Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

Résumé

Le stress osmotique affecte exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de ce processus. Nous démontrons comment combinant méthodes électrochimiques ainsi que de la microscopie électronique peut être utilisé pour étudier l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur l’activité de l’exocytose, la vésicule quantique taille et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de l’exocytose.

Résumé

Ampérométrie enregistrement des cellules soumises à un choc osmotique Voir la répondant par les cellules sécrétrices à ce stress physique en réduisant l’activité de l’exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré des vésicules dans les événements de l’exocytose unique. Il a été suggéré que la réduction des neurotransmetteurs expulsés est en raison de modifications dans les propriétés biophysiques de la membrane lorsque les cellules se rétrécissement en réponse au stress osmotique et hypothèses que sécrétoires vésicules dans le cytoplasme de la cellule ne sont pas affectés par le stress osmotique extracellulaire. Ampérométrie enregistrement d’exocytose surveille ce qui est libéré des cellules du moment une vésicule fusionne avec la membrane plasmique, mais ne fournit pas d’informations sur le contenu de la vésicule avant la fusion des vésicules est déclenchée. Par conséquent, en combinant ampérométrie enregistrement avec d’autres méthodes analytiques complémentaires qui sont capables de caractériser les vésicules sécrétrices avant l’exocytose à cellules est déclenchée offre un aperçu plus large pour l’examen des vésicules sécrétrices comment et la processus d’exocytose sont affectés par choc osmotique. Nous décrivons ici comment compléter ampérométrie enregistrement intracellulaire cytometry électrochimique et imagerie de microscopie électronique (met) de transmission peut être utilisé pour caractériser les modifications dans le contenu de taille et de neurotransmetteur des vésicules sécrétrices à cellules chromaffines par rapport aux activités de l’exocytose avant et après exposition à un stress osmotique. En liant l’information quantitative tirée des expériences utilisant les trois méthodes d’analyses, conclusions apportées précédemment que les vésicules sécrétrices réagissent au stress osmotique extracellulaire en diminution en taille et en réduisant la taille quantiques de vésicules à maintenir une concentration de neurotransmetteur vésicule constant. Par conséquent, ce qui donne quelques précisions au sujet de pourquoi les vésicules, en réponse au stress osmotique, réduisent les neurotransmetteurs montant libérés au cours de la libération de l’exocytose. Les enregistrements ampérométrique ici indiquent que c’est un processus réversible et que la vésicule après un choc osmotique sont remplis avec les neurotransmetteurs lorsque les cellules placées sont revenues dans un milieu isotonique.

Introduction

Les cellules chromaffines dans les glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines qui libèrent des molécules de neurotransmetteur dans la circulation sanguine. Cela se produit à travers un processus cellulaire qui comporte l’arrimage et la fusion de vésicules remplies de neurotransmetteurs, résultant en une libération contenue des vésicules à l’espace extracellulaire dans un processus appelé exocytose. Les neurotransmetteurs (adrénaline et noradrénaline) dans les cellules chromaffines sont activement transportés par les protéines de membrane dans les vésicules de grand noyau dense (LDCVs) et stockés à des concentrations élevées (~0.5-1 M)¹

Protocole

1. cellule Culture de cellules chromaffines bovines isolées par Digestion enzymatique des glandes surrénales

1. Pour isoler les cellules chromaffines prélevés dans les glandes surrénales bovines, stériliser les cellules avec la solution d’éthanol à 70 %. Garniture de graisse à l’extérieur et du tissu conjonctif à l’aide d’un scalpel. Pour enlever le sang, rincer les veines surrénaliennes en utilisant une solution de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acide (HEPES) 5,6 mM à pH 7,4) qui a été thermostatée à 37 ° C.
2. Pour digérer le tissu, gonfler chaque glande en injectant environ 2,5 mL de chaud filtré s....

Résultats

Nous décrivons ici le protocole car comment combinant l’imagerie TEM ainsi que deux méthodes électrochimiques, ampérométrie en fibre de carbone et intracellulaire cytometry électrochimique, peut fournir des informations qui acquiert une vision plus large, faisant allusion à l’effet de pression osmotique extracellulaire sur les vésicules de sécrétion et le processus d’exocytose. En comparant les enregistrements ampérométrie représentatif de relâchement de l’exocytose à cellules chromaffines simples utilisant l’expérimenta.......

Discussion

Nous présentons ici un protocole et les avantages de la combinaison de trois méthodes d’analyse complémentaires visant à analyser les vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose à mieux comprendre comment une force physique comme la pression osmotique peut affecter des vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose dans les cellules sécrétrices. Ces méthodes incluent la fibre de carbone avec des microélectrodes ampérométrie, qui est une méthode établie pour l’enregistrement de l’activité exocytose, intracellulai.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagénase P	Roche, Suède	11 213 857 001
100-µ ; M Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV plat en plastique de 60 mm revêtu	de collagène VWR	354416
Centrifugeuse	Avanti J-20XP
Capillaire en verre borosilicaté	Sutter instrument Co., Novato, CA
Extracteur de micropipettes	Narishing Inc., Japon	PE-21
Solutions époxy (A et B)	Technologie époxy, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Microscope inversé	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulateur	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hä ; sselholm, Suède
Microscopie électronique à transmission	Omega	Leo 912 AB