La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

Résumé

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

Résumé

Cassures double brin de l’ADN (DSB) sont de graves lésions de l’ADN. Analyse de la formation et la réparation d’ORD est pertinente dans un large éventail de domaines de recherche, y compris l’intégrité du génome, génotoxicité, radiobiologie, vieillissement, le cancer et le développement de médicaments. En réponse à l’ORD, l’histone H2AX est phosphorylé à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase formant discrètes foyers nucléaires détectables par microscopie d’immunofluorescence. En outre, 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine favorisant l’ORD importante favorisant la réparation de l’ORD par fin-joining non-homologues tout en empêchant la recombinaison homologue. Selon les fonctions spécifiques de γH2AX et 53BP1, l’analyse combinée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une approche raisonnable pour une analyse détaillée de l’ORD. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape complété par des notes méthodiques pour effectuer la technique. Plus précisément, l’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX est démontrée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. En outre, la valeur des foyers γH2AX comme biomarqueur est représentée dans les lymphocytes de radiographie irradié d’un individu sain. Enfin, instabilité génétique est étudiée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

Introduction

ADN est endommagé en permanence par endogène (par exemple, la réplication stress, espèces réactives de l’oxygène, l’instabilité intrinsèque de l’ADN) et exogènes (par exemple, des radicaux chimiques, irradiation) sources (Figure 1)^{1,2 ,3,4}. Parmi les lésions de l’ADN, cassures double brin de l’ADN (DSB) sont particulièrement graves lésions et peuvent induire la mort cellulaire ou la carcinogenèse. Environ 50 ORD peut-être survenir par cellule et cycle cellulaire⁵. Dans ....

Protocole

toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’éthique II de Mannheim faculté médicale de l’Université de Heidelberg. Écrit le consentement éclairé a été obtenu de tous les individus.

1. préparation des matériaux

1. solution d’Anticoagulant : préparer une solution anticoagulante de 200 UI héparine par millilitre dans le chlorure de sodium 0,9 %. Remplir chacun des tubes de collection (dessiner volume 9 mL) avec 2 mL de la solution anticoagulante avant retrait des échantillons de sang ou de moelle osseuse.
2. Solution de lyse des globules rouges : Prepare le 10 x solution ....

Résultats

Analyse des foyers de γH2AX dans les cellules est plus précis dans la phase G0/G1 et la phase G2 quand γH2AX foyers apparaissent comme des points distincts de fluorescence (Figure 5 a). En revanche, analyse des foyers de γH2AX dans les cellules en phase S est compliquée par taches dispersées γH2AX pan-nucléaire causées par le processus de réplication (Figure 5 b).

Fixat.......

Discussion

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser la formation et la réparation de l’ORD dans un large éventail de domaines de recherche. Les paramètres essentiels qui influencent les résultats des expériences sont la phase du cycle cellulaire, les agents utilisés pour la fixation et la perméabilisation des cellules, le choix de l’anticorps et le matériel et les logiciels de la microscopie à fluorescence.

L’influence du cycle cellulaire sur les habitude.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu RPMI	Sigma-Aldrich	R0883	Milieu pour la culture cellulaire
Héparine sodium	ratiopharm	PZN 3029843	; Héparine 5 000 U.I./mL
Solution de chlorure de sodium 0,9 %	B. Braun	PZN 1957154	Composant de la solution mère anticoagulante
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Milieu pour l’isolement des cellules mononucléées
Solution de trypsine 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme pour la dissociation des fibroblastes en culture cellulaire
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolement des cellules progénitrices myéloïdes CD34+ Lames de
microscope diagnostiques Thermo	Scientific	ER-203B-CE24	Lames de microscope
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	; Centrifugeuse de table  ;
Appareil
Couvercle	Heraeus	76003422	Couvercle pour travailler sans micro-tubes
Conteneur Cyto	Heraeus	75003416	Conteneur Cyto avec 2 alésages coniques
Clip Carrier	Heraeus	75003414	Carrier pour tenir un conteneur Cyto et une glissière
Insert de support	Heraeus	75003417	Insert de support pour tenant un support de clip
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Détergent pour la perméabilisation des membranes cellulaires
Solution d’hydroxyde de potassium 1M	Merck Millipore	109107	Nécessaire à la préparation de la solution de paraformaldéhyde
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	Agent de fixation
Solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	D8537	Solution saline équilibrée
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Agent bloquant
Souris monoclonal anti-&gamma ; Anticorps H2AX (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Anticorps primaire pour la détection de &gamma ; H2AX
Anticorps polyclonal anti-53BP1 de lapin (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Anticorps primaire pour la détection de 53BP1
Alexa Fluor 488 Anticorps anti-souris conjugué pour chèvre	Invitrogen	A-11001	Anticorps secondaire
Alexa Fluor 555 Anticorps anti-lapin conjugué pour âne	Invitrogen	A-31572	Anticorps secondaire
Vectashield Milieu de montage	Vector Laboratories	H-1200	Contient du DAPI pour la coloration de l’ADN
Axio Scope.A1	Microscope à fluorescence	Zeiss	490035
Cool Cube 1 Caméra CCD	Metasystems	H-0310-010-MS	Système de caméra pour l’enregistrement numérique
Logiciel Isis	Metasystems	Sans objet	Logiciel de microscope