Article de méthode

Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

DOI :

10.3791/56538

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6 décembre 2017

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1Department of Medicine I and Clinical Chemistry, University Hospital of Heidelberg, 2Institute for Diabetes and Cancer IDC Helmholtz Center Munich, Germany & Joint Heidelberg-IDC Translational Diabetes Program, 3German Center for Diabetes Research (DZD)

Dans cet article

Résumé

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Analyse quantitative du contenu de la cellule dans le nerf sciatique murin est difficile en raison de la rareté du tissu. Ce protocole décrit une méthode de digestion de tissu et de préparation qui fournit des cellules suffisants pour analyse en cytométrie flux de populations de cellules immunitaires des nerfs de souris individuels.

Résumé

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Nerf-résident des cellules immunitaires dans le système nerveux périphérique (PNS) sont essentiels pour préserver l’intégrité neuronale dans un nerf sain. Les cellules immunitaires de la PNS sont touchés par des blessures et la maladie, qui affecte la fonction nerveuse et la capacité de régénération. Les cellules immunitaires neuronales sont couramment analysés par immunofluorescence (IF). Tandis que si est essentielle pour déterminer l’emplacement des cellules immunitaires dans le nerf, s’il est seulement semi-quantitative et la méthode est limitée au nombre de marqueurs qui peuvent être analysés simultanément et le degré d’expression à la surface. Dans cette étude, cytométrie en flux a été utilisée pour l’analyse quantitative de l’infiltration leucocytaire dans les nerfs sciatiques ou des ganglions de la racine dorsale (DRGs) de souris individuels. Analyse d’unicellulaire a été réalisée à l’aide de DAPI et plusieurs protéines ont été analysés en même temps pour l’expression de surface ou intracellulaire. Les deux nerfs sciatiques d’une souris qui ont été traitées selon ce protocole générée ≥ 30 000 unique nucléées des événements. Les leucocytes dans les nerfs sciatiques, déterminés par l’expression de CD45, représentaient environ 5 % du contenu total de cellules dans le nerf sciatique et environ 5 à 10 % dans le PMSI. Bien que ce protocole se concentre principalement sur la population de cellules immunitaires dans le PNS, la flexibilité de la cytométrie pour mesurer un certain nombre de marqueurs simultanément signifie que les autres populations de cellules présentes dans le nerf, telles que les cellules de Schwann, péricytes , les fibroblastes et les cellules endothéliales, peuvent être également analysées à l’aide de cette méthode. Cette méthode offre donc un nouveau moyen pour étudier les effets systémiques sur le PNS, comme neurotoxicologie et modèles génétiques de neuropathie ou des maladies chroniques, telles que le diabète.

Introduction

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Les cellules immunitaires qui entrent le PNS de la circulation, tel que défini par l’expression de CD45 et CD11b, aident à maintenir l’intégrité du nerf et jouent un rôle tant dans la régénération et la dégénérescence1. Macrophages (définis par leur expression du CD68 chez la souris) peuvent être décalés vers un phénotype inflammatoire, exprimant plus MHC de classe II et CD86 sur leur surface (M1), ou vers un phénotype anti-inflammatoires, exprimant plus CD206 intracellulaire (M2)2 . L’inclinaison du phénotype macrophage est un processus dynamique réglementé par Akt signalisation3, reflétant les d....

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Protocole

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Souris C57BL/6 de type sauvage (mâles ; 10-12 semaines) ont été conservés dans le cycle de lumière/obscurité standard 12 h et ont pu accéder gratuitement au régime standard et de l’eau. Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes par le Comité d’urbanisme et un animalier local et approuvés par le Comité de l’emploi et de locaux animalier à l’administration régionale à Karlsruhe, Allemagne (G216/10).

1. la perfusion de la souris

  1. Sacrifier la souris (C57BL/6 ; Mâles ; 10-12weeks) à l’aide de CO2 ou conformément aux règlements locaux.
    NOTE : Rétro-orbitaire hémorrag....

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Résultats

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Des suspensions cellulaires de longs nerfs sciatiques et DRG tous les principaux ont été préparées, selon le protocole, de six chez la souris C57BL/6 et divisées en trois aliquotes égales pour la coloration. Compteur de coloration au DAPI, qui colore l’ADN, permet la détection d’une population de cellule unique (Figure 1 a–B, panneau supérieur). Emportant le DAPI, avant l’analyse par cytométrie en flux, a diminué dans une cer.......

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Discussion

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Nerfs sciatiques contiennent une proportion importante des lipides, comme le cholestérol, en raison du contenu de la myéline autour des axones. Étant donné que les propriétés des lipides changent avec la température, les différents résultats peuvent être obtenus à différentes températures. Afin d’assurer la préservation de la cellule, toutes les étapes dans ce protocole après la digestion ont été effectuées sur la glace. Alors que la cohérence est recommandé pour des raisons de reproductibilité des résultats, il peut êtr.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts en ce qui concerne la présente étude.

Remerciements

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Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; SFB1118). Les auteurs aimeraient remercier Axel Erhardt pour effectuer la plupart de la dissection et utilement transmettre ces connaissances et Dr. Volker Eckstein devant concourir à l’aspect technique de la cytomètre de flux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
C57BL/6 SourisCharles RiverC57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L de glucose, de glutamine, de pyruvate)Thermo31885023La source de cette matière n’est pas importante
HEPESSigma-AldrichH3375
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA2153
Collagénase de type 4Worthington Biochemical Corp., États-Unis
Désoxyribonucléase (DNase) I du pancréas bovin ISigma-AldrichDN25-1g
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Sérum de veau fœtal (FCS), inactivé par la chaleurSigma-AldrichF4135
Anticorps contre CD11b-PerCP/Cy5.5Biolegend101228Clone M1/70
Anticorps contre le CMH de classe II, biotinyléBiolegend107603Clone M5/114.15.2
Anticorps contre CD45-A647Biolegend107603Clone 30-F11
Anticorps contre CD68-APCBiolegend137007Clone FA/11
Anticorps contre CD206-PEBiolegend141706clone C068C2
Anticorps contre F4/80-PE/Cy7Biolegend123113 Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7Biolegend405206Utilisé pour détecter la biotine MHCII avec CD45-A647 et CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCPBiolegend405213Utilisé pour détecter la biotine MHCII avec CD68-APC et F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
DAPISigma-AldrichD9542-1MGDiluer dans du PBS à 50x et stocker à 4 ° ; C dans l’obscurité
Tamis de dissociation cellulaire - kit broyeur de tissusSigma-AldrichCD1
En forme de V, plaques 96 puitsGreiner/SigmaM8185
5ml tube à fond rond en polystryène, 12x75mmBD Biosciences352008 boîte de
Pétri 60x15mmGreiner/SigmaZ643084
BD LSR II Cytomètre en fluxBD Biosciences
LS004188

Références

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  1. DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
  2. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cel....

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Mots-clés

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