ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

Résumé

Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.

Résumé

Méthodes de coloration de l’ADN sont très importants pour la recherche biomédicale. Nous avons conçu une méthode simple qui permet la visualisation de l’ADN à le œil nu par la formation d’un précipité de couleur. Il fonctionne en trempant l’acrylamide ou de gel agarose de l’ADN dans une solution de 1 x (équivalent à 2,0 µM) SYBR Green I (SG j’ai) et 0,20 mM nitrobleu de tétrazolium qui produit un violet précipiter de formazan lorsqu’ils sont exposés aux rayons du soleil ou plus précisément la lumière bleue. Aussi, récupération des tests ADN ont été effectuées en utilisant un plasmide ampicillin résistant dans un gel teinté avec notre méthode. Un plus grand nombre de colonies a été obtenu avec notre méthode qu’avec la traditionnelle coloration à l’aide de SG j’ai avec éclairage ultraviolet. La méthode décrite est rapide, précis et non toxique pour la détection de l’ADN, ce qui permet la visualisation des biomolécules à « l’oeil nu » sans un Transilluminateur et est peu coûteux et approprié pour l’utilisation sur le terrain. Pour ces raisons, notre ADN nouvelle coloration méthode a ses avantages potentiels pour la recherche et l’industrie.

Introduction

Avec les progrès de la biochimie et de biologie moléculaire, les études portant sur l’ADN ont exigé des meilleures techniques pour analyser l’ADN. La première méthode pour la coloration de l’ADN a été de coloration, qui est très sensible mais manque de sélectivité à l’argent et ne permet pas la récupération de l’échantillon. Plus tard, le développement de coloration fluorescente d’ADN a permis la quantification sélective de l’ADN avec la possibilité de récupération de l’échantillon. L’un des colorants fluorescents premières utilisées pour la quantification de l’ADN de bromure d’éthidium¹, ce qui est mutagène². Cependant, maintenant il y a des colorants fluorescents améliorés plus sécuritaires et plus sensibles, tels que GelRed et SYBR Green I (SG je)³; mais tous ces colorants fluorescents nécessitent l’utilisation d’un Transilluminateur UV de (UV) ou d’un fluorimètre.

Il existe des autres techniques de coloration visiblement ADN, tels que le bleu de méthylène⁴ et cristal violet^5,6,7,8,9, mais tous d'entre eux souffrent de sensibilité réduite et sélectivité. Les sels de tétrazolium sont sensibles à la réduction des composés organiques et lorsque cela se produit, ils forment un insoluble et coloré de formazan précipiter^10,11. Récemment, certains sels de tétrazolium bivalents ont démontré à lier à l’ADN en raison de leurs anneaux de tétrazolium positive¹².

Dans une récente publication¹³a proposé une nouvelle technique visible pour souiller et de quantifier l’ADN en gels de polyacrylamide, en utilisant la réduction d’un sel de tétrazolium bivalent appelé nitrobleu de tétrazolium (NBT) et des colorants fluorescents comme le bromure d’éthidium, GelRed, SYBR Green I et SYBR Gold. Cette réaction a travaillé en présence de lumière bleue ou la lumière du soleil et a permis la récupération de l’échantillon en améliorant la qualité par rapport à l’usage du SG j’ai avec un Transilluminateur UV. L’objectif du présent document est de fournir un protocole détaillé de la technique de coloration à l’aide de tétrazolium sels.

Protocole

1. préparation et exécution du Gel

1. Préparer les gels de polyacrylamide gel de 12 % non-dénaturisation à l’aide de la recette de Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel électrophorèse (SDS-PAGE) trouvé dans Sambrook et Russell¹⁴ mais avec de l’eau au lieu de SDS.
   1. Pour préparer 5 mL de solution de gel, utiliser 1,7 mL d’eau distillée, 2 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED.
   2. Pour préparer 2 mL de gel de concentration utiliser 1,5 mL d’eau, 0,33 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED. Les dimensions du gel sont 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x l x p).
      Remarque : Utilisez un peigne bien 15 de 0,75 mm d’épaisseur pour la meilleure sensibilité.
2. Verser les quantités appropriées de 6 x chargement mémoire tampon et l’échantillon d’ADN d’un tube de microtubes de 1,5 mL (par ex. utilisation 1 µL de tampon de charge 6 x à 5 µL de l’échantillon d’ADN).
3. Placer le gel dans la chambre d’électrophorèse verticale.
   1. Remplir la chambre avec 750 mL de tampon de x TAE 1 pour exécuter 2 gels. Pour préparer 1 L de 50 x TAE, utilisez 442 g de base Tris, 57,1 mL d’acide acétique glacial et 100 mL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajouter de l’eau distillée pour un volume final de 1 L.
   2. Charger les échantillons dans le gel. Exécutez le gel à 100 V pendant 2 h.
4. Vous pouvez également préparer un gel d’agarose 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook¹⁴.
   1. Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Exécutez le gel pendant 45 min à 100 V.

2. NBT-SG j’ai coloration (Figure 1).

1. L’acrylamide Gel de coloration.
   1. Préparer les solutions : 0,1 % p/v NBT et 1,2 x SG j’ai.
      Remarque : Il est possible d’utiliser du bromure d’éthidium, GelRed et SYBR Gold au lieu de SG j’ai, mais SG j’ai eu les meilleures performances.
   2. Verser 16,75 mL de 1,2 x SYBR vert I solution dans un récipient de taille appropriée.
      Remarque : Nous avons utilisé le couvercle d’une boîte de pointe de pipette en tant que conteneur, et ces volumes sont calculés pour couvrir le gel à l’aide de ce conteneur ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p).
   3. Placer le gel dans la solution. Ajouter 3,25 mL de solution à 0,1 % p/v NBT pour donner 0,2 mM NBT et 1 x (équivalent à 2,0 µM) SG j’ai concentrations finales.
   4. Fermer le récipient avec un film plastique et enrouler complètement le récipient avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante.
      Remarque : Le film plastique est utilisé pour éviter les éclaboussures et pour éviter une réaction de la feuille d’aluminium avec la solution colorante.
   5. Agiter pendant 25 min dans un agitateur orbital à 60 tr/min.
   6. Enlever en aluminium et en plastique. Exposer au soleil pendant 90 min maximum. Vérifiez toutes les 5 min jusqu'à ce que la bande d’intérêt s’affiche.
   7. Pour utiliser la lumière bleue, préparer une protoboard avec 3 Diodes électroluminescentes (LED) et placer les LEDs 5 mm environ de la surface du gel (cocher la coloration en continu, comme le temps nécessaire dépend de l’intensité de la source lumineuse de LED).
2. Gel d’agarose souillant.
   1. Après préparation et en cours d’exécution une agarose à 1 % gel comme décrit dans les sections 1.4 (les dimensions sont de 1 cm x 6,2 cm x 7 cm ; l x l x p), suivez les mêmes étapes que dans 2.1 avec ces modifications :
   2. Verser 41,9 mL de 1,2 x SG j’ai la solution dans le couvercle d’une boîte de pointe de pipette ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p). Ajouter 8,1 mL de solution à 0,1 % NBT.
   3. Fermer le récipient avec un film plastique et puis complètement envelopper le contenant avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante.
   4. Agiter pendant 1 h dans un agitateur orbital à 60 tr/min.

3. analyse.

1. NBT-SG j’ai des courbes d’étalonnage.
   1. Obtenir des images de gel par balayage à 1200 dpi.
   2. Logiciels pour l’analyse de l’image. Redresser les images à l’aide d’un éditeur d’image. Exécutez une densitométrie d’image.
   3. Calculer l’aire sous la courbe. Préparer un graphique du Signal/Signal_Max contre la concentration de l’ADN.

4. ADN récupération.

1. Préparer un gel d’agarose de 1 % à 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook¹⁴.
2. Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Charger 4 µL de 100 plasmide de¹⁵ ng/µL pDJ100 et échelle d’ADN suivant le schéma donné à la Figure 2. Exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.
3. Marquer et peser les deux tubes de microcentrifuge de 2 mL.
4. Coupent le gel par le milieu afin d’avoir les deux moitiés identiques. Chacun d’eux doit contenir l’échelle et le plasmide d’échantillon pour comparer les différentes techniques de coloration. Une représentation schématique est à la Figure 2.
5. Colorer une moitié avec NBT-SG j’ai comme dans l’étape 2.
   1. Découpez la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre. Enregistrer le morceau de gel dans un tube et peser.
6. Tache de l’autre partie du gel avec SG j’ai avec 50 mL de 1 x SG j’ai solution et lentement agiter (60 t/mn) le gel pendant 1 h dans l’obscurité.
   1. Placer le gel sur une courte longueur d’onde et exposer pendant 2 min. coupe sur la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre.
   2. Enregistrer le morceau de gel dans l’autre tube et peser.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici tout en gardant les tubes à-20 ° C.
7. Procéder à l’extraction de plasmide utilisant un commercial gel extraction kit.

5. plasmide normalisation.

1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 10 µL de l’extrait plasmide et 60 µL d’eau de type I. Mélanger et transférer dans une cuvette de quartz 60 µL ou utiliser 2 µL directement dans un Nanodrop.
2. Mesurer les spectres d’absorption entre 230 à 320 nm. Calculer la concentration de plasmide de l’échantillon à l’aide de la formule suivante :
   
   où D est le facteur de dilution (dans ce cas, c’est 70/10), A_x est l’absorption à x nm et 50 est le facteur de conversion en µg/mL pour le dsDNA.
3. Diluer les échantillons à 9,1 ng/µL.
4. Transformer des cellules capables d' Escherichia coli (e. coli) (p. ex. XL10 or) suivant la Inoue transformation procédure¹⁶ avec 5 µL de l’échantillon dilué.
5. Compter le nombre de colonies sur les boîtes de Pétri et notez la dilution. Calculer les unités formant colonie (UFC) avec la formule suivante¹⁷:
   
   où D est le facteur de dilution appliqué de la culture initiale.
6. Effectuer un test t non apparié.

Résultats

Un précipité de formazan violets s’affiche où se trouve l’ADN (vérifié par spectrométrie de masse ๳). Dans l’expérience, une échelle d’ADN a été chargée pour faire une courbe d’étalonnage (Figure 3). Le protocole fonctionne pour les gels d’acrylamide et de gel d’agarose, mais il a une plus faible intensité et prend plus de temps dans l’agarose. Cependant, l’utilisation de gels d’agarose permet la récupération de l’échantillon à l’aid...

Discussion

Un sensible et un roman basé sur l’ADN, méthode de coloration sur la réduction de NBT et l’utilisation de SG j’ai présenté dans cet article. L’étape critique dans le présent protocole est le temps d’incubation du gel dans le NBT-SG j’ai solution et la concentration de NBT. Le temps de coloration pour les gels d’agarose est plus long que pour les gels d’acrylamide en raison de la plus grande épaisseur de gels d’agarose. Cette méthode ne fonctionne pas bien en présence de SDS comme NBT précipite en contact avec elle. Si le...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nitro blue tétrazolium	Gold Biotechnology	298-83-9	réactif utilisé dans la coloration
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	réactif utilisé dans la coloration
Kit d’extraction de gel	QIAGEN	28704	utilisé pour extraire le plasmide du gel dans le test d’intégrité
Échelle d’ADN	Thermo-Fisher	SM 1331	utilisé pour faire des courbes d’étalonnage et comme référence pour couper la bande dans le test d’intégrité
Agar Agar Merck			utilisé pour fabriquer des plaques de culture LB-ampicilline  ;
chlorure de sodium	Merck	1064045000	utilisé pour fabriquer des plaques de culture de LB-ampicilline.
extrait de levure	Becton, Dickinson and Company	212750	utilisé pour fabriquer des plaques de culture d’ampicilline LB  ;
peptone	Merck	72161000	utilisé pour fabriquer des plaques de culture d’ampicilline LB  ;
TEMED	AMRESCO	761	utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide
persulfate d’ammonium	Calbiochem	2310	utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide
acrylamide	invitrogen	15512-023	utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide bisacrylamide
	SIGMA	146072	utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide
Tris-base	Merck	1083821000	utilisé pour fabriquer un tampon TAE et un tampon tris-HCl de gel de polyacrylamide non dénaturant
EDTA	J.T. Baker	8993-01	utilisé pour fabriquer un tampon TAE
Acide acétique	Merck	1 000 632 500	utilisé pour fabriquer un tampon TAE
agarose	Merck	16802	utilisé pour fabriquer
spectrophotomètre	Tecan	infinite 200 pro	utilisé pour quantifier le plasmide
d’ADNunité de purification d’eau	Merck	Elix 100	utilisée pour fabriquer de l’eau de type 1 (ASTM) utilisée en spectrophotométrie et en dilutions
d’ADN° eau			utilisée dans les gels, les milieux de culture, les colorations et les solutions générales
HCl	J.T. Baker	9535-03	utilisé pour fabriquer un tampon tris-HCl de gel de polyacrylamide non dénaturant
Colorant de chargement d’ADN 6X Thermo-Fisher		R0610
bleue de 5 mm	Jinyuan electronics	SP-021	utilisée dans le protoboard de test d’intégrité
	Support de source lumineuse et circuit	KANDH	KH102
Pile 9 V	Duracell-utilisée		pour alimenter la
chambre d’électrophorèse horizontale	Biorad	1704486EDU	utilisée pour fabriquer et exécuter du gel d’agarose en essai d’intégrité,
kit d’électrophorèse verticale	Biorad	1658002EDU,	utilisé pour faire fonctionner des gels de polyacrylamide dans les courbes d’étalonnage,
alimentation	Biorad	1645050  ;	utilisé pour alimenter l’électrophorèse