu cellulaire
L-Glutamine	Amresco	374	Composant du milieu cellulaire
100 x solution de pénicilline de streptomycine BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Composant du milieu cellulaire
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Pour l’isolement in vitro du lymphocyte
DMSO	Sigma	D2650	Pour la congélation des cellules
cytomètre en flux	BD	BD FACSAria II
soft ware	BD	BD FACSDiva soft ware FACS	analysis