À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

Résumé

Il s’agit d’un protocole de temps - et rapport coût - entrée en vitro étudie les mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblées, qui est un très besoin médical dans le traitement du cancer.

Résumé

Les deux dernières décennies ont vu un changement de médicaments cytotoxiques à une thérapie ciblée en oncologie médicale. Bien que les agents thérapeutiques ciblés ont montré une efficacité clinique plus impressionnante et réduit au minimum les effets négatifs que les traitements traditionnels, la résistance aux médicaments est devenu la principale limite à leurs prestations. Plusieurs modèles précliniques/in vitro/in vivo de la résistance acquise aux agents ciblés dans la pratique clinique ont été développés principalement à l’aide de deux stratégies : manipulation i) génétique pour la modélisation des génotypes de résistance acquise et ii) in vitro / in vivo sélection de modèles résistants. Dans le présent travail, nous proposons un cadre fédérateur, pour étudier les mécanismes sous-jacents responsables de la résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de faire taire les procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur. Cette approche simple de temps - et rapport coût - entrée est largement applicable et pourrait être facilement étendue pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments ciblés dans différentes tumeurs histotypes.

Introduction

Suite aux découvertes cruciales en biologie moléculaire et cellulaire, un certain nombre de nouvelles molécules anticancéreuses synthétisées ont été développé pour cibler sélectivement les voies de signalisation oncogènes dans un large éventail de types de tumeurs. En particulier, deux catégories d’agents thérapeutiques ciblés aux propriétés uniques en oncologie, des composés chimiques synthétiques à savoir et on sait que les anticorps monoclonaux recombinants, ont obtenu des succès cliniques et considérablement altérée du cancer dans ces dernières décennies^1,2,3.

Protocole

Remarque : Ce protocole a été ajusté spécialement pour l’analyse des mécanismes qui sous-tendent la résistance acquise au trastuzumab de lignées de cellules de cancer gastrique HER-positive. Tous les instruments de laboratoire nécessaires figurent dans la Table des matières.

1. génération des sous-clones résistant à la thérapie ciblées

NOTE : Ceci est la plus critique et difficile à normaliser pas dans le protocole dû au fait que différentes lignées cellulaires peuvent présenter des sensibilités différentes à l’inhibiteur de thérapeutique ciblée indépendamment de leur concentration de tumeur histot....

Résultats

La figure 1 donne un aperçu du cadre de la procédure expérimentale. Trois cancers gastriques lignées cellulaires exprimant un niveau élevé de HER2 et sensible au trastuzumab (IC₅₀ < concentration plasmatique maximale du graphe de gauche de médicament, Figure 2 a,) ont été cultivées dans un milieu de culture contenant l’agent thérapeutique ciblée. Une dose a 10 fois inférieure à la concentration plasmatique maximale .......

Discussion

Alors que personnalisé et ciblé des thérapies ont suscité l’enthousiasme croissant, ces thérapies dites « intelligentes » face à l’obstacle majeur même comme les médicaments de chimiothérapie traditionnelle, c'est-à-dire, l’acquisition rapide et imprévisible de la pharmacorésistance. Pour améliorer les résultats de la thérapie ciblée, des problèmes de résistance aux médicaments doivent être résolus par une meilleure compréhension des mécanismes qui les causent. Ici, nous avons présenté une méthode largement acce.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Le	Invitrogen 15596026		TRIzol est un réactif permettant d’isoler l’ARN total de haute qualité ou d’isoler simultanément l’ARN, l’ADN et les protéines d’une variété d’échantillons biologiques KIT DE
SYNTHÈSE D’ADNC ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	Le kit de synthèse d’ADNc iScript est un kit de synthèse d’ADNc premier brin sensible et facile à utiliser pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel.
4331182	Les	tests d’expression génique TaqMan consistent en une paire d’amorces PCR non marquées et une sonde TaqMan avec un marqueur de colorant FAM ou VIC d’Applied Biosystems à l’extrémité 5' et un liant à rainure mineure (MGB) et un quencher non fluorescent (NFQ) à l’extrémité 3'.
Réactif d’extraction de protéines de mammifères M-PER	Thermo Scientific	78501	Le réactif d’extraction de protéines de mammifères Thermo Scientific M-PER est conçu pour fournir une extraction très efficace des protéines solubles totales à partir de cellules de mammifères en culture.
Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Thermo Scientific (100X) offre la commodité d’une solution unique avec une protection complète de l’échantillon de protéines pour les lysats cellulaires et tissulaires.
Kit de dosage des protéines Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Le kit de dosage des protéines Thermo Scientific Pierce BCA est un ensemble de réactifs de dosage à deux composants, de haute précision et compatible avec les détergents, permettant de mesurer la concentration totale en protéines (A562 nm) par rapport à un étalon protéique.
4x tampon d’échantillon Laemmli	Bio-Rad	1610747	Utilisez 4x tampon d’échantillon Laemmli pour la préparation des échantillons pour SDS PAGE. Pour réduire les échantillons, ajoutez un agent réducteur tel que le 2-mercaptoéthanol au tampon avant de mélanger avec l’échantillon.
4&ndash ; 20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels ont une nouvelle formulation et peuvent être utilisés à la fois pour les séparations de protéines dénaturantes standard ainsi que pour l’électrophorèse native.
Les étalons de transfert Precision Plus Protein WesternC	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards sont disponibles en formats Dual Color, All Blue, Kaleidoscope et Dual Xtra. Tous les quatre ont les mêmes schémas de migration du gel, avec 3 bandes de référence de haute intensité (25, 50 et 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS est un tampon de coulée prémélangé pour la séparation d’échantillons de protéines par SDS-PAGE.
Packs de transfert en PVDF Trans-Blot Turbo Mini	Bio-Rad	1704156	Packs de transfert en PVDF Trans-Blot Turbo Mini pour un transfert rapide et efficace des protéines à partir de mini-gels à l’aide du système de transfert Trans-Blot Turbo. Chaque pack de transfert sous vide et prêt à l’emploi contient deux piles de réservoirs d’ions saturés de tampon et une membrane PVDF pré-humidifiée.
Conjugué StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	conjugué StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) pour la détection chimiluminescente ou colorimétrique des étalons de protéines non colorées Precision Plus Protein ou des étalons de protéines WesternC Precision Plus Protein sur les transferts occidentaux.
La solution Immun-Star WesternC	Bio-Rad	5572	La solution Immun-Star WesternC, une méthode de détection des protéines, détecte les quantités de protéines au milieu du femtogramme.
	L’Invitrogen		siRNA à contrôle négatif universel n’a pas de similitude significative avec les séquences génétiques de souris, de rat ou d’homme. Le contrôle a également été testé dans des cribles cellulaires et il a été prouvé qu’il n’avait aucun effet significatif sur la prolifération, la viabilité ou la morphologie des cellules.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium est un milieu essentiel minimal (MEM) amélioré qui permet une réduction de la supplémentation en sérum de bovin fœtal d’au moins 50 % sans modification du taux de croissance ou de la morphologie.
Silencieux Select pré-conçu & L’interférence		4390824	ARNi) validée est le meilleur moyen de réduire efficacement l’expression génique pour étudier la fonction des protéines dans un large éventail de types de cellules.
Réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778075	réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX offre une solution avancée et efficace pour l’administration de siRNA. Aucun autre réactif de transfection spécifique aux siARN ne permet une administration aussi facile et efficace des siRNA dans une grande variété de lignées cellulaires, y compris les types de cellules courants, les cellules souches et les cellules primaires, ainsi que les types de cellules traditionnellement difficiles à transfecter.
Souris anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	concentration de travail : 1:400 dans une solution de lait à 5 %
Chèvre anti-souris IgG-HRP : sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	Concentration de travail : 1:10000 dans une solution de lait à 5 %
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	il s’agit d’un inhibiteur des protéases à sérine et de l’acétylcholinestérase
Thermocycleur pour RT-PCR	MJ Research	MJ Research Thermocycleur PTC-200	il permet une homogénéité de la température et une vitesse de montée en puissance allant jusqu’à 3° ; C/sec. Le protocole peut également être réalisé avec d’autres thermocycleurs
Instrument RT-PCR en temps réel	RT-PCR 7500	d’Applied Biosystems	Il s’agit d’une plate-forme à cinq couleurs qui utilise des réactifs de réaction en chaîne par polymérase (PCR) basés sur la fluorescence pour fournir une quantification relative à l’aide d’un type de test comparatif CT. Le protocole peut également être réalisé avec d’autres thermocycleurs
Spectrophotomètres à microvolume	Thermo Scientific	Nanodrop	Il fournit une mesure précise et rapide des nucléides acides en utilisant un petit volume d’échantillon
Système de transfert	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo	Il effectue un transfert sémy à sec en quelques minutes
Système d’acquisition d’images et documentation sur gel	Image Bio-Rad	Chemidoc Il	est facile à utiliser pour la détection par chimiluminescence

réactif 12935300 le ARN ( Système