Protéine de l’intégrase spumavirus prototype recombinante est souvent contaminée par une nucléase bactérienne pendant la purification. Cette méthode identifie la contamination nucléase et le supprime de la préparation finale de l’enzyme.
Article de méthode
Protéine de l’intégrase spumavirus prototype recombinante est souvent contaminée par une nucléase bactérienne pendant la purification. Cette méthode identifie la contamination nucléase et le supprime de la préparation finale de l’enzyme.
La protéine de l’intégrase (IN) du virus spumeux prototype rétrovirus (PFV) est une enzyme de modèle pour l’étude du mécanisme d’intégration rétrovirale. Par rapport à po d’autres rétrovirus, PFV IN est plus soluble et plus propices à la manipulation expérimentale. En outre, il est sensible aux inhibiteurs de IN cliniquement pertinente virus d’immunodéficience humaine (VIH-1), suggérant que le mécanisme catalytique de PFV IN est similaire à ce que de l’HIV-1 po en catalyse covalente par le rattachement de viral ADN complémentaire (ADNc) à target L’ADN dans un processus appelé transfert de brin. Cette réaction de transfert de brin introduit des entailles à l’ADN cible. Analyse des produits de réaction d’intégration peut être confondue par la présence de nucléases qui nick de même ADN. Une nucléase bactérienne a été établie conjointement purifier par recombinaison PFV IN exprimé chez Escherichia coli (e. coli). Nous décrivons ici une méthode pour isoler la PFV IN de la nucléase contaminante par chromatographie d’affinité de l’héparine. Fractions sont facilement contrôlées pour contamination nucléase avec un plasmide surenroulé et électrophorèse sur gel d’agarose. PFV IN et la nucléase contaminante affichage alternatives affinités pour l’héparine Sépharose permettant une préparation exempte de nucléase de recombinant PFV IN adapté à l’analyse biochimique ou simple molécule en vrac de l’intégration.
Des études biochimiques et unique molécule d’interactions de protéine avec de l’ADN nécessitent exceptionnellement pures protéines recombinantes. Contaminer les nucléases de bactéries peut masquer les résultats de ces tests. Une nucléase contaminante a été trouvée dans les préparations de protéines recombinantes oxygène charognard protocatéchuate-3, 4-dioxygénase (PCD) et prototype virus spumeux (PFV) intégrase (IN) isolés de Escherichia coli (e.coli)1 , 2 , 3.
Tests d’intégration rétrovirale reposent sur la conversion de l’ADN su....
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1. inciter PFV en Expression dans e. coli
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Recombinant PFV en est souvent contaminée par une nucléase bactérienne1. Analyses biochimiques intégration dépendent de la quantification de la conversion de l’ADN de plasmide surenroulé cercles détendues et produits linéaires. La présence d’une nucléase contaminante pourrait conduire au dosage fallacieux de ces tests. Expression de PFV po avec une étiquette de protéine est induite chez e. coli (Figure 1) et d’abord purifiée par chromatographie d’affinité de .......
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Protéines recombinantes qui interagissent avec l’ADN, tels que protéines, charognards d’oxygène pour les applications de microscopie seule molécule ou integrases rétrovirale, réparation de l’ADN doivent être exempts de contamination bactérienne nucléases2,3. Ces contaminants peuvent confondre l’interprétation des résultats au cours de tests biochimiques ou simple molécule en vrac.
Nous avons trouvé qu’une nucléase bactérienne souvent c.......
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par les NIH AI099854 et AI126742 à clé.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB bouillon | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicilline | Amresco | 0339 | |
| Chloramphénicol ; | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG ; | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Produits chimiques fins | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF ; | Amresco | 0754 | |
| Imidazole ; | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT ; | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose ; | Denville Scientific | CA3510 | |
| Bromure d’éthidium | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycérol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Héparine Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protéase ; | EMD Produits chimiques | 71493-3 |
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