Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

Résumé

Biomatériaux dopé avec Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) ont servi d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir des fractures osseuses non syndiqués. Pour surmonter les effets secondaires résultant d’une incontrôlable libération du facteur, nous proposons une nouvelle stratégie au site-immobiliser directement au facteur, créant ainsi des matériaux avec des capacités améliorées d’ostéogéniques.

Résumé

Différentes stratégies thérapeutiques pour le traitement des défauts d’os longs non-guérison ont été intensivement étudiées. Actuellement utilisé traitements présentes plusieurs limites qui ont conduit à l’utilisation des biomatériaux en combinaison avec les facteurs de croissance ostéogéniques, tels que les protéines morphogénétiques osseuses (PGB). Méthodes couramment utilisées, absorption ou encapsulation requièrent des quantités supra-physiologique de BMP2, qui généralement donne un effet de sortie dite éclatement initial qui provoque plusieurs effets secondaires indésirables graves. Une stratégie possible de surmonter ces problèmes serait de façon covalente coupler la protéine à l’échafaud. En outre, couplage doit être effectuée d’une manière spécifique afin de garantir un résultat reproductible produit. Par conséquent, nous avons créé une variante de la BMP2, dans lequel un aminoacide artificiel (propargyle-L-lysine) a été introduit dans la partie mature de la protéine BMP2 par l’expansion de son utilisation de codon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk a été couplé à des perles fonctionnalisés par cycloaddition cuivre azoture-alcyne catalysée (CuAAC). L’activité biologique de la BMP2-K3Plk couplé a été prouvée in vitro et l’activité ostéogénique des perles BMP2-K3Plk-fonctionnalisés a été prouvée dans des essais sur des cellules de base. Les perles fonctionnalisés en contact avec les cellules C2C12 étaient capables d’induire l’expression de la phosphatase alcaline (ALP) localement limitée près du talon. Ainsi, fonctionnalisés échafaudages peuvent être produites par cette technique, qui peut déclencher la différenciation des cellules vers une lignée ostéogénique. En outre, des doses plus faibles de BMP2 sont suffisantes en raison de l’orientation contrôlée du BMP2 couplés dirigée. Avec cette méthode, les PGB est toujours exposés à leurs récepteurs sur la surface de la cellule dans l’orientation appropriée, ce qui n’est pas le cas si les facteurs sont couplés via des techniques de couplage non-dirigée. Le résultat produit est très contrôlable et, ainsi, résultats en matériaux dotés de propriétés homogènes, améliorer leur applicabilité pour la réparation de taille critique OS défauts.

Introduction

Le but ultime de la régénération de génie et d’os tissulaire osseuse est de surmonter les inconvénients et les limites qui se produisent durant les traitements courants des fractures non syndiqués. Auto - ou allo-greffes sont utilisés principalement comme des stratégies de traitement actuelles, même s’ils ont plusieurs inconvénients. La greffe osseuse idéale doit inciter l’ostéogénèse par Ostéoinduction ainsi qu’osteoconduction, ce qui entraîne l’ostéointégration de la prothèse dans l’OS. De nos jours, seulement auto-transplantation est considérée comme le « gold standard » puisqu’elle offre toutes les caractéristiques d’un greffon osseux idéal. Malheureusement, il présente aussi des aspects négatifs importants, tels que la chirurgie long temps et un second site de traumatisme qui généralement entraîne plus de complications (par exemple, la douleur chronique, formations de l’hématome, infections, défauts cosmétiques, etc.). Les greffes allogènes, ont en revanche sous-optimale caractéristiques pour tous les aspects généraux¹. Technologies de greffe d’OS alternatifs ont été améliorées dans les dernières années, dans le but de produire des échafaudages ostéo-inducteurs, ostéoconducteur, biocompatible, et biorésorbables. Étant donné que nombreux biomatériaux ne présente pas toutes ces caractéristiques ostéogéniques, différents facteurs de croissance, principalement la BMP2 et la BMP7, ont été incorporés afin d’améliorer le potentiel ostéogénique de l' échafaudage particulier².

Comme un critère essentiel, ces vecteurs de facteur de croissance devrait fournir une dose contrôlée de libération au fil du temps afin de faciliter les événements essentiels comme la cellule recrutement et attachement, interposition cellulaire et l’angiogenèse. Cependant, PGB ainsi que d’autres facteurs de croissance ostéogéniques ont été généralement immobilisés façon non covalente³. Techniques de piégeage et d’adsorption nécessitent l’utilisation de quantités supra-physiologique de protéine suite à un communiqué de l’éclatement initial, qui entraîne des inconvénients graves in vivo, affectant généralement les tissus environnants en induisant la prolifération osseuse, ⁴ostéolyse, gonflement et l’inflammation. Ainsi, le maintien de facteurs de croissance sur le site de livraison pour des périodes plus longues sont possibles par des méthodes d’immobilisation covalente. Chimiquement modifiées BMP2 (succinylé⁵, acétylés⁶ ou biotinylé⁷), ingénierie des hétérodimères⁸ou BMP2 oligopeptides dérivées⁹ ont été conçues et utilisées pour surmonter les limitations liées à absorption. Toutefois, la bio-activité de ces constructions n’est pas prévisible puisque l’arrangement potentiellement inhibe la liaison du ligand immobilisé sur les récepteurs cellulaires. Comme indiqué précédemment, il est essentiel que tous les quatre chaînes de récepteurs impliqués dans la formation des complexes activés ligand-récepteur interagissent avec la BMP2 immobilisée afin d’activer pleinement tout en aval de cascades signalisation¹⁰.

Pour surmonter les problèmes de l’issue de produits non homogènes avec des limitations en termes de bioactivité, stabilité et la biodisponibilité du facteur "immobilisé", nous avons conçu une variante BMP capable de se lier par covalence échafaudages de façon dirigée. Cette variante, appelée BMP2-K3Plk, comprend un acide aminé artificiel qui a été présenté par codon génétique expansion¹¹. Cette variante a été liée avec succès pour les échafaudages en utilisant une stratégie de couplage covalent tout en conservant son activité biologique.

Protocole

1. production de la BMP2 variante BMP2-K3Plk

1. Clonage de BMP2-K3Plk par mutagénèse dirigée par PCR ¹²
   1. Amplifier la BMP2 maturité humaine (hmBMP2) d’un vecteur de p25N-hmBMP2 (voir la Table des matières) avec une amorce vers l’avant (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') et une amorce de marche arrière (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') présentant une (de codon stop ambre TAG) à la position de la lysine première partie mature BMP2´s. Effectuer la réaction de PCR à l’aide de 33,5 µL d’H₂O, 10 µL du mélange de réaction PCR, 1,5 µL de solution stock de 10 µM dNTP, 1,5 µL d’apprêt avant (10 pmol/µL), 1,5 µL d’apprêt inverse (10 pmol/µL), 1 µL de p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) et 1 µL de l’ADN polymérase (voir Table des matières) dans un thermocycleur (dénaturation à 95 ° C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 1 min, recuit à 60 ° C pendant 1 min, allongement à 72 ° C pendant 1 min et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min).
   2. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit disponible dans le commerce suite aux recommandations du fabricant (voir Table des matières).
   3. Digérer le produit PCR avec l’enzyme Ndel à 37 ° C pendant 45 min à l’aide de 16 µL d’H₂O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver l’enzyme à 65 ° C pour 5 min. digérer le produit PCR avec les enzymes de restriction BamHI à 37 ° C pendant 1 h à l’aide de 16 µL d’H₂O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver les enzymes à 80 ° C pendant 5 min.
   4. Digérer le vecteur de pET11a-pyrtRNA avec Ndel à 37 ° C pendant 2 h et 45 min en utilisant 16 µL d’H₂O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng / µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver à 65 ° C pour 5 min. digérer le vecteur de pET11a-pyrtRNA avec BamHI à 37 ° C pendant 1 h à l’aide de 16 µL d’H₂O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver à 80 ° C pendant 5 min.
   5. Séparer le vecteur digéré de vecteur non digéré et restes de digestion par agarose gel électrophorèse (0,8 % d’agarose, 60 min à 100 V). Ligaturer l’insert BMP2-K3TAG digérée avec backbone digérées pET11a-pyrtRNA à température ambiante (RT) pendant 2 h à l’aide de 100 ng d’épine dorsale pET11a-pyrtRNA et 34,5 ng de BMP2-K3TAG insert (rapport molaire de 1:3). Le mélange réactionnel contient le squelette de l’ADN et insert, 2 µL de tampon de ligase, 1 µL de DNA ligase et H₂O pour un volume total de 20 µL.
   6. Exécuter une transformation Co de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk et le pSRF-Duo-pyrtRNAsynth chez les bactéries BL21 (DE3) :
      1. Ajouter 50 ng de chaque plasmide aux bactéries, placer le mélange sur la glace pendant 30 min, un choc thermique à 42 ° C pendant 50 s, placer sur la glace pendant 5 min, ajouter 500 µL de milieu lysogénie bouillon (LB) dans le mélange et la secouer à 300 tr/min pendant 60 min.
      2. Propagation de 100 µL du mélange bactérien sur préchauffé kanamycine (50 µg/mL) / plaques d’ampicilline (100 µg/mL) et incuber une nuit à 37 ° C.
2. Expression et Purification de BMP2-K3Plk ^{13 , 14}
   1. Propager une seule colonie pendant la nuit dans 50 mL de milieu LB avec 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline à 37 ° C.
   2. Diluer une nuit cultures 01:20 dans 800 mL de milieu de formidable bouillon (TB) additionné de 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et se développer à 37 ° C jusqu'à atteindre une OD₆₀₀ de 0,7. Ajouter propargylique-L-lysine à une concentration finale de 10 mM. Prélever un échantillon µL 100 de la culture avant l’induction isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
   3. Induire l’expression des gènes par l’addition d’IPTG à une concentration finale de 1 mM. Cultiver la culture à 37 ° C pendant 16 h dans un agitateur orbital à 180 tr/min. Prélever un échantillon de 100 µL de la culture.
   4. Centrifuger à toute la culture à 9000 g pendant 30 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot bactérien dans 30 mL de tampon TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM) à 1/1000 (v/v) 2-mercaptoéthanol (fraîchement ajouté).
      ATTENTION : Poignée 2-mercaptoéthanol sous la hotte. Éviter tout contact avec la peau et les yeux. Évitez l’inhalation de vapeur ou de brouillard. Effectuez toutes les étapes de la remise en suspension avec des tampons contenant du 2-mercaptoéthanol sous la hotte.
   5. Peser un gobelet vide centrifuge et transvaser l’extrait concentré dans le récipient vide. Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le bécher avec le culot. Soustraire le poids du gobelet vide pour calculer le poids du projectile.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Congeler le culot à-20 ° C à court terme ou à-80 ° C à long terme. En reprenant le protocole, décongeler le culot à température ambiante.
   6. Resuspendre le culot dans un tampon STE (10 mM Tris pH 8,0 ; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, saccharose 375 mM, 1/1000 (v/v) 2-mercaptoéthanol (fraîchement ajouté)). Utiliser 200 mL de tampon STE par 10 g de granulés.
   7. Laisser agir la suspension sur la glace (10 min à 40 impulsions s, 20 s frein et amplitude de 30 %). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot. Répétez les étapes sonication et centrifugation 4 fois.
   8. Resuspendre le culot dans 100 mL de tampon TBS (10 mM Tris, NaCl 150 mM). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et pèsent pellet.
   9. Resuspendre le culot dans un tampon nucléase (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) avec fraîchement ajouté 80 U/mL une nucléase (p. ex., Benzonase) à l’aide de 10 mL/g de granulés. Incuber la suspension du jour au lendemain à ta sur un plateau vibrant (30 tr/min).
   10. Ajouter le tampon Triton (60 mM EDTA, 1,5 M de NaCl, 6 % (v/v) 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol) à la suspension. Le volume de tampon Triton pour ajouter correspond à une partie de volume 0,5 de la suspension. Incuber pendant 10 min à RT (sans remuer). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot.
   11. Resuspendre le culot dans tampon TE (100 mM Tris, EDTA de 20 mM) à l’aide de 8 mL/g de granulés. Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot.
   12. Resuspendre le culot en ajoutant 4 mL/g de 25 millimètres NaAc pH 5.0 et 5 mL/g de 6 M GuCl avec 1 mM le dithiothréitol (DTT) (fraîchement ajouté). Incuber la suspension pendant la nuit à 4 ° C sur une plaque en remuant (30 tr/min).
   13. Centrifuger à 75 500 x g pendant 20 min. Le surnageant contient maintenant la protéine BMP2 monomère dépliée. Récupérer le surnageant et le concentré de cet extrait à 20 OD/mL à l’aide d’une membrane de coupure (MWCO) de poids moléculaire 3 kDa dans une concentration de cellules (voir Table des matières).
   14. Ajouter les monomères concentrés en gouttes unique dans la mémoire tampon de Renaturation (2 M LiCl, 50 mM Tris, CHAPS de 25 mM, 5 mM EDTA, le disulfure de glutathion (GSSG), de 1 mM 2 mM glutathion (GSH)) en remuant (30 tr/min). Incuber à RT pendant 120 heures dans l’obscurité.
       Remarque : au cours de cette période d’incubation, repliement survient. La solution de cette étape, contient la BMP2-K3Plk dimère plié.
   15. Ajuster le pH de la solution de 3.0 à l’aide de concentré HCl. Dialyze la solution contre 1 mM HCl concentré la solution dialysée en utilisant une membrane de coupure (MWCO) de poids moléculaire de 10 kDa dans une cellule de concentration.
   16. Equilibrer la solution en ajoutant le tampon un (NaAc, 30 % isopropanol 20 mM). Ajouter un volume de tampons A correspondant à un volume de 30 % de la solution. Centrifuger la solution à 4700 x g pendant 15 min.
   17. Equilibrer la colonne échangeuse d’ions sur un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide¹⁵ avec 150 mL de tampon A. charge la solution de protéines sur la colonne du milieu. Éluer les fractions à l’aide d’un dégradé linéaire de tampon B (20 mM NaAc, 30 % isopropanol, 2 M NaCl) à l’aide de 100 mL de fractions de tampon B. collecter 2 mL.
       NOTE : Concentrer la protéine avant le chargement à la colonne en fonction du volume total de la colonne. Le volume final de protéine doit être < 5 % du volume total de la colonne.
   18. Analyser les 20 µL de chaque fraction en SDS Polyacrylamide gel (12 %) l’électrophorèse (SDS-PAGE) ¹⁶ et coloration bleu de Coomassie brillant bleu¹⁷ (voir Table des matières).
       Remarque : Le bleu de Coomassie brillant bleu teinté de fractions de spectacles gel SDS-PAGE contenant des dimères (26 kDa) et des fractions contenant des monomères (13 kDa).
   19. Fractions contenant des dimères de piscine. Dialyser le pool du dimère contenant des fractions de nuit à 4 ° C, contre 1 mM HCl (contenance de 5 litres). Concentrer le produit final en utilisant un kDa 10 unité de filtration centrifuge de concentration (voir Table des matières). Analyser le produit final par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (12 %) de la SDS (SDS-PAGE) et coloration brillante bleu de Coomassie.
       Remarque : La bande sur le bleu de Coomassie brillant bleu teinté SDS-PAGE gel devrait montrer qu’une bande de 26 kDa. C’est le produit final de la BMP2-K3Plk.

2. optimisation de cuivre (I)-catalysée de l’Azide-alcyne Cycloaddition (CuAAC) Conditions

1. Effet de l’ascorbate de sodium (NaAsc) et le sulfate de cuivre (II) (CuSO ₄ ) _{sur wild type BMP2 (BMP2-WT)}
   1. Incuber 20 µM BMP2-WT avec différentes proportions de NaAsc à CuSO₄. Utiliser 0,5 mM NaAsc et 0,5 mM CuSO₄ (à partir de concentration) dans un volume de 50 µL. Procéder avec les ratios suivants de NaAsc à CuSO₄: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20 : 1), gardant la CuSO₄ concentration constante à 0,5 mM et ajustement de la concentration de NaAsc en conséquence. Effectuer la réaction en H₂O sur un mélangeur rotatif (20 tr/min) pendant la nuit à température ambiante.
   2. Préparer les échantillons réduites par l’ajout de mémoire tampon de chargement contenant 5 % de 2-mercaptoéthanol et incuber échantillon à 95 ° C pendant 6 min. Analyze réduits et des échantillons non réduits par SDS Polyacrylamide gel électrophorèse (12 %) (SDS-PAGE) et coloration bleu de Coomassie brillant bleu. Le Coomasie teinté gels SDS-PAGE montrent des bandes dans la gamme de 13 kDa (conditons réduite) à 26 kDa et de poids moléculaire plus élevé (conditions non réduits).
2. Effet de Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) sur la réaction de CuAAC
   1. Incuber 20 µM BMP2-K3Plk avec différentes proportions de THPTA à CuSO₄. Utilisez 5 mM NaAsc et 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarine (Gardez NaAsc et 3-Azido-7-hydroxycoumarine constant). Utilisez 50 µM THPTA et 0,5 mM de CuSO₄ comme concentration de départ. Utiliser les différentes proportions de THPTA à CuSO₄: (7:1) ; (10:1) ; (12:1) ; (15 / 1) ; (20:1). effectuer la réaction en H₂O (volume total 50 µL) pendant 24 h à RT sur un mélangeur rotatif (20 tr/min).
   2. Après accouplement, 3-Azido-7-hydroxycoumarine devient un colorant fluorescent. Préparer les échantillons dans des conditions de réduction et non réduits et les analyser par SDS-PAGE. Visualiser les gels sous le canal de l’excitation avec la longueur d’onde spécifique pour le 3-Azido-7-hydroxycoumarine (λ_abs = 404 nm, λ_em = 477 nm).

3. Technique de couplage covalents de BMP2-K3Plk à l’Azide fonctionnalisés Agarose perles

1. Incuber 20 µM de BMP2-K3Plk ou BMP2-WT (utilisé comme contrôle négatif) avec 20 µL d’azoture-activé d’agarose perles dans un volume total de 500 µL de tampon de réaction (0,1 M HEPES pH 7.0, 3,9 M urée, 50 µM CuSO₄, 250 µM THPTA, ascorbate de sodium 5 mM) pendant 2 heures au RT sur une rotati table de mixage ng (20 tr/min). Arrêter la réaction en ajoutant 5 mM EDTA (concentration finale).
2. Incuber à RT pendant 15 minutes dans un mélangeur rotatif (20 tr/min). Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 1 min à RT. récolter les surnageants.
3. Laver le culot contenant les perles trois fois avec 1 000 µL de tampon de₅₀₀ HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), trois fois avec 1 000 µL de 4 M du MgCl₂et deux fois avec 1 000 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). À chaque étape de lavage, centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à ta et recueillir les surnageants. Perles de magasin couplé à 1 000 µL de PBS à 4 ° C.
   ATTENTION : Ne pas déranger le culot de perle tout en retirant le surnageant.

4. validation de la présence et l’activité biologique du BMP2-K3Plk immobilisé à l’aide de Texas Red étiqueté BMP récepteur j’ai un ectodomaine (BMPR-IA _EC )

1. Incuber à 50 µL de perles BMP2-K3Plk fonctionnalisés avec 1 µM de Texas Red étiqueté BMPR-IA_EC avec 150 µL de tampon de₅₀₀ HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) à ta pendant 1 h sur un mélangeur rotatif (20 tr/min).
2. Centrifuger les perles à 20 000 x g pendant 1 min à RT. jeter le surnageant. Laver les billes avec 1000 µL de tampon de₅₀₀ HBS. Répétez l’étape de lavage supplémentaire 3 fois. Centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à ta après chaque étape de lavage.
3. Remettre en suspension les perles dans 500 µL de PBS et distribuer 50 µL sur une lame de verre couvercle. Définissez le filtre microscope entre 561 ou 594 nm. Détecter le Texas Red – BMPR-IA_EC– BMP2-K3Plk fonctionnalisés perles à l’aide de fluorescent microscopie et prendre des photos.

5. mesure de la phosphatase alcaline (ALP) Expression de prouver la bioactivité In Vitro du produit BMP2-K3Plk avant et après la réaction de couplage.

1. Test de la phosphatase alcaline (ALP)
   1. La culture des cellules C2C12 promyoblastic (ATCC CRL-172) dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
   2. Les semences C2C12 cellules à une densité de 3 × 10⁴ cellules/puits dans une microplaque 96 puits. Laisser les cellules à fixer toute la nuit. Éliminer le milieu et incuber les cellules C2C12 en présence de 0,5 à 200 nM de la BMP2-WT ou BMP2-K3Plk de 100 µL/puits de DMEM (2 % FCS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine) à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 72 h.
   3. Éliminer le milieu et laver les cellules avec 100 µL de PBS / puits. Lyser les cellules à ta pendant 1 h avec 100 µL/puits de tampon de lyse (1 % NP-40, glycine de 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) sur une secousse de la plaque (220 tr/mn).
   4. Ajouter 100 µL/puits de tampon de l’ALP (glycine 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) avec 1 mg/mL p-nitrophénylphosphate (fraîchement ajouté) au lysat cellulaire.
   5. Mesurer l’absorption à 405 nm dans un lecteur de multiplate après avoir ajouté le tampon de l’ALP et toutes les 5 min jusqu'à ce que le développement de la couleur est terminé. Générer des courbes dose-réponse et valeurs de la CE50 à l’aide d’un modèle logistique, y = A₂ + (A-₁-A₂) / (1 + (x/x₀)^p).
2. Coloration de la phosphatase alcaline (ALP)
   1. La culture des cellules C2C12 promyoblastic (ATCC CRL-172) en de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
   2. Les semences C2C12 cellules à une densité de 3 × 10⁴ cellules/puits dans une microplaque 96 puits. Laisser les cellules à fixer toute la nuit. Éliminer le milieu et ajouter 20 µL/puits de perles BMP2-K3Plk couplé. BMP2-K3Plk couplé perles sont dans 1000 µL d’une suspension de PBS.
   3. Préparer une solution de 0,4 % faible point de fusion d’agarose en DMEM. Faire fondre au micro-ondes (600 W pendant 3 min) et laisser refroidir dans un bain d’eau à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
   4. Ajouter 20 µL de 0,4 % faible point de fusion d’agarose dans chaque puits (revêtement perles et cellules). Centrifuger à 2000 x g pendant 5 min à 20 ° C. Ajouter 80 µL DMEM (2 % FCS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine) et incuber à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 72 h.
   5. Éliminer le milieu, en veillant à ne pas détacher l’agarose solidifiée de 0,4 %. Ajouter 100 µL/puits de 1 étape NBT/solution de substrat BCIP (Nitro-bleu tetrazolium chlorure, sel 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine).
   6. Analyser la phosphatase alcaline coloration au microscope photonique, immédiatement après que la coloration pourpre devient apparente. Utiliser la microscopie en champ clair et prendre des photos.

Résultats

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour atteler par covalence une nouvelle variante de la BMP2, BMP2-K3Plk, à commercialement disponible azoture fonctionnalisé agarose perles (Figure 1). La bioactivité de la variante de BMP2-K3Plk produite a été validée par l’induction de l’expression génique dans les cellules C2C12 phosphatase alcaline (ALP). Le test in vitro montre des niveaux d’expression semblables ALP induites par le type sauvage BMP2 ...

Discussion

Générant des variants protéiques marqués par expansion de codon génétique permet l’introduction de divers acides aminés non naturels analogues, principalement dans la position de la séquence protéique primaire. Dans le cas de PGB comme BMP2, common tags comme une balise 6-Histidine (His) ne peut être introduit N-terminale, depuis la fin de protein´s C-terminal est enterrée au sein de la structure tertiaire protéique et n’est donc pas accessible de l’extérieur. En d’autres positions, la taille de la balise introduite risq...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
1-Step NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Ajouter une solution aux cellules
3-Azido-7-hydroxycoumarine	BaseClick	BCFA-047-1	Produit chimique utilisé pour la réaction par clic
Agarose à bas point de fusion	Biozym	840101	Agarose pour le dosage de l’ALP  ;
Perles d’agarose azotée	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Perles utilisées pour la réaction
BamHI (enzyme Fast Digest)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Enzyme de restriction
Récepteur BMP IA (BMPR-IAEC)	--	--	dans notre laboratoire
Coomassie Brilliant Blue G-250 Colorant	Thermo Fisher Scientific	20279	Produit chimique utilisé pour Coomassie Coloration en bleu brillant de SDS PAGE
Sulfate de cuivre (II) anhydre (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Produit chimique utilisé pour la réaction par clic
ADN polymérase et tampon de réaction  ;	Kapabiosystems	KK2102	KAPA Kit PCR HiFi
Dulbecco' Eagle modifié' milieu (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Milieu de culture cellulaire
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Produit chimique utilisé pour arrêter la réaction de clic
Isopropyl ß ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Induction bactérienne (concentration finale de 1 mM)  ;
NdeI (enzyme Fast Digest)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Enzyme de restriction
Life activée par	le NHS	Technologies T6134	couplée au récepteur
P-Nitrophenyl Phosphate	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Phosphatase alcaline
p25N-hmBMP2  ;	--	--	Plasmide aimablement fourni par Walter Sebald à J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	---Fourni	par la Chaire de Pharmacie et de Biopharmacie, Université de Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk)	--	--	Fourni par la Chaire de Pharmacie et de Biopharmacie, Université de Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	-	Fourni par la Chaire de Pharmacie et de Biopharmacie, Université de Wuerzburg
Kit d’extraction de gel Qiagen	28704	Purification de gel	Qiagen
purification PCR Qiagen		28104	Purification PCR  ;
L-ascorbate de sodium	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Produit chimique utilisé pour la réaction par clic
T4 ADN Ligase	ThermoScientific	EL0011	Ligature  ;
tris(3-hydroxypropyltriazolylméthyl)amine (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Produit chimique utilisé pour la réaction de clic
4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100  ;
Name	Company	>Numéro de catalogue	Comments
>Equipment
Amicon cellule de concentration 400 ml  ;	Merck KGaA	UFSC40001	Unité de
concentration Unités de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 Merck	KGaA	UFC901024	Unité centrifuge de concentration
Ä ; KTA avant FPLC	Ä ; KTA	--	FPLC
machine Avanti J-26XP	Beckman Coulter  ;	393124	Centrifugeuse pour culture bactérienne
Incubateur à agitation bactérienne	Infors HT		Incubateur à agitation pour culture bactérienne
Système FluorChem Q proteinsimple		--	Système d’imagerie et d’analyse pour SDS-PAGE
Miscroscope fluorescent	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® ; EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	Matériau de la colonne de chromatographie échangeuse d’ions
Greiner CELLSTAR® ;   ; Plaques à 96 puits	Sigma	M5811-40EA	Plaques à 96 puits pour la culture cellulaire (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	--	Centrifugeuse
M-20 Rotor à godets oscillants pour microplaques	ThermoScientific	75003624	Rotor pour microcentrifugeuse pour plaque lors de la coloration ALP
Microcentrifugeuse - 5417R	Eppendorf	--	Centrifugeuse
OriginPro 9.1 G  ;	OriginLab	--logiciel	pour l’analyse statique des données de dosage ALP
Lames de polysinus	Lames de microscope ThermoScientific 10143265
Rotor JA-10	Beckman Coulter  ;	--	rotor pour centrifugeuse Avanti J-26XP
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter  ;	--	rotor pour centrifugeuse Avanti J-26XP
Rotor JA 25.50	Beckman Coulter  ;	--	rotor pour centrifugeuse Avanti J-26XP
Lecteur multiplaques Tecan infinite M200	Tecan Deutschland GmbH	--	Lecteur multiplaques pour dosage ALP
Thermocycler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - filtre de microscope	Keyence		Filter pour microscope fluorescent  ;
Disques d’ultrafiltration en cellulose régénérée 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	utilisé avec la cellule de concentration amicon 400ml
Disques d’ultrafiltration en cellulose régénérée 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	utilisé avec la cellule de concentration amicon 400ml