Method Article

Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but du présent protocole doit démontrer une méthode efficace pour decellularize et détartre limaçon souris pour utilisation comme échafaudages pour applications d’ingénierie tissulaire.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chez les mammifères, les cellules ciliées mécanosensoriels qui facilitent l’absence d’audience la capacité de régénération, qui a limité les traitements pour la perte auditive. Les stratégies actuelles de la médecine régénérative ont mis l’accent sur la transplantation de cellules souches ou manipulation génétique d’entourant les cellules de soutien dans l’oreille interne pour encourager le remplacement des cellules endommagées de tige pour corriger une perte auditive. Pourtant, la matrice extracellulaire (ECM) peut jouer un rôle vital dans l’induction et de maintien de la fonction des cellules ciliées et n’a pas été bien étudiée. À l’aide de la vis d’Archimède ECM comme un échafaudage à cultiver des cellules souches adultes peut-être fournir un aperçu unique Comment la composition et l’architecture de l’environnement extracellulaire aide les cellules à maintenir une fonction d’audition. Nous présentons ici une méthode pour isoler et decellularizing limaçon des souris à utiliser comme échafaudages acceptant les cellules souches adultes perfusés. Dans le protocole actuel, limaçon est isolés des souris euthanasiés, DECELLULARISE et détartré. Par la suite, les cellules de la gelée de Wharton humaine (hWJCs) qui ont été isolés dans le cordon ombilical ont été soigneusement perfusés dans chaque cochlée. Le limaçon servaient de bioréacteurs, et les cellules ont été cultivés pendant 30 jours avant de subir le traitement pour l’analyse. Limaçon DECELLULARISE conservé des structures extracellulaires identifiables, mais n’a pas révélé la présence de cellules ou des fragments d’ADN visibles. Les cellules perfusés dans la cochlée envahirent la plus grande partie de l’intérieur et l’extérieur de la cochlée et grandit sans incident pendant une durée de 30 jours. Ainsi, la méthode actuelle peut servir à étudier comment cochléaire ECM affecte le développement de cellules et de comportement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cochlée est une structure complexe en spirale dans l’OS temporal. Il est composé d’un labyrinthe osseux externe et un labyrinthe membraneux concentriques, intérieure1. Le labyrinthe membraneux se compose de trois espaces fluides : Scala vestibulaire, Scala media et Scala timbales1. Les médias de scala abrite l’épithélium sensoriel, qui est composé d’une multitude de types de cellules, mais les cellules sensorielles de cheveux (HC), qui transmettre l’énergie mécanique en ondes sonores d’influx nerveux2, sont particulièrement intéressants. Exposition au traumatisme acoustique3,4,5, médicament6, maladie7,8et vieillissement,9 peut tous entraîner dysfonctionnement auditif par l’intermédiaire de la mort HC. Perte des cellules ciliées chez les mammifères est permanente, contrairement à aviaires HCs, qui peuvent se régénérer après blessure10.

Une variété de recherches contemporaines ont cherché à restaurer perdus HCs, bien que les approches expérimentales spécifiques varient. Manipulation de l’expression génique dans l’épithélium sensoriel et l’implantation de cellules souches différenciées en dehors du corps sont des approches dominantes dans le domaine, bien que les méthodes d’induction qui cherchent à différencier des cellules souches dans cochlear organoïdes ont été tentative de11,12,13. Chacune de ces approches est soit directement sur les cellules souches, ou les indices de développement utilisés par les cellules souches ; Cependant, une seconde partagé, et potentiellement critiques, élément est l’ECM de la cochlée elle-même14,15.

L’ECM propose non seulement un support physique des cellules et des tissus, ce qui inclut une surface pour l’adhésion cellulaire, la prolifération, la survie et la migration, mais joue également un rôle crucial dans le développement du HCs et la spirale ganglion15,16 ,,17. Naturellement présents ECM propose des signaux inductifs qui peuvent guider la détermination du phénotype cellulaire et/ou d’adhérence, la prolifération et la survie cellulaire18. Par conséquent, l’utilisation de la cochlée DECELLULARISE en combinaison avec des hWJCs cultivées offrent une occasion unique d’explorer le rôle de la régénération de l’ECM et HC. HWJCs sont un type de cellule facilement disponible, non sujettes à controverse isolé de cordons ombilicaux humains qui se comportent comme des cellules souches mésenchymateuses19. HWJCs ont démontré la capacité de différencier vers le bas de la cellule neurosensorielle lignées20,21. Ainsi, le protocole actuel en détail l’isolement, DÉCELLULARISATION et la perfusion du limaçon de carcasses de souris C57BL avec hWJCs pour l’ingénierie tissulaire oreille interne.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures, y compris l’euthanasie animale, ont été effectuées selon le protocole institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) approuvé (APUC #2014-2234) à l’Université du Kansas Medical Center (KUMC).

Remarque : HWJCs ont été isolées de cordons ombilicaux humains qui ont été donnés par les patients qui a donné son consentement éclairé et spécimens ont été utilisés conformément aux protocoles approuvés par le Comité de sujets humains Université du Kansas (KU-CISR #15402).

1. l’OS Temporal récolte et l’isolement de la cochlée

  1. Décapiter une souris convenablement euthanasiée, 15 semaines de coupe entre le crâne et la première vertèbre cervicale avec des ciseaux chirurgicaux aiguisés, puis vaporiser vers le bas de la tête avec l’éthanol à 70 % pour désinfecter (Figure 1 a).
  2. Coupent le crâne dans un plan longitudinal à l’aide de la même paire forte de ciseaux chirurgicaux (Figure 1 b-C, lignes pointillées).
  3. Retirez le tissu cérébral du crâne à l’aide d’une paire de pinces (Figure 1, flèche).
  4. Identifier l’OS temporal à travers la présence de l’auditif et les racines de nerf vestibulaire (Figure 1E-F, pointes de flèche) à l’intérieur du crâne et le conduit auditif de l’extérieur (Figure 1F, flèche). Découpez soigneusement à travers le crâne pour isoler l’OS temporal du reste du crâne (Figure 1).
    Remarque : Dans certains cas, il peut être possible de dégager délicatement l’OS environnants du crâne de l’OS temporal sans nécessiter de coupe.
  5. Insérer la pince fine dans l’ouverture du conduit auditif environ 5 mm (Figure 1 H), donc les conseils ne risquent pas de percer la cochlée. Casser délicatement l’os de la bulle tympanique (Figure 1 H, haut rouge zone ombrée) donc il fractures (ligneFigure 1I, rouge pointillée).
    Remarque : Si nécessaire, un microscope à dissection peut aider dans ce processus afin d’assurer un positionnement précis et la manipulation des instruments.
  6. À l’aide de pinces fines, dégager loin le reste de la bulle tympanique de l’OS temporal, exposant le labyrinthe osseux de la cochlée (Figure 1J, supports de rouges).
  7. Placez une boîte de Pétri assez grande pour contenir de l’OS temporal (p. ex., 30 mm ou plus) sous la dissection étendue de champ et remplissez-le avec assez Phosphate Buffered Saline (PBS) pour couvrir l’OS temporal (par exemple, 0,5 à 1 mL).
  8. Plonger l’OS temporal avec la bulle tympanique supprimée dans le PBS avec les fenêtres ovales et rondes de la cochlée vers le haut.
    Remarque : Suppression du système vestibulaire de la cochlée n’est pas nécessaire, car le système vestibulaire sert bien une poignée de manipulation et d’orienter les caractéristiques de la cochlée (Figure 1I et Figure 2 b).
  9. Avec un ultra fine paire de pinces, retirer l’artère stapédiens, qui traverse l’étrier.
  10. Insérez une extrémité de la pince ultra fine à travers l’arche de l’étrier où l’artère est transmise et soulever délicatement l’étrier. L’étrier désarticulés devrait soulever hors de la fenêtre ovale.
  11. À l’aide d’une pointe de la pince ultra-fine, perforer l’ovale et ronde de windows.
  12. À l’aide d’une solution de PBS 1 x rempli de 28,5 calibre seringue avec tuyau (diamètre intérieur 0,28 mm, diamètre extérieur 0,61 mm) attaché, positionner le tube sur la fenêtre ovale (Figure 2 a -B).
    Remarque : L’ouverture du tube peut être manipulé à l’aide de la pince ultra-fine contribuant à assurer un positionnement précis.
    1. Utiliser une seringue fraîche et les tubes pour chaque cochlée.
  13. Perfuse 2 mL d’antibiotique-antimycosiques (anti-anti) 10 % et 10 % la pénicilline-streptomycine (stylo-strep) dans du PBS par le biais de la cochlée pendant 5 min pour enlever la périlymphe. Perfusant trop vite avec trop de pression peut endommager les structures fines dans la cochlée.
    Remarque : Conduire manuellement la seringue à la main pour perfuse le liquide dans la cochlée est efficace, bien qu’une pompe à perfusion pourrait être utilisée comme une alternative.
    1. Si perfusant manuellement, utilisez une paire de fines, fermeture automatique des pinces pour stabiliser la cochlée (Figure 2 a) au cours de la perfusion en saisissant la partie vestibulaire de l’OS temporal.
      Remarque : Bien que non obligatoire, ce qui laisse les deux mains libres pour manipuler les instruments ; une main peut conduire à la seringue (Figure 2 a) tandis que l’autre permet de positionner le tube de façon appropriée (Figure 2 b).
    2. De cette étape vers l’avant, prenez soin de ne pas exposer la cochlée inutilement à l’air. Introduire des bulles d’air dans les espaces fluides se bloque la circulation du fluide, et les sécher n’endommage les structures fines dans la cochlée.
  14. Retirez et jetez n’importe quel muscle tissu et l’OS fragments restants à l’aide de pinces fines.
  15. Si nécessaire, stocker limaçon isolé à 4 ° C en solution de strep-stylo de 10 % dans du PBS et anti-anti 10 % jusqu'à sept jours, avec des changements réguliers de solution antibiotique toutes les 48 h.

2. cochléaire traitement

  1. DÉCELLULARISATION
    1. Pour chaque cochlée, remplir un flacon à scintillation de verre de 20 mL avec un 1 % sodium dodécyl sulfate solution (SDS) dans de l’eau déminéralisée (DI), qui sert à decellularize la cochlée.
    2. Couper l’extrémité hors d’une pipette de transfert 7 mL en plastique à l’aide d’une lame de rasoir afin que l’ouverture soit assez grande pour une cochlée de passer à travers.
    3. À l’aide de la pipette de transfert, doucement dresser la cochlée dans la pipette alors il passe juste au bord de la coupure de quelques millimètres.
    4. Expulser la cochlée dans le flacon 1 % de scintillation rempli de solution SDS.
    5. Faire circuler 2 mL de SDS de 1 % dans de l’eau déminéralisée (DI) par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.
    6. Placer le flacon à scintillation dans une coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante.
      1. Changez 1 % SDS solution toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement de SDS pour ne pas exposer la cochlée dans l’atmosphère.
    7. Laver la cochlée trois fois de 30 min chacun, avec l’eau distillée.
Effectuer les lavages dans le même flacon à scintillation, utilisé pour des charges de la SDD ; à ce stade, la cochlée est DECELLULARISE.
  • Décalcification
    1. Retirez l’eau DI le flacon à scintillation, laissant juste assez pour garder la cochlée submergés.
    2. Pour commencer une décalcification, ajouter 5 mL de 10 % d’acide tétraacétique (EDTA) (0,02 M) dans l’eau distillée dans le flacon à scintillation contenant de la cochlée.
    3. Faire circuler 2 mL d’EDTA 10 % dans l’eau distillée par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.
    4. Remettre le flacon à scintillation dans la coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante. Changer la solution d’EDTA 10 % toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement des solutions afin que la cochlée n’est pas exposée à l’air.
    5. Rincer la cochlée 3 fois pendant 2 h chacune avec du PBS 1 x ; à ce stade, la cochlée est détartrée.
  • Stockage
    1. Stocker le limaçon pendant 72 h dans une anti-anti, 10 % plume strep-solution à 10 % dans du PBS à 4 ° C.
      Remarque : Les plus longues périodes de stockage peuvent être possibles avec des changements réguliers de solution antibiotique ; Toutefois, un stockage prolongé de limaçon transformés n’a pas été validé dans le présent protocole.

    • 3. achats et l’Expansion des hWJCs

    1. Isoler les hWJCs selon les protocoles publiés antérieurement22. En bref, les cordons ombilicaux segment en sections de 3 cm.
    2. Faites une incision peu profonde avec un scalpel dans la longueur sur chaque segment du cordon ombilical de dérouler et d’exposer la gelée de Wharton du cordon ombilical. Forceps permet de supprimer les vaisseaux sanguins.
    3. Laver les segments de cordon ombilical deux fois avec assez de PBS (p. ex., 40 mL dans une boîte de Pétri de 60 mm) pour submerger le tissu. Finement hacher des segments de tissus avec un scalpel. Digérer le tissu dans une boîte de Pétri avec 50 mL de milieu de digestion de 100 mm (collagénase de type 2 de 0,2 %, 1 % la pénicilline-streptomycine, en basse-glucose moyen (DMEM d’aigle modifié de Dulbecco)).
    4. Placer le tissu en digérant moyen dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant la nuit dans un 5 % CO2, incubateur de 37 ° C. Le lendemain, diluer milieu de digestion à un ratio de 01:16 dans 2 % antibiotique-antimycosiques dans du PBS et cellules de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pour 10 min. jetez surnageant.
    5. Remettre en suspension les boulettes dans le cellules souches mésenchymateuses croissance moyen (MSCGM) et recombiner des cellules. Cellules de la plaque à une densité de 7 x 103 cellules/cm2 en culture de tissus traitement flacons T-75. HWJCs en MSCGM de la culture et étendre au passage 5 pour des expériences.
      Remarque : HWJCs peut être Sub cultivées dans plus grands T-fioles (p. ex., T-150, T-300) lors de passage pour augmenter le rendement des hWJCs pour des expériences.

    4. l’injection de hWJCs dans Decellularized limaçon

    1. Préparer le limaçon DECELLULARISE
      1. À l’aide d’une technique aseptique, laver limaçon stockées dans du PBS 1 x trois fois pour chaque 30 min.
      2. Transférer le limaçon dans puits séparés d’une plaque 24 puits et ajouter 1 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM.
      3. Incuber le limaçon dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire pendant au moins 1 h avant l’injection de cellules.
    2. Dissocier hWJCs et remettre en suspension
      1. HWJCs de lavage avec 37 ° C préchauffé solution 1 PBS x deux fois.
      2. Ajouter suffisamment 37 ° C préchauffé trypsine avec EDTA 0,5 % pour couvrir la surface du navire cellulaire.
      3. Incuber les hWJCs jusqu'à 5 min dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire.
        1. Vérifiez que 90 % des cellules ont détaché de la surface de culture cellulaire en affichant des cellules sous un microscope inversé.
          Remarque : Les cellules qui se déplacent lorsque le récipient de culture est tapoté doucement, ont détaché. Les cellules qui restent fixes, n’ont pas détaché.
        2. Tapoter légèrement les côtés du ballon pour déloger davantage les cellules attachées.
      4. À l’aide d’une technique aseptique, transfert hWJCs du récipient de culture dans un tube conique de 50 mL contenant un volume équivalent de MSCGM pour le volume de la trypsine permettant de dissocier les cellules.
      5. Le hWJCs de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pendant 5 min.
      6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les hWJCs en MSCGM à une concentration de 500 000 cellules/mL.
    3. Perfuse limaçon
      1. Limaçon de transfert à une nouvelle plaque 24 puits à l’aide d’une pipette de transfert.
      2. Ajouter une goutte de MSCGM à chaque cochlée afin d’empêcher toute cochlée ne se dessèchent pas.
      3. Délicatement, orienter la cochlée avec une pincette ultra fines pour que la fenêtre ovale et ronde pointent vers le haut.
        Remarque : Faire extrêmement attention lorsque vous manipulez directement chaque cochlée comme la cochlée est facilement endommagée.
      4. À l’aide d’une seringue stérile calibre 28,5 insuline avec tuyau connecté, établir 0,2 mL resuspendue hWJCs (100 000 cellules).
      5. À l’aide de pinces fines stérilisé, positionner le tube au-dessus de la fenêtre ovale.
      6. Lentement et délicatement perfuse la cochlée avec 0,2 mL de hWJCs remises en suspension à l’aide d’une seringue à insuline 28,5-Manomètre reliée au tuyau de polyéthylène (diamètre extérieur : 0,61 mm, diamètre intérieur : 0,28 mm) pendant environ 5 min.
      7. Après la perfusion, ajouter 0,8 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM dans la cupule contenant la cochlée pour porter le volume total dans le puits à 1 mL.
      8. Répétez les étapes 4.3.3-4.3.7 pour chaque cochlée, à l’aide d’une seringue fraîche et tube à chaque fois.
      9. Place perfusés limaçon dans un 5 % de CO2et 37 ° C incubateur de culture cellulaire changement médias trois fois par semaine.

    5. préservation et la récolte de la cochlée

    NOTE : Limaçon peut-être être cultivés et récoltés à n’importe quel point du temps de perfusion après de jusqu'à 30 jours.

    1. Afin de préserver le limaçon, difficulté à la paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C sur une plate-forme bascule.
    2. Après fixation, laver le limaçon avec du PBS 1 x trois fois de 5 min chacun.
    3. Peu à peu déshydrater la cochlée avec de l’éthanol et clair avec un solvant hydrocarbure aliphatique avant l’intégration à la paraffine.
    4. Section des échantillons jusqu'à une épaisseur de 10 µm à l’aide d’un microtome et monter sur lames de microscope de verre.
      Remarque : Les échantillons sont maintenant prêts à histologique ou immunohistochimique de traitement à l’aide de protocoles standard.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    En utilisant les méthodes présentées ici, DÉCELLULARISATION réussie du limaçon a été évaluée en examinant la présence ou l’absence de l’ADN à travers 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Limaçon était considérés comme pleinement DECELLULARISE si l’ADN n’a pas été identifié dans la cochlée DECELLULARISE. Une cochlée native d’une expérience antérieure qui n’a pas subi de DÉCELLULARISATION ou décalcification a été utilisée comme témoin positif pour illustrer les structures et le...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nous avons démontré avec succès que des cellules cochléaires natifs peuvent être retirés de la cochlée via un processus DÉCELLULARISATION, qui permet l’utilisation de la cochlée comme un échafaudage de tissu complexe, en trois dimensions. Santi et al. 15 mis au point la méthode initiale pour decellularizing limaçon et ont réussi à estimer les volumes de nombreuses structures cochléaires grâce à l’aide d’une nappe de lumière microscopie23. Ce premiers travaux a serv...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Le projet actuel a été financé par la preuve de l’Université du Kansas de fonds Concept. Nous tenons à remercier le personnel soignant à KUMC (Kansas City, KS) pour nous aider à obtenir des humains des cordons ombilicaux et David Jorgensen pour aider avec les cultures de limaçon.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrifugeuse Allegra X-14RBeckman-CoulterB08861
    Tube semi-rigide intramédicalBecton Dickinson427401
    Nouveau-Brunswick Innova 2000 Orbital ShalerEppendorfM1190-0002
    Ciseaux chirurgicauxOutils de science fine14060-10
    Pince fineOutils de science fine11370-40
    Pince ultra-fineFine Science Tools18155-13
    Tubes coniques de 50 mlFisher Scientific12565271 Boîte de
    PétriFisher ScientificFB087579B
    Seringue à insuline U-100Fisher Scientific14-829-1B
    Flacon à scintillationFisher Scientific03-341-73
    RotateurFisher Scientific88-861-049
    Pipette de transfertFisher Scientific22-170-404
    Lame de rasoirFisher Scientific12-640
    Antibiotique-antimycosiqueFisher Scientific15-240-062
    Pénicilline-streptomycineFisher Scientific15-140-122
    Plaqueà 24 puitsFisher Scientific07-200-84
    SuperFrost PLUS Lames de microscope en verreFisher Scientific12-550-15
    Pipette de transfertFisher Scientific22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPIFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Incubateur CO2Fisher Scientific13-998-078
    Milieu de croissance de cellules souches mésenchymateusesLonzaPT-3001
    Trypsine-EDTALonzaCC-3232
    Flacon de culture TPP T-75MidSciTP90076
    Flacon de culture TPP T-150MidSciTP90151
    Flacon de culture TPP T-300deMidSci
    Nikon InstrumentsSMZ800
    Microscope inversé Nikon Eclipse Ts2R-FLInstrumentsMFA51010
    NuAire Classe II, Type A2 Armoire de biosécuritéNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    1 % FDS SolutionSigma-Aldrich436143-100G
    10 % EDTASigma-AldrichE9884-100G
    Microscope dissection TP90301 Nikon

    References

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