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Article de méthode

Un modèle murin de gastrectomie verticale

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DOI :

10.3791/56534

⸱

18 décembre 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

Dans cet article

Résumé

La section suivante décrit les performances de gastrectomie verticale chez les souris. Il s’agit d’un type de chirurgie de perte de poids qui implique le retrait d’environ 70 % de l’estomac.

Résumé

La chirurgie bariatrique, comme la gastrectomie verticale (VSG), est une intervention chirurgicale du tube digestif qui est effectuée dans le but de perdre du poids. La chirurgie bariatrique est actuellement le traitement le plus efficace à long terme de l’obésité. En plus de la perte de poids, la chirurgie bariatrique produit des bienfaits supplémentaires comme la remise de la rémission de l’hypertension artérielle, diabète de type 2 et diminue le risque de développer certains types de cancer. Les mécanismes au-delà de la perte de poids pour ces prestations restent incomplètement. Par conséquent, les modèles animaux de la chirurgie bariatrique soient développées et validées pour identifier les mécanismes qui conduisent à ces avantages, dans le but d’améliorer la compréhension de la physiologie digestive et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Générateur de signaux vectoriels est devenue la procédure bariatrique plus couramment pratiquée à la clinique aux États-Unis parce que c’est très efficace dans la production de perte de poids et l’amélioration métabolique et est plus simple à réaliser que les autres procédures bariatriques. Par conséquent, nous avons développé et validé un modèle murin de VSG. Ce modèle murin de VSG reprend bon nombre des effets de VSG vu chez l’homme, y compris la réglementation améliorée de glucose et de la pression artérielle. La méthode repose sur l’isolement de l’estomac, la ligature des vaisseaux gastrique et l’enlèvement des 70 % de l’estomac en sectionnant le long de la grande courbure de l’estomac. Nous avons appliqué avec succès ce protocole chirurgical de diverses lignées de souris génétiquement modifiés pour définir les contributeurs mécanistes aux avantages de la VSG. En outre, ce modèle murin de VSG a été combiné avec d’autres techniques chirurgicales, pour atteindre une connaissance mécaniste. Par conséquent, il s’agit d’un modèle simple et versatile pour étudier la physiologie digestive et les bienfaits de la chirurgie bariatrique.

Introduction

Comme l’épidémie d’obésité continue de croître dans le monde entier la chirurgie bariatrique a gagné en popularité comme c’est le traitement le plus efficace à long terme pour l’obésité1. Malheureusement, la perte de poids par l’alimentation et l’exercice est difficile à réaliser et relativement inefficace sur le long terme2,3. La chirurgie bariatrique, comme la gastrectomie verticale (VSG), est définie comme la manipulation de l’appareil gastro-intestinal dans le but de perte de poids1,4. Bien que la perte de poids est un résultat important de la chirurgie bariatrique, chirurgie bariatrique fournit d’autres avantages de santé comme l’amélioration des comorbidités de l’obésité et prolongeant la durée de vie5. Par exemple, la chirurgie bariatrique entraîne des taux élevés de rémission de diabète de type 2 et l’hypertension et réduction du risque de durée de vie du développement de certains types de cancer1,6,7. À noter l’effet de la chirurgie bariatrique causant la rémission de l’hypertension et de diabète de type 2 est souvent observé peu de temps après la chirurgie et avant la perte de poids8,9. Cela met en évidence la notion qu’il existe des mécanismes indépendants de poids corporel qui contribuent aux bienfaits observés après la chirurgie. Des modèles animaux de la chirurgie bariatrique ont été développés et sont utilisées pour étudier les mécanismes par lesquels ces bienfaits pour la santé produisent10,11,12.

Nous avons validé un modèle murin de VSG, dont nous avons appliqué à divers modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier les mécanismes par lesquels la chirurgie bariatrique améliore comorbidités l’obésité comme le diabète de type 2, d’hypertension et de cancer colorectal10 , 11 , 12. les modèles de rongeurs permettent contrôle plus expérimental et la possibilité d’effectuer des manipulations génétiques ou pharmaceutique pour définir le rôle des gènes spécifiques ou des voies de signalisation d’intérêt. Nous nous concentrons principalement sur VSG VSG étant la procédure bariatrique plus couramment pratiquée à la clinique dans les États-Unis13. En outre, VSG est un modèle chirurgical simple avec des modifications anatomiques moins par rapport à d’autres procédures telles que détournement de dérivation ou de dérivation biliopancréatique gastrique Roux-en-Y.

Notre modèle de souris de VSG récapitule les effets d’une chirurgie bariatrique observées chez les humains : perte de poids, la prise alimentaire réduite, régulation du glucose améliorée, amélioration de la fonction de l’îlot, a augmenté la sécrétion postprandiale le glucagon-like peptide-1 (GLP-1), réduit la tension artérielle et augmentation circulant acides biliaires des concentrations10,11,12,13,14,15. Par conséquent, il s’agit d’un modèle idéal pour étudier les corps poids dépendantes et indépendantes mécanismes par lesquels VSG améliore ou résout des comorbidités de l’obésité. En outre, c’est un modèle fiable qui peut être combiné avec d’autres interventions chirurgicales, permettant la recherche sur l’impact du VSG dans diverses conditions de maladie avec une plus grande perspicacité mécaniste12.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de l’emploi et de Cornell University Institutional Animal Care.

1. préparation pré-chirurgicale

NOTE : Souris de l’étude sont généralement sur un fond obèse C57BL induite par la diète de mener des études translationnelle pertinent à l’obésité humaine et résistance à l’insuline. Des souris mâles et femelles peuvent être étudiées comme décrit dans les étapes ultérieures.

  1. À l’âge de 2 mois, placer la souris sur un régime riche en graisses 45 % ou 60 % pendant 2 mois (voir Table des matières).
    Remarque : Les souris sont alimentés un régime riche en graisses pour créer un phénotype obèse et résistants à l’insuline. Des périodes plus courtes ou plus longues de l’alimentation de régime riche en graisses peuvent être utilisées selon les objectifs de l’étude.
  2. Continuer à alimenter la souris ad libitum jusqu'à ce que la chirurgie. Si des mesures de base sont nécessaires, après que 7 semaines de haute teneur en graisses diététiques alimentation, rapide souris pendant 6 h ou durant la nuit et prendre un échantillon de sang de base pour la mesure des métabolites d’intérêt (par exemple, le glucose).
  3. Continuer la souris sur la haute teneur en graisses diététiques et autoriser les souris une semaine pour récupérer après le prélèvement de sang avant la chirurgie de l’imposture ou VSG. Placez la souris sur un liquide diète (voir Table des matières) pour 4 jours avant la chirurgie.
    NOTE : Souris sont soumis à une diète liquide avant et après la chirurgie pour dégager le tube digestif des particules qui peuvent altérer la réponse de guérison.
  4. Stériliser les points suivants avant la chirurgie : clinquant, gaze, coton à bout des applicateurs (DEC) et les instruments chirurgicaux (pince hémostatique, ciseaux, ciseaux de l’iris, instrument de dumont, de fonctionnement dentelé instrument Adson-Brown, aiguille de gavage, pilote de micro aiguille, ciseaux de printemps ).

2. verticale gastrectomie et procédures Sham

  1. Le jour de la chirurgie peser la souris afin d’obtenir une mesure de poids de base.
  2. Équiper la salle chirurgicale avec un bain d’eau chauffée et système d’anesthésie, coussin chauffant. Mettre au bain-marie à 37 ° C et utilisez-le pour réchauffer des 0,9 % solution saline pour l’irrigation. Nettoyer le champ chirurgical avec l’éthanol à 70 % et utiliser une technique stérile pour ouvrir outils et pack de chirurgie autoclavés.
    Remarque : Le coussin chauffant est utilisé pour maintenir l’animal au chaud pendant la chirurgie et de l’anesthésie.
  3. À l’aide d’une chambre à induction, anesthésier la souris avec 5 % isoflurane et O2 débit de 1 L/min. Vérifiez que la souris est dans le plan approprié de l’anesthésie en effectuant une pincée d’orteil. Maintenir la souris avec l’isoflurane 1 à 3 % et un débit de2 O de 0,6 L/min une fois un plan cohérent de l’anesthésie a été atteint.
  4. Une fois que la souris est anesthésiée, placez la pommade ophtalmique (voir Table des matières) sur ses yeux pour les garder humides pendant la chirurgie. À cette époque également administrer un analgésique, comme meloxicam (2 mg/kg par voie sous-cutanée). Couper les cheveux de l’ombilic à l’aisselle maintenez doucement la peau pour fournir la tension.
    1. Comme la peau de la souris est fine et délicate, prendre soin ne provoque des lésions de la peau lorsque tondre le cheveux. Nettoyer la peau avec la povidone-iode et d’alcool.
    2. Enfiler des gants stériles et préparent le champ opératoire stérile et instruments. Effectuer le reste de la procédure en utilisant une technique stérile. Préparer le champ opératoire stérile en plaçant des draps chirurgicaux stériles de chaque côté de la souris. Feuille d’étain autoclavée permet de créer un drapé chirurgical pour la souris.
    3. Découper un petit trou dans le papier d’aluminium pour permettre l’accès dans l’abdomen de la souris.
  5. Faire une incision de la peau depuis le milieu de l’abdomen (ombilic) au niveau du cartilage xiphoid à l’aide d’un ciseau de l’iris. Identifier la linea alba et utilisation iris ciseaux pour couper à travers la paroi du corps le long de la linea alba. ETG permet d’élever doucement l’estomac hors de l’abdomen et puis carrément disséquer l’épiploon grandes hors de la grande courbure de l’estomac.
  6. Ligaturer l’artère gastrique courte qui s’étend entre le fundus de l’estomac et la rate en plaçant deux ligatures à l’aide d’une suture résorbable monofilament 7-0. Utiliser des ciseaux de printemps pour couper entre les deux ligatures. Une fois que l’artère est traversée, entièrement extérioriser l’estomac dans la cavité abdominale. Placez la gaze dans l’estomac et humide avec du sérum physiologique pour garder le tissu humide.
  7. Intervention factice
    1. Pour l’intervention factice, placer un motif continu simple lâche de suture résorbable de monofilament 6-0 grâce à une aiguille conique. Commencer 2 mm vers la droite (droite du chirurgien) de l’oesophage. Placez la ligne de suture le long de la paroi gastrique ventrale et continuez le long de la paroi gastrique dorsale.
      Remarque : Pour toutes les manipulations gastriques, utilisez uniquement une suture résorbable monofilament pour diminuer le risque d’infection. En outre, utiliser seulement de suture avec une aiguille conique pour toutes les manipulations gastriques, comme l’utilisation d’une aiguille de coupe augmente le risque de suture « jeté » menant aux dommages de tissu gastrique et une déhiscence de plaie.
    2. Passer l’aiguille complètement à travers une paroi gastrique en plaçant la suture. Assurez-vous que la suture est plat, mais ne limitant ne pas l’estomac. Doucement, attacher la suture désactivées à l’aide de 3-4 lancers et passez à l’étape 2,9.
    3. Pour la procédure VSG, sautez l’étape 2.7 et passez à l’étape 2.8.
  8. Procédure VSG
    1. Pour la procédure VSG, ligaturer les branches importantes de l’artère gastrique et la veine avec 7-0 résorbable monofilament avec une aiguille conique à l’aide de 3 lève pour chaque noeud. Placez les ligatures juste en dessous (c'est-à-direvers la petite courbure de l’estomac), la ligne de transection.
      Remarque : La ligne de transection commence à environ 2 mm au-dessus (sens vers la grande courbure de l’estomac) l’encoche cardiaque de l’estomac et au moins 2 mm en dessous de la pilcatus de margo et s’étend à l’extrémité proximale du lobe droit du pancréas. En général, il y a 4 vaisseaux par la paroi gastrique qui doivent être ligaturé ; Toutefois, cela peut varier entre souris.
    2. Pour éviter toute fuite du contenu gastrique au cours de la gastrectomie, placez une simple ligne de suture passant par ces deux parois gastriques juste en dessous de la ligne de transection utilisant une suture résorbable monofilament 6-0 avec une aiguille conique continue. Commencer la ligne de suture à droite du chirurgien de l’oesophage et en dessous le margo pilcatus et la fin juste au dessus du pancréas.
    3. Posez hémostatique à pointe mince au-dessus de la ligne de suture et printemps ciseaux pour couper entre la ligne de suture et une pince hémostatique. Retirez le tissu gastrique percement du champ opératoire stérile.
DEC permet de nettoyer le sang et digesta hors de l’estomac.
  • Renforcer l’apposition des parois gastriques à l’aide de suture résorbable de monofilament 6-0 avec une aiguille conique à l’aide d’un simple modèle discontinu.
    Remarque : Un modèle simple suture discontinus est recommandé car cela permet une fermeture plus sûre que le modèle simple suture continue.
  • Rincer le vestige gastrique avec une solution saline dans l’ensemble de la procédure afin de maintenir le tissu humide et propre. Utiliser une aiguille de gavage de 20G attachée à une seringue de 20 mL pour effectuer un lavage gastrique avec une solution saline. Cette taille permet d’assurer une pression adéquate est fournie sans risquer des dommages de tissu gastrique d’une pression excessive ou dommages accidentels tissu gastrique de l’utilisation d’une aiguille pointue ordinaire.
  • Utiliser un minimum de 20 noeuds pour fermer solidement l’estomac ; Faites attention à la fermeture le long du côté de l’oesophage, car ce côté est plus difficile d’accès et est donc souvent un site de déhiscence.
  • S’assurer qu’il n’y a pas de fuite en pressant doucement sur le ventre avec l’ETG. Si les fuites sont détectées, placer les nœuds discontinues simples supplémentaires sur les zones de fuites et test de fuite puis à nouveau. Essai d’étanchéité jusqu'à ce qu’aucune fuite n’est détecté.
  • Faire un lavage complet final de l’estomac à l’aide d’au moins 60 mL de solution saline pour s’assurer qu’aucune matière particulaire infectieuse n’a été laissée.
  • Replacer l’estomac dans la cavité abdominale sous le foie à l’aide d’une DEC. Placez des DEC le long de la face dorsale de la cavité abdominale pour absorber tous les excès de liquide. À l’aide d’une aiguille 18G émoussée, injecter une solution de Ringer amorcez (LRS) avec ou sans antibiotiques (0,5 mL LRS +/-20 mg/kg enrofloxacine) directement dans la cavité abdominale, juste avant la fermeture.
    Remarque : Cela remplace la perte liquidienne expérimentés pendant la chirurgie et fournit une méthode pour l’application directe des antibiotiques au site de la chirurgie aider à la récupération.
  • Fermer la couche de muscles abdominaux à l’aide de suture résorbable de monofilament 6-0 avec une aiguille conique dans un simple modèle discontinu. Puis fermez la couche de peau avec suture résorbable de monofilament de 6-0 dans un motif continu simple.
  • Placer l’adhésif de tissu sur la peau et replier la peau sur la ligne de suture d’enterrer la suture pour que la souris ne peut pas perturber la fermeture de la plaie après l’opération.
  • Éteignez l’isoflurane et laisse la souris à récupérer sur le coussin chauffant pour 10-15 minbefore remettre dans sa cage maison. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris conscience et est capable de se déplacer.
  • Garder les animaux hébergés séparément jusqu'à ce que complètement remis de la chirurgie.
    Remarque : Si les mesures de l’apport alimentaire précis doivent être obtenus tout au long de l’étude, souris devraient continuer à être logés individuellement tout au long de l’étude. Il y a un risque d’obstruction de corps étranger de manger literie maison cage. Animaux doit être logés dans des cages sans literie à l’exception des matériaux permettant l’enrichissement de nidification (voir Table des matières).

    • 3. mesures et la souris post-opératoire soins

    1. Retourner la souris à sa cage maison et placer la cage sur un coussin chauffant. Maintenir la souris sur une diète liquide pendant au moins 7 jours après la chirurgie. Administrer un analgésique, comme meloxicam (2 mg/kg par voie sous-cutanée), pendant 2 jours après la chirurgie.
      Remarque : Un antibiotique, comme enrofloxacine (20 mg/kg), peut être donné jusqu'à 7 jours après la chirurgie. Antibiotiques sont donnés afin de minimiser les risques d’infection par l’intervention chirurgicale et peuvent ou ne peuvent être exigés selon le taux de stérilité maintenu tout au long de la procédure. Toutefois, si les antibiotiques sont utilisés, ils doivent être administrés à toutes les souris dans la même étude pour maintenir la cohérence.
    2. Au cours de la période post-opératoire évaluer le poids corporel, la prise alimentaire, défécation, niveau d’activité et la destruction au moins tous les jours pour assurer la bonne guérison et la récupération. Effectuer une surveillance post-opératoire pendant 14 jours après la chirurgie.
      NOTE : Échec chirurgical est généralement vu immédiatement après l’intervention ou dans les trois jours après per-opératoire. Les animaux qui ne sont pas manger ou boire le deuxième jour après la chirurgie doivent être étroitement surveillés complications chirurgicales.
    3. Après avoir complété avec succès la période post-opératoire, mesurer la prise de poids et de l’alimentation corps régulièrement tout au long de l’étude pour assurer la maintenance du phénotype approprié.
    4. Effectuer une épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) afin d’évaluer la tolérance au glucose, la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose et vider la sécrétion de l’hormone.
      1. Effectuer la HGPO chez la souris après avoir jeûné pour 6 h et puis souris gavage avec une solution de dextrose de 50 % à une dose de 1 g/kg.
      2. Recueillir des échantillons de sang de queue à 0, 2.5, 5, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage. Mesurer la glycémie avec un glucomètre à ces moments. Prélever des échantillons de sérum à chaque instant pour la mesure de diverses hormones, comme l’insuline et GLP-1.
      3. Souris rapides pendant 6 h avant l’euthanasie. Prendre une mesure d’échantillon et le glucose de sang final. Comparer la mesure finale de glucose à la mesure de référence. Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital à une dose de 200 mg/kg.
      4. Remplissez la base et des échantillons de sérum final autres analytes et comparer les valeurs de chirurgie préalables et post-opératoires.

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    Résultats

    Les trompe-l'œil et les procédures VSG sont représentés dans la Figure 1. Figure 1 a montre où la ligne de suture est placée le long des parois gastriques au cours de l’intervention factice. Cette même zone est où l’estomac est coupé pendant la chirurgie VSG. Figure 1 b montre le vestige tubulaire de gauche de l’estomac après exécution du générateur de signaux vectoriels.

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    Discussion

    La chirurgie bariatrique est le traitement le plus efficace à long terme de l’obésité et se traduit par d’autres avantages pour la santé tels que des taux élevés de type 2 diabète et l’hypertension remise1,9,15. Les modèles murins de la chirurgie bariatrique offrent un outil puissant permettant d’identifier les mécanismes par lequel la chirurgie bariatrique provoque des améliorations rapides et prononcées en maladies concomitant...

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    Déclarations de divulgation

    Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, sauf Dr Cummings a reçu un financement de Eli Lilly and Company.

    Remerciements

    Cette recherche a été financée par les NIH/NCI R21CA195002-01 a 1, Conseil du Président des femmes de Cornell et la SUNY Graduate Fellowship de la diversité. Laboratoire de Dr Cummings' a également reçu des fonds au cours de la période du projet de la Cornell Comparative programme de formation de Cancer Biology et Eli Lilly and Company.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    45 % régime riche en graissesResearch DietsD12451
    60 % high fat dietResearch DietsD12492
    BoostNestlé160-67538saveur de chocolat riche
    6-0 SutureEthiconZ432monofilament résorbable/conique
    7-0 SutureCovidien8866127-01monofilament résorbable/conique
    Cotons-tiges Fisherbrand23-400-118petits
    cotons-tiges Fisherbrand233-400-101grande
    gazeDivers4x4 4 plis et 2x2 4 plis
    Feuille
    Champ chirurgicalDivers
    0,9 % solution salineDivers
    LRSHospira170RX
    BétadineDivers
    AlcoolDivers
    Pommade pour les yeuxParalube® ; Pommade vétérinaire17033-211-38
    Adhésif tissulaireVetbond1469SB
    Méloxicam (Metacam)Boehringer Ingelheim141-2135 mg/ml
    EnrofloxacineBaytril08713254-18659922,7 mg/ml
    Hémostats à pointe minceOutils scientifiques fins13021-12
    Ciseaux MetzenbaumOutils scientifiques14018-18
    Ciseaux à irisOutils pour les sciences fines14058-09
    Pince DumontOutils pour les sciences fines11251-20
    Pince denteléeOutils pour les sciences fines11020-12
    Aiguille à gavageOutils pour les sciences fines18060-20
    Tournevis à micro-aiguillesOutils pour les sciences fines12075-14
    Ciseaux à ressortFine Science Tools15396-00
    Seringue à insulineDivers
    Seringue de 1 mlSeringue de
    20 mlDivers
    Glucomètre (une touche ultra mini)Lifescan70021208
    Multiplex insuline et GLP-1 kitMeso Scale DiscoveryK15171C-1
    GraphPad Prism 6.00Logiciel
    NestletsAncareNES3600
    Divers finsGraphPad

    Références

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