Nous illustrons une méthode directe pour calculer des macrophages de souris primaires des cellules de la moelle osseuse et une méthode simple pour préparer l’acide gras BSA conjugués. Ensuite, nous démontrons que les acides gras saturés peut induire la mort des cellules macrophages, et la mort de ces cellules est corrélée positivement avec accumulation cellulaire de niveaux de céramide.
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Article de méthode
Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les macrophages expriment très épidermique d’acide gras-protéine et protéine acide gras adipeuse. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés, qui pourrait jouer un rôle essentiel dans la régulation de leurs fonctions immunitaires. De nombreuses études ont montré que les divers acides gras, saturés ou insaturé, mai possèdent différents impacts sur la croissance cellulaire et la fonction. Toutefois, les approches utilisées pour la préparation de l’acide gras varient, qui peut conduire à des résultats non physiologiques. Albumine sérique, un support naturel pour les acides gras dans le sang périphérique chez les mammifères, est recommandé pour former un complexe avec le sel de sodium des acides gras conjugué pour étudier la fonction acide gras dans les cellules de mammifères, ce qui minimise la toxicité du savon d’acide gras. Ainsi, un simple, relativement rapide, chauffage et sonification méthode est développé et présenté ici pour formation conjuguée de l’acide gras BSA. Les auteurs décrivent un protocole à l’aide d’acides gras saturés, notamment les acides stéarique pour induire la mort cellulaire sévère dans les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris. Par ailleurs, nous démontrent que la mort cellulaire d’induite par l’acide gras saturé est corrélée positivement avec des niveaux de céramide cellulaires accumulés. Cette méthode peut être appliquée pour les études de l’impact des acides gras sur les autres cellules de mammifères.
Introduction
Les acides gras jouent un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique et dans la synthèse des phospholipides membranaires dans différents types de cellules. Les acides gras ont une faible solubilité dans l’eau. Une préparation appropriée de l’acide gras est d’une importance cruciale pour étudier les fonctions biologiques des acides gras dans les cellules de mammifères. Lorsque les acides gras sont préparés avec de l’éthanol, beaucoup d’acides gras peuvent montrer leur effet toxique savon (détergent) sur la membrane cellulaire, même à des concentrations relativement faibles1. Un transporteur naturel, important pour les acides gras libres dans le sérum, sérum albumine est considéré comme un bon support pour acides gras livraison in vitro d’acides gras fonction essais2,3,4. Toutefois, les détails de la préparation des acides gras et l’albumine sérique conjuguées ne sont habituellement pas disponibles même si les nombreux Articles de recherche à l’aide d’acides gras ont été publiés.
Les macrophages expriment très protéine acide gras épidermique et adipeuse liant les acides gras protéine5,6,7,8. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés qui pourrait réguler leurs fonctions immunitaires. Afin d’étudier l’impact des acides gras sur les macrophages et autres cellules, différentes méthodes de préparation d’acides gras ont été appliquées1,7,9. En utilisant convenablement préparé l’acide gras/sérum albumine conjugués d’étudier l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages est crucial dans l’obtention des données significatives sur le plan biologique. Études sur l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages peuvent fournir des connaissances de base et des cibles thérapeutiques potentielles relatives au métabolisme des acides gras dans les macrophages impliqués maladies.
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Protocole
le protocole a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Louisville.
1. Macrophages dérivés la moelle osseuse de souris (BMDMs)
- euthanasier une souris de type sauvage âgés de 6 à 8 semaines, en bonne santé à l’aide de CO 2. Épinglez-le vers le bas pour un panneau de mousse et vaporiser avec l’éthanol à 70 % jusqu'à ce qu’il est trempé. Enlever les os de tibia/fémur avec pinces et ciseaux. Mettez-les dans un plat de Pétri avec 5 mL 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Effectuez toutes les procédures dans des conditions stériles.
- Découpé les deux extrémités de l’os du tibia/fémur avec un ciseau dans une hotte de vitroplants stérile. Vider l’OS avec une aiguille 25 G avec PBS + 2 % sérum fœtal (SVF) dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à x 500 g, 4 ° C pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans le tampon de lyse de globules rouges de 1 mL à lyser les globules rouges (RBC) pour moins de 1 min. diluer immédiatement avec du PBS 1 x 9 mL. Centrifuger à nouveau comme à l’étape 1.3. Décanter les surnageants.
- Resuspendre le culot dans du PBS 1 x 10 mL, filtrer la suspension cellulaire au travers d’une maille de nylon stérile 40 μm dans un autre tube de 15 mL pour enlever les débris/amas de cellules. Centrifuger à nouveau comme en 1.3. Décanter les surnageants.
- Resuspendre le culot dans 15 mL de Roswell Park Memorial Institute moyen FBS (RPMI) 1640 avec 5 % et 10 gentamicine μg/mL, plaque les cellules dans un plat de culture de tissu de 100 mm à 37 o C incubateur pour 60 min. agiter doucement le plat, retirez le flottant cellules et dénombrer.
- Plaque 6 x 10 6 cellules dans un plat de 100 mm avec des macrophages 12 mL différencier les médias (RPMI 1640 avec 5 % FBS et gentamicine 10 μg/mL, mélangé avec 30 % L929 milieux conditionnés 10) avec des macrophages de souris recombinant 10 ng/mL facteur de stimulation des colonies (M-CSF) pour 2 jours.
- Après la mise en culture pendant 2 jours dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2, nourrir chaque plat avec macrophages frais 6 mL, différencier les médias 10 ng/ml de M-CSF.
- Le jour 5, prendre 8 mL d’anciens médias dehors sans déranger les cellules et ajouter macrophage frais 10 mL, différencier les médias 10 ng/ml de M-CSF.
- Jour 7, récolter les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) à l’aide d’un poussoir de cellule.
NOTE : Macrophages ci-joint également peuvent être dissociés 5 ml 1 mM EDTA dans du PBS 1 x pendant 5 à 10 min après avoir enlevé les cellules de flotteur et laver la plaque deux fois avec du PBS 1 x 5 mL. Centrifuger les cellules comme dans l’étape 1.3. eux resuspendre dans frais macrophage différencier les médias et les compter avec un hémocytomètre.- Confirmer les BMDMs ' phénotype par cytométrie en flux comme décrit 5. Préparer la souris dérivée de macrophages dans une certaine concentration pour les études suivantes.
2. BSA-gras acide conjugué préparation
- Prepare 2 mM BSA dans du PBS stérile. Par exemple, peser 6,65 g BSA, ajouter 30 mL 1 x PBS pour dissoudre, puis ajoutez plus de PBS jusqu'à 50 mL, mise à l’échelle des composants pour faire 2 mM BSA dans du PBS 1 x.
- Sel de sodium individuels de 5 mM de préparation des acides gras en 2 mM BSA. Chauffez à 37 ° C ou plus, si nécessaire et laisser agir le mélange de 2 mM BSA et sel de sodium des acides gras jusqu'à l’obtention d’une solution claire.
Remarque : Par rapport aux acides gras insaturés, acides gras saturés besoin d’une température plus élevée et plus de temps sonication pour dissoudre.
Filtre de - filtrer la solution gras-acide-BSA à travers un 0,22 µm, partie aliquote dans des microtubes stériles de 1,5 mL tubes et de les stocker à 4 ° C pour usage à court terme ou à-20 ° C pendant l’entreposage à long terme. Aucune précipitation ne doit être observée après stockage à 4 ° C dans le réfrigérateur.
3. Saturé d’acides gras induire la cellule mort de souris moelle osseuse Macrophages dérivés
- les BMDMs dans une plaque de culture de tissus de 24 puits sur plaque avec 0,4 x 10 6/ml dans le macrophage, différencier les médias.
- Traiter les cellules avec les 0,4 mM d’acide palmitique et l’acide stéarique à un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2 pendant 16 à 24 heures. Utiliser des BSA comme contrôle négatif.
- Récolter les cellules avec un releveur de cellule après traitement et tournez en bas les cellules à 500 x g, 4 ° C pendant 5 min.
- Tacher les cellules avec l’annexine V-Alexa 488 et 7-Aminoactinomycine D (7-AAD) dans 100 μL annexine tampon de liaison V pendant 15 min à température ambiante.
- Diluer l’échantillon avec 200 µL de tampon d’annexine-liaison, mélanger doucement, puis conserver les échantillons sur la glace après la période d’incubation.
- Analyser les cellules colorées dès que possible par écoulement cytometry 5. Annexine V-Alexa 488 est détectée dans le canal de la FITC et 7-AAD est détectée dans le canal de PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Coloration de céramide intracellulaire
- après traitement aux acides gras, récolter les cellules comme à l’étape 3.3. Puis fixer les cellules à la paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min.
- Laver l’échantillon avec du PBS 1 x 1 mL, tourner vers le bas comme étape 3.3 et éliminer le surnageant.
- Colorer les cellules avec l’anticorps primaire anti-céramide (dilution 1 : 200) dans le tampon de le perméabilisation 1 x de 100 μL pendant 30 min.
- Lavage et essorage bas les cellules à nouveau comme à l’étape 4.2.
- Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire IgM anti-souris (dilution 1/500) dans le tampon de le perméabilisation 1 x de 100 μL pendant 30 min.
- De lavage et d’essorage en bas les cellules à nouveau comme à l’étape 4.2. Ajouter 250 μL 1 x PBS et d’analyser les cellules colorées par écoulement cytometry 5.
Remarque : Voir la liste détaillée de réactif dans le tableau des équipements et de réactifs.
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Résultats
L’obésité augmente les concentrations en acides gras libres dans le sérum. Comme les phagocytes professionnels, macrophages prennent activement des acides gras pour maintenir l’homéostasie de l’hôte. Au cours de ces processus, surchargée de lipides peuvent provoquer la mort des cellules macrophages. À cette fin, nous avons cultivé BMDMs in vitro avec des niveaux d’acides gras alimentaires et la mort des cellules macrophages mesurée à l’aide de coloration de cytométrie en flux obè...
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Discussion
La bonne préparation de solution d’acide gras est d’une importance critique pour étudier la fonction biologique des acides gras. La neutralisation de l’acide gras augmente sa solubilité dans une solution aqueuse. Toutefois, les sels de sodium des acides gras, en particulier les acides gras saturés, sont encore de faible solubilité dans l’eau ou PBS que nous avons observé. Une méthode consiste à utiliser l’éthanol à 95-100 % pour aider à dissoudre les acides gras1. En utilisant cette méthode, on pe...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent sans conflits d’intérêts financiers.
Remerciements
Ce travail a été soutenu partiellement par les fonds de démarrage de l’Université de Louisville et Institut National du Cancer (Bethesda, MD) accorde R01CA177679, R01CA180986.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bain à ultrasons CPX ; | Bransonic | Modèle 2800 | |
| Palmitate de sodium (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Stéarate de sodium (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumine sérique bovine (BSA), sans acides gras | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Facteur de stimulation des colonies de macrophages de souris (mM-CSF) ; | Technologie de signalisation cellulaire, ; Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexine V, conjugué Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticorps monoclonal anti-céramide (IgM de souris) | Sigma | C8104-50TST | Clone : MID 15B4 |
| Anticorps IgM anti-souris de chèvre, & micro-chaîne, FITC conjugué | Sigma | AP128F | |
| Tampon de fixation | Biolegend | 420801 | |
| Tampon de perméabilisation | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampon de lyse des globules rouges ; | Sigma | 11814389001 | |
| Tampon de liaison Annexine V | BD Biosciences | 556454 | |
| cellules L929 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning ; Lève-cellule ; | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Remarque : M.W. est pour le poids moléculaire. |
Références
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
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Réimpressions et autorisations
