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Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

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DOI :

10.3791/56568

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12 mars 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une analyse inversée invasion verticale qui pourrait être utilisée pour quantifier les capacités de migration et invasion des cellules dans un décor en trois dimensions tout en préservant le microenvironnement cellulaire. Ce dosage est adapté aux cellules rares et/ou sensibles.

Résumé

Bien que les analyses d’invasion 3D ont été développés, le défi demeure pour étudier les cellules sans affecter l’intégrité de leur microenvironnement. Des analyses de 3D traditionnelles telles que la chambre de Boyden exigent que les cellules sont déplacées de l’emplacement original de la culture et déplacés à un nouvel environnement. Non seulement cela perturbe les processus cellulaires qui sont intrinsèques au microenvironnement, mais il se traduit souvent par une perte de cellules. Ces problèmes sont particulièrement difficiles lorsqu’il s’agit des cellules qui sont soit rares, soit extrêmement sensible de leur microenvironnement. Nous décrivons ici le développement d’un test 3D invasion qui évite les deux préoccupations. Dans ce test, les cellules sont bien plaquées au sein d’un petit et une matrice de ECM contenant un facteur chimiotactique est dressée au sommet des cellules. Cela ne nécessite aucun déplacement de la cellule et permet aux cellules d’envahir le haut dans la matrice. Dans cet essai, invasion des cellules ainsi que la morphologie des cellules peut être évaluée dans le gel de collagène. À l’aide de ce test, nous caractérisons les capacités invasives des cellules rares et sensibles ; les cellules hybrides résultant de la fusion entre les cellules de cancer du sein MCF7 et mésenchymateuses/multipotentes tige/stroma cells (MSCs).

Introduction

Motilité cellulaire est un processus normal de développement et physiologique des cellules. Cependant, des changements dans le modèle et la capacité des cellules de migrer et d’envahir sont associées à certaines pathologies incluant les maladies inflammatoires et métastases de cancer1,2,3. Métastase est sans doute l’aspect le plus mal compris dans le cancer. Pour métastases, les cellules cancéreuses doivent dégrader la matrice extracellulaire (ECM), envahissent le tissu local et intravasate. Une fois en circulation, les cellules cancéreuses diffusera sur le site distant, extravasate et forment des tumeurs secondaires. Par conséquent, la capacité des cellules à dégrader l’ECM, à migrer et à envahir sont lié à leur potentiel métastatique. Différentes approches ont été développées pour analyser et quantifier les capacités de migration et d’invasion des cellules. Les approches les plus utilisées incluent la cicatrisation de dosage, Time-lapse microscopie et le dosage de chambre de Boyden. La plaie guérison dosage4 temps déchéance microscopie et sont simples et pratiques des dosages qui donneraient un aperçu préliminaire de la migration cellulaire. Cependant, les deux sont les tests 2D qui ne reflètent pas l’environnement 3D dans lequel les cellules existent en vivo. Des études ont montré que les cellules réagissent différemment à un environnement en 3D par rapport à une 2D5,6. De plus, essais guérison de la plaie sont difficiles à reproduire et à produire des résultats quantitatifs7,8,9. L’analyse de la Zone d’Exclusion de cellule, qui est une modification 3D du dosage de la cicatrisation, est un dosage plus physiologiquement pertinent, mais il n’est pas adapté pour les piles faibles en nombre comme les cellules hybrides résultant de cellule fusion événements10,11 .

Le dosage de chambre de Boyden est un dosage 3-dimensional prévoyant des micro-environnements pertinentes études cellulaires. Cependant, elle nécessite des cellules à déposer dans la chambre supérieure du système de dosage Boyden de migrer et d’envahir le bas vers le milieu contenant du facteur chimiotactique et être retirés de leur microenvironnement original. Cette approche 3D n’est pas appropriée dans l’analyse de la capacité de migration et invasion des cellules, susceptibles de leur microenvironnement et/ou limitée en numéro10,11,12. Une nouvelle approche pour analyser l’invasion et la migration cellulaire est la microfluidique chambre dégradé dosage13. Bien qu’adapté et fiable dans les études de migration et d’invasion, ce dosage est plus cher et pourrait être techniquement difficile pour un laboratoire typique. Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est compatible avec plusieurs types de cellules dont les cellules sensibles à leur microenvironnement et/ou restreints en nombre. Ce test est une adaptation du protocole proposé par Hooper et al. 14. dans ce test, les cellules demeurent dans leur migration et leur microenvironnement original et invasion est surveillée comme ils se déplacent vers le haut dans le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique11. Ce dosage est reproductible et a été optimisé et validé dans la boîte de Petri de 35 mm. Il pourrait être adapté aux conditions de dosage différents y compris les tailles de culture de cellules différentes, différentes matrices ou force d’adhérence et chimioattractants différents. Ce test pourrait constituer une plateforme in vitro pour la présélection dans le processus de découverte de médicaments.

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Protocole

Remarque : Ce protocole est décrit dans McArdle et al. 11. une chronologie est fournie à la Figure 1.

1. préparation de la plaque de culture

  1. Laver le 35 mm boîte de Petri contenant un fond en verre 10 mm avec 1 mL de 1 M d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 15 min abaisser l’hydrophobicité du verre-fond.
  2. Laver la plaque de culture deux fois avec 1 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) de se débarrasser de tous le HCl.
  3. Laver la plaque de culture deux fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %.
  4. Rincez la plaque de culture avec 1 mL de milieu de culture cellulaire spécifique (ici, utilisation α-MEM additionné de 10 % de chaleur inactivé SVF et 1 % des acides aminés non essentiels).
    Remarque : La plaque de culture traitée contenant le milieu de culture peut être stockée dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur d’air à 37 ° C jusqu’au lendemain.
  5. Cultiver les cellules (MSCs et co-culture de MCF-7) dans le fond en verre traité bien de la boîte de Petri de 35mm à la confluence de 100 %. Co-culture 35 000 cellules MSC et 75 000 des cellules MCF7 pendant 24 h.

2. préparation du gel collagène

  1. Stocker les pointes de micropipette utilisés pour le pipetage le gel de collagène dans le congélateur pour empêcher la polymérisation du collagène au contact.
    Remarque : C’est l’étape la plus critique.
  2. Déterminer un volume de collagène de queue de rat j’ai à utiliser selon la concentration de l’encours de collagène. Préparer 100 µL de gel de collagène avec ce test.
    Remarque : Forte concentration de collagène de queue de rat que je stock fonctionne mieux. Déterminer le volume de 10 x moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco à utiliser pour diluer le collagène en conséquence.
  3. Combiner le collagène de glace rat queue j’ai (3,8 µg/mL de bouillon), de l’aigle de la modification de 10 x Dulbecco moyen et 1 milieu de culture cellulaire x additionné de sérum de veau fœtal 2 % et le chimioattractant approprié à une concentration finale de collagène de 2,4 mg/mL.
  4. Ajouter au mélange 4.5 % de solution de bicarbonate de sodium pour neutraliser le gel de collagène.
    Remarque : Le volume de solution de bicarbonate de soude ajoutée peut varier en fonction du pH exact des autres réactifs. Il est préférable de tester le mélange avec des bandelettes de pH pour assurer une solution neutre, ou utiliser un indicateur de pH dans le milieu de culture.
  5. Déposez 80 µL du mélange collagène sur des cellules dans le fond en verre bien de la boîte de Pétri.
  6. Permettre le gel de collagène à polymériser pendant 30 min dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur d’air à 37 ° C.
  7. Recouvrir le gel de collagène avec 2 mL de milieu cellulaire avec sérum réduit (2 %) et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur pour 24, 48 ou 72 h.
    Mise en garde : La plaque doit être manipulée avec soin pour empêcher le gel de collagène de détacher le fond de verre.

3. exemple de préparation de collagène gel à l’aide d’un stock de collagène de queue de rat de 3,8 µg/ml

  1. Sur la glace, mélanger 114,5 µL de collagène de queue de rat, 16,6 µL de 10 x DMEM et 33,1 µL de milieu de culture contenant le facteur chimiotactique.
  2. Neutraliser le mélange collagène avec 14,0 µL de bicarbonate de sodium.
  3. Continuer comme au point 2.5.

4. imagerie des cellules

  1. Retirez doucement le support du plat.
  2. Rincer doucement le gel avec 1 mL de PBS.
  3. Fixer les cellules avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min.
  4. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS.
  5. Colorer les cellules avec solution DAPI (100 ng/mL) pendant 20 min à température ambiante.
  6. Les cellules à l’aide d’un microscope confocal à différents endroits et prenant 400 µm z-empiler les images de chaque emplacement de 16 µm de l’image. Le microscope utilisé possède un disque unité qui permet l’imagerie confocale utilisant une lumière blanche, source d’excitation arc de numérisation. Utiliser une lentille X 20 utilisé avec une ouverture numérique de 0,75.
  7. Reconstituer les images.
    1. Ouvrez les images pour un gel donné (environ 25 images) et créer une pile d’image en cliquant sur image → piles → des images à empiler. La première image correspond à la partie inférieure du gel (z = 0 µm), la deuxième image correspond à la première étape dans la direction z (z = 16 µm), la troisième image correspond à la deuxième étape dans la direction z (z = 32 µm). Évaluer chaque noyau à chaque profondeur de l’image et désigner la profondeur à laquelle le noyau a été mise au point plus forte comme la profondeur de l’invasion de cette cellule particulière.

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Résultats

Nous avons utilisé une boîte de Petri de 35 mm avec un verre bas et rat queue collagène I à développer et optimiser une invasion 3D in vitro d’analyse protocole. À l’aide de ce test, nous avons montré ce sein cancéreux MCF7 et CSM cellules pourraient envahir dans le gel de collagène pour une distance moyenne de 0,04 ± 1,8 µm et 41,3 ± 76,0 µm respectivement après 48 h lorsque IGF1 (18,6 ng/mL) a été utilisé comme facteur chimiotactique (Figure 2). Pl...

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Discussion

Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est commode pour divers types de cellules dont les cellules qui sont rares et dépendent de leur microenvironnement. Dans ce test 3D invasion, les cellules restent dans leur microenvironnement original et sont couverts par le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique. Ensuite, les cellules migrent et envahissent dans le collagène. Dans ce test, les cellules peuvent être teintés et facilement surveiller le gel. La simplicité et la reproductibilit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont déclaré qu’aucun intérêt concurrent n’existe.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) par l’intermédiaire de la Royal Canadian Military Institute-Centre hygiène Jackson State University et l’US Department of Defense, Idea Award 11-1-0205.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation, Ashland, MAP35G-1.5-10-Cplats à fond en verre mat
Collagène de queue de rat ICorning, Corning, NY, États-Unis354236Gel de collagène
Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAH1758HCl
Saline tamponnée au phosphateThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, États-Unis10010023Pbs
10X Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAD242910X DMEM
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAS5761NaHCO3
Confocal Microscope fluorescentOlympus America, Center Valley, PA, USAOlympus IX81Microscope confocal
Sérum bovinfœtal définiGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, États-UnisSH30070.03FBS
Microscope à balayage laser multiphoton multiphoton Ti :SapphirePrarie Technologies, Sioux Falls, SD, États-Unis40x NA 0.8 objectifMPLSM
Imaris logicielBitplane Inc. Zurich, CHImaris 7.5.2Imaris logiciel
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, États-UnisD9542DAPI
ParaformaldéhydeThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, États-Unis50980487
milieu essentiel PFA&alpha ;-minimumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, États-UnisM0894
MDA-MB-231ATCC ; Manassas, Virginie, États-UnisHBT-22
MSCTrivedi et Hematti, 2007
Objectif 20X UPLAPOOlympus America, Center Valley, PA,États-Unis 36-064Objectif Olympus UPLSAPO 20X

Références

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
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Mots-clés

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