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Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation

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DOI :

10.3791/56615

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8 décembre 2017

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1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la culture 3D du rat encéphales gliales, y compris les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Nous démontrons la culture cellulaire primaire, synthèse de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) hydrogel, HAMAphoto-polymérisation et le cell encapsulation et traitement d’imagerie microscopique confocal et balayage électronique des échantillons.

Résumé

Dans le système nerveux central, nombreuses lésions aiguës et les maladies neurodégénératives, ainsi aussi implanté des dispositifs ou des biomatériaux conçus pour améliorer le résultat de la fonction dans le même résultat : inflammation excès conduit à une gliose, cytotoxicité, et/ou formation d’une cicatrice gliale qui collectivement aggraver une atteinte ou d’empêcher la reprise saine. Dans le but de créer un système de modèle cicatrice gliale formation et l’étude des processus inflammatoires, nous avons généré un échafaudage de cellule 3D capable d’accueillir des cellules gliales cultivés primaires : microglie qui régulent la réponse du corps étranger et initient la événement inflammatoire, astrocytes qui réagissent pour former une cicatrice fibreuse et oligodendrocytes qui sont en général vulnérables aux lésions inflammatoires. Le présent ouvrage offre une méthode détaillée étape par étape pour la fabrication, la culture et caractérisation microscopique d’un échafaudage d’hydrogel 3D à base d’acide hyaluronique avec rat encapsulé encéphales de cellules gliales. En outre, les protocoles pour la caractérisation d’encapsulation de cellules et de l’échafaud hydrogel par immunofluorescence confocale et microscopie électronique à balayage sont démontrés, ainsi que la capacité de modifier l’échafaud avec des substrats bioactifs, avec incorporation d’un mélange commercial de lame basale d’intégration améliorée de cell.

Introduction

L’inflammation du système nerveux central (CNS) a longtemps été considérée comme une caractéristique de l’aigu (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, traumatisme cérébral et la moelle épinière) et chroniques (p. ex. Alzheimer, Parkinson d’et maladies de la chorée de Huntington) lésion de CNS, mais n’est plus en plus reconnue comme un facteur causal de neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Maintenue ou inflammation inappropriée peut causer des blessures neurales et démyélinisation (p. ex. sclérose en plaques) et une influence négative sur le développement du cerveau (par exemple, la schizophrénie, l’autisme) et des États de l’humeur (p. ex., dépression, anxiété le trouble bipolaire). En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de dispositifs implantables (e.g., interfaces cerveau-ordinateur1,2,3, deep brain stimulation4,5, intraspinale microstimulation6,7,8,9,10) générer une réponse inflammatoire prévisible à l’interface entre l’appareil et le système nerveux central, entraînant une réponse de tissu protecteur qui peut provoquer une perte d’efficacité ou dispositif échec au cours de la durée de vie de l' implant11. L’inflammation dans le système nerveux central est généralement initiée par la microglie, qui fonctionnent comme les cellules immunitaires résidents du CNS, responsable de la surveillance des tissus et la réaction au corps étranger (révisé12) de montage. Selon la gravité de l’insulte, le signal de la microglie et les recrues supplémentaires types de cellules à un site de la lésion. Plus précisément, les cellules microgliales activer les astrocytes, qui à leur tour agissent comme des cellules inflammatoires secondaires et forme une barrière protectrice dense pour contenir une blessure site13,14. Microglies peuvent aussi initier une cascade d’activité dans les cellules du système immunitaire périphérique, ce qui peut entraîner la rupture de la BHE afin de permettre l’infiltration immunitaire (revue en référence15).

Dans le cas des dispositifs implantés dans le SNC, les lésions tissulaires résultant d’un dispositif ainsi que la présence continue de l’appareil étranger peuvent enclencher un processus appelé la cicatrice gliale. Dans ce processus, les cellules microgliales migrent vers et se multiplient à l’endroit de la blessure. Ils ont également l’initiative la libération de facteurs inflammatoires pour neutraliser les menaces potentielles et recruter des cellules gliales supplémentaires. Par la suite, astrocytes activés deviennent hypertrophiques et commencent à encapsuler le dispositif implanté pour former une barrière fibreuse continue16. Signalisation inflammatoires sert également à promouvoir le retrait des processus neuronaux de la proximité de l’implant et finalement recrute des fibroblastes pour renforcer le développement de la cicatrice gliale17. Les oligodendrocytes, responsables de gainage des neurones dans la myéline pour améliorer la conductance, ne survivent pas à ce processus et cellules éloignés sont séparés de l’implant par la cicatrice18. Cicatrice gliale grandement réduit la fonction et la durée de vie des dispositifs implantés, notamment pour les électrodes d’enregistrement et en fin de compte sert à limiter les fonctionnalités des interfaces neuronales19.

Plusieurs approches ont été exploités pour augmenter la biocompatibilité et une activité d’interface des dispositifs implantés dans les CNS20,21,22,23. Un examen exhaustif est disponible sur la conception biocompatible de ces interfaces neurales24. Les principales stratégies incluent entourant l’électrode avec revêtements compatibles tels que polyelthyleneglycol (PEG), acides polylactique-co-glycolique (PLGA)25, ou le renforcement de l’électrode avec des polymères conducteurs tels que poly (éthylène dioxythiophene) (PEDOT) et le polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Revêtements bioactifs ont également été employées pour offrir des repères pour la croissance de tissu nerveux à l’aide de ligands dérivés de matrices extracellulaires notamment collagènes et fibronectins des acides hyaluroniques32,33,34 ,35,36,37. La bioactivité de ces revêtements a été approfondie avec facteur de croissance des systèmes de largage d’émuler cellulaire naturel des sécrétions30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. en même temps, certains groupes de recherche ont opté pour transformer la géométrie de l’électrode, la flexibilité et composition pour diminuer le décalage mécanique entre l’appareil et les tissus51,52,53 ,,du5455,56,,57. Au total, ces stratégies ont entraîné de nombreuses améliorations prometteuses de génération neurones périphériques interfaciales, cependant la compatibilité à long terme est une question de cours et de progrès peuvent être entravé par des modèles complexes et fastidieuses in vivo .

Des approches basées sur le modèle animales peuvent limiter le débit expérimental et augmentent les coûts des tests de biocompatibilité de l’électrode. In vitro les approches à l’aide de culture de cellules classiques techniques offrent une alternative plus rentable, mais ne parviennent pas à une grande partie de la complexité de l’interaction entre l’appareil et les tissus58récapituler. En particulier, essais des revêtements de surface à l’aide de limites de culture cellulaire 2D, la modélisation de la géométrie de l’électrode et l’influence de décalage mécanique et micromotion considéré à générer une réponse de l’hôte qui contribuent au dispositif échec59 , 60.

Pour surmonter les problèmes liés à la culture cellulaire 2D, hydrogel de cultures de cellules nerveuses ont été développés pour une grande variété d’applications, les études pharmacologiques61, pour diriger la différenciation des cellules neurales62, pour comprendre la maladie les voies63,64, ou en couches en culture mixte avec d’autres types de cellules pour la migration de modèle cellulaire, neuroprotection, ou modèle tissu microenvironnements61. Hydrogels sont facilement formés à différentes dimensions et géométries peuvent incorporer de nombreux types de cultures de cellules primaires ou immortalisé et sont très propices à l’analyse de techniques couramment utilisées, telles que la microscopie confocal fluorescence. Pour créer un modèle du processus de cicatrisation glial, nous avons récemment développé et caractérisé un système acide hyaluronique base hydrogel 3D haut débit stable de la réaction gliale à implanté des électrodes (Figure 1)65. Ce système a plusieurs avantages distincts : 1) primaires cellules gliales (cellules microgliales, astrocytes et oligodendrocytes) sont encapsulées dans une matrice 3D composée de polymères d’acide hyaluronique, qui est un composant de la matrice extracellulaire endogène ; 2) la rigidité de la matrice peut être « réglée » pour recréer les propriétés mécaniques du cerveau ou des tissus de la moelle épinière ; et 3) des cellules peuvent être encapsulés dans la matrice dans une approche rapide de la table à l’aide de photopolymérisation avec feu vert, limiter la toxicité au cours de l’encapsulation. Ce système permet aux fonctionnalités clés dans vivo biocompatibilité : dispositifs sont insérées dans l’hydrogel de manière comparable aux tissus, et la réponse cellulaire aux dispositifs implantés sont surveillés pour un large éventail de paramètres65. Il s’agit d’une incompatibilité mécanique entre les périphériques et les revêtements d’hydrogel de diverses structures et les impulsions de stimulation électrique. Ce système comprend également des oligodendrocytes et des précurseurs connexes, qui sont souvent présents et recruté des cicatrices gliales. Leurs dégâts, la mort et la phagocytose par les cellules microgliales sont très révélateurs de lésion inflammatoire et comme un modèle réduit de cicatrices ou récupération, ils ont la capacité de démontrer re-myélinisation des neurones66.

Dans les présentes, nous décrivons une méthode de synthèse et de la formation d’hybrides acide hyaluronique hydrogels combinées avec des formulations de membrane de sous-sol disponible dans le commerce pour améliorer la Constitution de la cellule. En outre, nous allons démontrer l’intégration de primaire des cellules gliales (microglie, astrocytes et oligodendrocytes) et analyse de la croissance de la culture en utilisant l’immunocytochimie et microscopie confocale.

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Protocole

Le protocole pour l’extraction de tissu de cerveau de ratons Sprague Dawley en jour 1, mis à mort par décapitation, a été approuvé par le Comité de l’urbanisme à l’Université de l’Alberta et animalier.

1. la microglie et Isolations de Astrocyte67,68

Remarque : Tous les milieux d’isolement et de culture cellulaire est préchauffé à 37 ° C dans un bain d’eau. Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) a 1 % pénicilline-streptomycine (PS). Dulbecco tous modifiés médias d’aigle avec F12 du jambon mélange nutritif (DMEM/F12) est additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline-streptomycine (PS). Seuls des mélanges avec de la trypsine manquent FBS. Tous les matériaux dans le présent protocole sont stérile (filtre, alcool, acheté et stérilisés à l’autoclave) et chaque étape après étape numéro 1.8 est réalisée dans une armoire avec une technique aseptique de biosécurité.

  1. Par cerveau, préchauffer 15 mL de HBSS et 12,5 mL DMEM/F12 à 37 ° C dans des tubes à centrifuger coniques 50 mL et environ 2 mL de 0,25 % de trypsine avec l’acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM (EDTA) dans un tube à centrifuger conique 15 mL. Faire chauffer 25 mL supplémentaire de DMEM/F12. Trypsine chaude environ 10 minutes avant l’utilisation pour prévenir la perte de l’activité enzymatique.
  2. Verser suffisamment chaud HBSS dans 6 stérile et de récipients de culture de 10 cm pour couvrir la surface. Préparer un plat de 10 cm pour chaque deux cerveaux plus un plat supplémentaire de 6 cm.
  3. Placer jusqu'à 2 cerveaux dans chaque plat de2 10 cm (Figure 2 a).
  4. Sous le microscope à dissection, utilisez courbes et droites pinces pour séparer le cortex le long de la ligne médiane et le cervelet avec le tronc cérébral. Cela donne trois sections de tissu par le cerveau (Figure 2 b).
  5. Peler la couche mince et translucide, (méninges) de tissu contenant les vaisseaux sanguins de chacune des sections de tissu et de jeter, transférant les tissus restants dans une boîte de Petri séparées. Saisir les couches minces exposés par les coupes de tissus, avec la pince et tirez doucement jusqu'à ce que les grandes sections sont « accroché » le tissu cérébral. Enfin enlever cette partie en tirant doucement. Voir la Figure 2-2E pour des images représentatives d’avant, pendant et après cette étape.
  6. Dans une armoire de biosécurité, retirez le HBSS restants de la boîte de Petri, conservant avec soin le tissu. Faire macérer le tissu avec un scalpel et transfert tissu au tube préchauffé 15 mL avec de la trypsine.
  7. Incuber à ce tube pendant 25 min dans un bain de 37 ° C pour digérer les tissus par voie enzymatique.
  8. Centrifuger le tube vers le bas à 500 g pendant 2 min à température ambiante et versez le liquide surnageant.
  9. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 10 mL de chaud DMEM/F12 pour inactiver la trypsine et triturer la solution 5 fois pour briser le tissu.
  10. Centrifuger le tube vers le bas à 500 g pendant 2 min à température ambiante et versez le liquide surnageant.
  11. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM chaud/F12 et transvaser la solution dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
  12. À l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 18 calibre, triturer la solution 3 fois.
  13. Distribuer cette solution en incréments de 12,5 mL de DMEM chaud/F12 par le cerveau.
  14. Pipetter par incréments de 1 mL de la solution triturée dans une plaque 12 puits (1 par le cerveau).
  15. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2dans un incubateur de culture cellulaire humidifié. Remplacer le support après trois jours et rafraîchir les médias tous les trois jours suivants. Après 2 semaines, les cellules peuvent être collectées pour des expériences.

2. macromère synthèse69

  1. Peser les 375 mg de sel de l’acide hyaluronique (HA) dans un tube à centrifuger conique 50 mL et ajouter 37,5 mL d’eau distillée.
  2. Rincer la solution avec un vortexer pendant 1 min et laisser agir le mélange jusqu'à ce qu’il semble homogène et perd sa viscosité gélatineuse. Ce processus peut prendre de 6 h.
  3. Transférer de solution dans un bécher de 100 mL avec un magnétique remuer bar (38 mm) et agiter vigoureusement à la température ambiante.
  4. Soigneusement titrer 5,0 M NaOH dans le mélange HA et mesure avec du papier pH que le pH se stabilise entre 8 et 12.
  5. Collecter 3 mL d’anhydride méthacrylique fraîches (MA, 94 %), ont recouvert par l’azote pendant le stockage.
    NOTE : MA est exposée à l’atmosphère de longue durée (jours), il perdra sa réactivité.
    ATTENTION : Toute utilisation de MA doit être faite sous une hotte.
  6. Ajouter 200 µL de la solution HA mélange de MA. La réaction abaisse le pH de la solution à moins 8.
  7. Répétez les étapes 2.4 à 2.6 jusqu'à ce que les 3 mL de MA ont été ajoutés à la solution. Ce processus peut prendre jusqu'à 1-2 h.
  8. Permettre la réaction de continuer toute la nuit à 4 ° C, sans mélange.
  9. Transférer la solution à 400 mL d’éthanol froid (EtOH) dans un bécher de 500 mL et permettre les précipitations pendant 24 à 72 h à 4 ° C. 56
  10. Soigneusement décanter la majeure partie de la solution dans un bécher distinct pour l’élimination et recueillir le précipité dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Cela peut être distribué en 2 à 4 tubes, si nécessaire.
  11. Centrifuger les tubes à 200 x g dans une centrifugeuse pendant 2 min à température ambiante et éliminer le surnageant.
  12. Remplir le tube avec EtOH froid, mélanger la solution avec un vortexer pendant 1 min et répétez l’étape 2.10-2.11.
  13. Ajouter 25 mL d’eau désionisée stérile, mélanger la solution avec un vortexer pendant 1 min, soniquer (> 20 kHz) pendant 1 h et incuber une nuit à 4 ° C.
  14. Placer la solution dans un congélateur à-80 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que congelés ou flash congélation dans l’azote liquide.
    ATTENTION : Lors de l’utilisation de l’azote liquide, utilisez des gants de protection, un masque et un tablier.
  15. Geler sec le tube (en dessous de 0,1 mBar et -30 ° C) pendant 24 à 48 heures une poudre de neige semblable est produite.
  16. À ce stade, analyser l’échantillon pour la pureté par la résonance magnétique nucléaire 1H, où la quantité de protons de méthacrylate (pics à 6,1 et 5,6 ppm), par rapport aux protons méthyliques (1,9 ppm), du squelette de HA peut être confirmée. Un ratio minimum de méthacrylate de 95 % aux protons méthyliques est acceptable. 69

3. gel Formation et Encapsulation 3D65

  1. Lamelle couvre-objet et préparation du moule
    1. Préparer une solution d’eau de 50 mL eau distillée de 2 % 3-(triméthoxysilyl) méthyle propyle dans un tube à centrifuger conique 50 mL.
    2. Place 18 mm verre couvre-objet dans la solution et rock pendant 1 h à température ambiante. Jusqu'à 50 lamelles peuvent être ajoutés à la fois.
    3. Rincer les lamelles couvre-objet en plongeant en série chacun dans 3 Béchers de 100 mL d’eau désionisée.
    4. Sécher les lamelles dans le vide à 40 ° C durant la nuit avec un dessiccateur et four.
    5. Plonger rapidement les lamelles individuelles dans 70 % EtOH avec une pince.
    6. Sans la dessécher, déposez chaque lamelle dans un puits d’une plaque bien 12.
    7. Laver et aspirer chaque puits avec de l’eau désionisée stérile (1 mL / puits).
    8. Ajouter 1 mL de stérile 2 µg/ml poly-L-lysine (PLL) dans chaque puits et incuber pendant > 2 h.
    9. Aspirer la solution PLL et permettre les lamelles à l’air sec.
    10. Plonger les moules de siloxane (PDMS) polydiméthylsiloxanes (voir Figure 1) chez 70 % EtOH et place l’une sur le centre de chaque lamelle et laisser sécher à l’air et créer un joint entre le moule et le verre.
      1. Préparer les moules PDMS en castant PDMS prémélange réactifs dans un ratio de 10:1 dans un récipient à fond plat en polystyrène. La quantité de PDMS préparé est sélectionnée pour produire une feuille environ 1 mm d’épaisseur. Aux puits de forme dans le PDMS, couper les feuilles avec un poinçon cercle avec un diamètre intérieur de 10.
  2. Préparation de cellules
    Remarque : Toutes les étapes décrites dans le protocole sont effectuées avec la technique stérile dans une armoire de sécurité biologique. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est ajustée à pH 7,4 pour toutes les étapes.
    1. 24 h avant l’encapsulation de cellules à HAMA, actualiser le support pour les cultures primaires de 2 semaines (à partir de 1.15 étape) dans les 12 plaques bien. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 (10 % de SVF et 1 % de PS) moyen / puits.
    2. Pour chaque plaque de 12 puits de cellules préparer 12,5 mL de trypsine diluée (0,25 % trypsine-EDTA dilué 30 % avec les médias DMEM/F12) et 25 mL DMEM/F12 (PS de SVF et 1 % de 10 %) et au chaud à 37 ° C dans un bain d’eau.
    3. Recueillir le milieu conditionné de plaques à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL (> 0,5 mL par puits), soigneusement aspirer le liquide restant et remplacer par 1 mL par puits de trypsine diluée (0,075 % trypsine-EDTA) pendant 20-30 min dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) jusqu’au la couche de cellules confluentes se détache de la plaque.
    4. Récupérer le matériel de suspension cellulaire avec une pipette de 1 mL (apparaît comme une pièce flottante) et de recueillir dans un tube à centrifuger conique 15 mL. Diluer dans un volume équivalent de DMEM/F12 (10 % SVF et 1 % PS) et centrifuger à 200 x g pendant 2 min à température ambiante, jeter le surnageant.
    5. Remettre le culot dans 10 mL chaud DMEM/F12 (10 % SVF et 1 % PS), triturer les cellules 5 fois avec une pipette de 10 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min.
    6. Décanter le liquide surnageant, remettre en suspension les cellules dans 5 mL chaud DMEM/F12 et transférer les cellules dans un tube à centrifuger conique 50 mL.
    7. À l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 18 calibre, triturer la solution cellulaire 3 fois et filtrer la suspension à travers un tamis de cellule de 40 µm dans un nouveau tube à centrifuger conique.
    8. Collecter 10 µL de la suspension cellulaire, diluer 1/100 à chaud DMEM/F12 et nombre de cellules avec un compteur de cellules automatisées
    9. Incuber dans un bain-marie à 37 ° C avant l’étape de l’encapsulation.
  3. Encapsulation de cellules
    Remarque : Toutes les étapes décrites dans le protocole sont effectuées avec la technique stérile dans une armoire de sécurité biologique.
    1. Pour chaque plaque de 12 puits de 3D hydrogels chaud 12,5 mL de DMEM/F12 et 12,5 mL des milieux conditionnés de DMEM/F12 recueillies au cours de la préparation de cellules.
    2. Peser la quantité de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) nécessaire à une concentration finale de 0,5 % wt/vol dissoudre cette HAMA dans une solution PBS stérile filtrée à une concentration de (2 % wt/vol) ; une concentration 4 fois supérieure à la concentration finale est utilisée pour tenir compte de l’ajout de cellules et d’autres réactifs. Une plaque de puits 12 des hydrogels requiert ~ 350 µL PBS avec 7 mg HAMA.
    3. Soniquer (> 20 kHz) des solutions jusqu'à ce que HAMA est entièrement dissous pendant 60 min.
    4. Préparer des solutions individuelles de 10 % de triéthanolamine (TEA) et 1-vinyl-2-pyrrolidone (NVP) et une solution de 1 mM d’éosine Y (EY) dans 1 ml de PBS stérile pH 7,4.
    5. Pour une 12 plaque bien, faire un final 1,4 mL d’un mélange de 1 x 107 cellules, 0,5 % wt/vol HAMA (350 µL de 2 % wt/vol), 0,1 % thé (14 µL de 10 %), 0,1 % NVP (14 µL de 10 %) et de 0,01 mM EY (14 µL de 1 mM) et le mélange de la lame basale de 20 % (280 µL de stock). Le volume restant est de PBS.
    6. Mélanger la solution en douceur et distribuer 100 µL dans chaque moule PDMS avec une pointe de 1 mL.
    7. Exposer des échantillons à un voyant vert de forte intensité (~ 520 nm, 60 mW, dans un clos 20 x 20 cm x 20 cm boîte) pendant 5 min à température ambiante.
    8. Ajouter 1 mL par puits de chaud conditionné DMEM/F12 dans une assiette bien 12.
    9. Saisir chaque lamelle couvre-objet entre le pouce et l’index, lentement décoller le moule PDMS avec pincette courbée en veillant à ne pas déplacer le gel et placez-le dans un puits avec un milieu conditionné.
    10. Ajouter 1 mL supplémentaire chaud DMEM/F12 dans chaque puits.
    11. Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 semaines, rafraîchissant milieux cellulaires chaque semaine par pipetage 1 mL de médias de chaque puits et remplacez-les par 1 mL DMEM/F12.

4. microscopie

  1. Immunocytochimie
    Remarque : Un microscope confocal inversé a été utilisé pour l’image de ces échantillons et ImageJ a été utilisé pour traiter et afficher les images. Seront étiquetés microglie, les astrocytes, les oligodendrocytes et les noyaux, après 3 semaines dans la culture de HAMA.
    1. Préchauffer 10 % de formol tampon PBS (pH 7.0) dans un bain à 37 ° C.
      ATTENTION : Bien que le formol peut être utilisé à l’extérieur de la hotte, ce matériau réagit avec les tissus et devrait être manipuler avec soin et gants toujours. Il faut disposer séparément.
    2. Soigneusement aspirer médias les plaques et la pipette 1 mL de formol 10 % dans chaque puits.
    3. Incuber les plaques à 37 ° C dans un 5 % CO2 pendant 20 min.
    4. Aspirer le liquide de chaque plaque, pipette de 2 mL de PBS (pH 7,4) dans chaque puits et incuber pendant 15 min.
    5. Répétez l’étape 4.1.4 deux fois.
    6. Aspirer le liquide sur les plaques et ajouter 1 mL par puits de PBS avec 10 % de sérum de cheval normal (NHS) et 0,5 % triton X-100 en faisant doucement tourner à vitesse minimum) pendant 1 h.
    7. Répétez l’étape 4.1.4 trois fois.
    8. Aspirer le liquide et ajouter 1 mL par puits du mélange suivant dans du PBS : lapin ionisé liant le calcium adaptateur molécule (Iba1) 1:1, 000, poulet protéine fibrillaire gliale (GFAP) 1:5, 000, souris 2', 3'-cyclique-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1 / 1 000, 1 % NHS , et 0,1 % de cellules perforante agent tensio-actif. Incuber à 4 ° C durant la nuit, la plaque à bascule aussi doucement que possible.
    9. Répétez l’étape 4.1.4 trois fois avec les incubations de 1 h entre les deux.
    10. Aspirer le liquide et ajouter 1 mL par puits du mélange suivant dans du PBS : 647 nm excité âne anticorps de anti-lapin 1 : 200, 546 nm excité chèvre anticorps anti-poulet 1 : 200, 488 nm excité âne anticorps anti-souris 1 : 200, NHS de 1 %, 1 : 1 000 bleuissement nucléaire. Incuber à température ambiante pendant 1 h, poussant doucement la plaque.
    11. Répétez l’étape 4 trois fois avec les incubations de 1 h entre les deux.
    12. Afin de préserver les hydrogels, aspirer le tampon et immerge-les dans 0,5 mL de milieu de montage des cellules pour 1 min. Pipette sur le milieu de montage et placer délicatement un lamelle couvre-objet surface du gel, créant une couche entre le verre. Ajouter une petite quantité de milieu de montage sur le côté non couvert les lamelles pour éviter le dessèchement de l’hydrogel.
      Remarque : Pour des fins de dépannage, gels peuvent être photographiées à étape 4.1.11. pour voir un étiquetage approprié avant traitement ultérieur.
  2. Microscopie électronique à balayage (SEM)
    NOTE : Pour visualiser l’hydrogel, un microscope électronique à balayage a été utilisé pour l’image de ces échantillons.
    1. Préchauffer un mélange fixateur de paraformaldéhyde glutaraldéhyde et 2 % à 2,5 % dans du PBS (0,1 M) dans un bain-marie à 37 ° C.
      ATTENTION : Ces réactifs sont très réactives avec les tissus et doivent être manipulés avec soin et gants. Ils devraient être sous une hotte autant que possible les spécimens et séparément.
    2. Aspirez le milieu à partir des plaques de culture cellulaire et ajouter 1 mL du mélange fixateur préchauffé.
    3. Incuber les plaques à 37 ° C dans un 5 % CO2 pendant 20 min.
    4. Placer les plaques à 4 ° C (réfrigérateur/glacière) du jour au lendemain.
    5. Aspirer la solution de fixation par les puits et ajouter 1 mL de PBS.
    6. Aspirer le liquide de chaque plaque, ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits et incuber pendant 15 min.
    7. Répétez l’étape 4.2.6 deux fois plus.
    8. Aspirer le PBS et ajouter 1 mL de tétraoxyde d’osmium 1 % tamponné dans du PBS à chaque puits.
      NOTE : Jusqu'à ce que les échantillons sont séchés, cette étape et toutes les étapes subséquentes sont effectuées sous une hotte.
    9. Permettre la fixation de se produire pour vapeur d’Osmium 30 min. de liquide peut fixer les autres échantillons dans la même assiette ; par conséquent, partition échantillons en conséquence avant cette étape.
      ATTENTION : Le tétraoxyde d’Osmium est hautement réactif avec tissus et volatile. Il est dangereux et doit être manipulé sous la hotte avec des gants. Il et tout immédiatement lavés devrait être cédées séparément.
    10. Répétez l’étape 4.2.6 trois fois.
    11. Aspirer le liquide et ajouter les mélanges de déshydratation dans la liste ci-dessous, dans l’ordre et incuber (température ambiante) pour l’heure indiquée. Commencez par ajouter progressivement de l’éthanol (EtOH) suivi ensuite hexaméthyldisilazane (HMDS). Voir le tableau 2 pour chaque incrément.
      Remarque : Lorsque vous ajoutez le HMDS, les lamelles peuvent fortement adhérer au plastique et deviennent très difficiles à enlever. Ceci peut être évité en plaçant une petite plate-forme en plastique sous le feuillet de verre après la première application du HMDS. Après la seconde incubation EtOH, l’échantillon peut être souscrite et trempé dans l’azote liquide pendant quelques secondes pour geler la fracture de l’échantillon.
    12. Retirez les échantillons séchés délicatement et monter les échantillons sur les talons de microscope électronique à balayage à ruban conducteur double face.
    13. Par pulvérisation cathodique enduire les échantillons avec un montant minimum de l’or. Placer les échantillons dans un support et d’actionner la machine pendant 2 min à 15 mA.

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Résultats

Pour modéliser la réponse de l’hôte tissu neural et la cicatrice gliale dans un haut débit, système in vitro nécessite un échafaudage de cellule 3D avec un matériel de matrice qui est biocompatible, n’engage pas un événement cytotoxique durant la formation in situ et est modifiable avec les composants bioactifs pour guider l’intervention bienveillante. À cette fin, nous avons créé un système d’échafaudage de cellule 3D basé sur l’acide hyaluronique et encapsulé une popul...

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Discussion

L’objectif de générer un système de culture 3D pour modèle bioreactivity gliales et le processus de cicatrisation glial, nous avons développé un système qui peut prendre en charge primaire des microglies culture, astrocytes et oligodendrocytes et permet la caractérisation robuste de cellule interactions cellule-cellule et de la morphologie. De la microscopie montré, la morphologie de chaque type de cellule a été distinctement différente avec plates-formes mélange 2D, 3D-HAMA et 3D lamina HAMA-basale. Dans le système 2D, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du CRSNG, FCI, AIHS, Alberta Health Services et la dotation de Davey pour la recherche sur le cerveau.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1. Matériaux pour la synthèse et la photopolymérisation HAMA
Acide hyaluronique (HA)Sigma-Aldrich53747-10GStreptococcus equi, MW : 1.5 - 1.8 X 10^6
Anhydride méthacrylique (MA)Sigma-Aldrich275585-100ML
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-Aldrich221465-25G
Éthanol (EtOH)Alcools commerciaux Inc.
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate anhydre (pH 7,4)Fisher Scientific18912014
Triéthanolamine (TEA)Sigma-Aldrich90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)Sigma-AldrichV3409-5G
EosinY (EY)Sigma-AldrichE6003-25G
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Kit élastomèreDow Corning
3-(Trimethoxysilyl)méthacrylate de propyleSigma-Aldrich440159-100ML
Bécher (100 mL)Bécher Corning1000-100
(500 mL)Papier pHCorning 1000-600
(Labstick)Sigma-Aldrich9580
Nom< strong>EntrepriseNuméro de catalogueComments
2. Matériaux pour l’isolement des cellules gliales et la culture cellulaire
P1-2 Rateaux Sprague Dawley RatiersCharles RiverCD Sprague Dawley code de souche 001
Ciseaux Dissector - lames minces (petites)Outils de science fine14081-09
Ciseaux chirurgicaux - Toughcut (grand)Outils de science fine14130-17
Pince fine (Dumont #5)Outils de science fine11521-10
Pince fine incurvée (Dumont #7)Outils de science fine11271-30
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)Gibco14170-112
Mélange de nutriments d’Eagle modifié de Dulbecco et de Ham F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Pénicilline-streptomycine (PS)Gibco15140-122
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco12483-020
Trypsine-éthylènediaminetétraacétique à 0,25 % (EDTA)Gibco25200-072
Poly-L-lysine (PLL)Sigma-AldrichP-6282
Tube à centrifuger conique de 50 mLFisher Scientific05-539-13
Tube à centrifuger conique de 15 mLFisher Scientific05-539-5
Plaques traitées pour culture tissulaire 12 puits (Cellstar)Greiner Bio-One665 108
Pipette sérologique 10 mLFisher Scientific13-676-10F
Pipette sérologique 25 mLFisher Scientific12-676-10K
Boîte de Pétri (60 mm X 15 mm)deFisher Scientific
100 mm X 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
Microscope Coverslip (18 mm)Fisher Scientific12-545-100 18CIR
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
3. Matériaux pour la microscopie (microscopie confocale et électronique à balayage)
Souris monoclonale anti-CNPaseabcam ab6319
Lapin anti-Iba1Wako Laboratory Chemicals019-17741
Poulet anti-GFAPabcamab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluoromount-GFisher Scientific00-4958-02
FormalinSigma AldrichHT501128-4LTamponné (10 %)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
Sérum de chevalGibco16050-122
ParaformaldéhydeMicroscopie électrique Sciences157-8Tamponné (8 %)
GutéraldéhydeElecton Microscopy Sciences16019Buffered (8 %)
Tétraoxyde d’osmiumElecton Microscopy Sciences19152Buffered (2 %)
Hexamethyldilazane (HMDS)Electon Microscopy Sciences16700
Ethanol (EtOH)Electon Microscopy Sciences15055anhydre
(25 x 75 x 1 mm)VWR International48311-703
Boîte Pétri FB0875713A ( Lame de microscope

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