Article de méthode

Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

DOI :

10.3791/56628

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2 mars 2018

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1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.

Résumé

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Le développement du cerveau humain procède par une série de précisément les processus orchestrés, avec des stades antérieurs se distingués par la prolifération, la migration et la croissance des neurites ; et des étapes ultérieures, caractérisées par la formation de l’excroissance et synapse axon/dendrite. Dans les troubles du développement neurologique, souvent un ou plusieurs de ces processus sont perturbés, conduisant à des anomalies dans la formation du cerveau et de la fonction. Avec l’avènement de la technologie (hiPSC) les cellules souches humaines pluripotentes induites, chercheurs disposent maintenant d’une offre abondante de cellules humaines qui peuvent être différenciés dans pratiquement n’importe quel type de cellule, y compris les neurones. Ces cellules peuvent être utilisés pour étudier le développement normal du cerveau et pathogenèse de la maladie. Un certain nombre de protocoles à l’aide de hiPSCs pour modéliser les maladies neuropsychiatriques utilisation en phase terminale différenciées des neurones ou utilisation systèmes 3D appelé organoïdes. Bien que ces méthodes sont révélés inestimables pour étudier la pathogenèse de la maladie humaine, il y a quelques inconvénients. Différenciation des hiPSCs dans les neurones et la génération d’organoïdes sont des processus longs et coûteux qui peuvent influer sur le nombre d’expériences et de variables qui peuvent être évalués. En outre, alors qu’organoïdes et neurones post-mitotiques permettent l’étude des processus liés à la maladie, y compris la croissance dendritique et synaptogenèse, ils s’opposent à l’étude des processus antérieurs tels que la prolifération et la migration. Dans les troubles du développement neurologique, comme l’autisme, abondantes preuves génétiques et post-mortem indiquent les défauts dans les processus de développement précoces. Les cellules précurseurs neurales (PNJ), une population de cellules hautement proliférante, peuvent être un modèle approprié permettant de poser des questions sur les processus ontogénétiques et initiation de la maladie. Nous étendons maintenant des méthodes tirées de l’étude de développement dans les cultures corticales souris et le rat à des PNJ humains. L’utilisation de PNJ nous permet d’enquêter sur les phénotypes liés à la maladie et de définir comment les différentes variables (p. ex., facteurs de croissance, médicaments) impact du développement processus y compris la prolifération, la migration et la différenciation en seulement quelques jours. En fin de compte, cet ensemble d’outils peut être utilisé de façon reproductible et haut débit afin d’identifier les mécanismes propres à la maladie et des phénotypes dans les troubles du développement neurologique.

Introduction

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L’utilisation des organismes plus simples et des modèles de souris a élucidé les mécanismes de développement du cerveau de base ainsi que pathogenèse de la maladie. Malgré ces avancées, l’étiologie de nombreux troubles neuropsychiatriques reste insaisissable, parce que pas tous les résultats dans des organismes plus simples sont directement liées à des aspects complexes de la maladie humaine. En outre, la plus grande complexité du cerveau humain rend difficile le développement humain modèle souvent et troubles chez les animaux. Avec l’évolution et les progrès de la technologie (hiPSCs) des cellules souches humaines pluripotentes induites, les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches et puis se différencient en cellules neuronales pour étudier les maladies humaines. Percées dans les technologies hiPSCs et « omic » (génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique) promettent de révolutionner la compréhension du développement du cerveau humain. Ces technologies désormais rendent possible une approche de « médecine de précision » pour la caractérisation des maladies neuropsychiatriques sur une base de cas-par-cas.

L’aliment de base actuel en matière de modélisation des maladies hiPSC est à différencier des cellules en sous-types neuronales spécifiques dans une monocouche ou utiliser un système de culture 3D appelé un organoïde pour récapituler les aspects du cerveau développement1,2, 3. Ces systèmes ont été extrêmement précieux pour l’étude et de découvrir des aspects uniques du développement humain et maladie4,5,6,7. Toutefois, les cultures de neurones et organoïdes exigent souvent n’importe où de semaines à mois de culture avant qu’ils soient prêts à étudier. Le caractère chronophage de ces protocoles et le montant des ressources nécessaires pour maintenir que ces systèmes de culture limitent souvent le nombre d’expériences qui peuvent être effectuées et le nombre de variables (comme facteurs de croissance ou médicaments) qui peuvent être testés. En outre, de nombreuses études utilisant des organoïdes et des neurones post-mitotiques ont mis l’accent sur les processus tels que la formation de l’excroissance ou synapse dendrite, apparaissant plus tard dans le développement. Tandis que ces processus ont été impliqués dans la pathologie des troubles du développement comme l’autisme et la schizophrénie, plus tôt les événements développementaux qui surviennent avant la différenciation neuronale définitive sont également importants pour la pathogenèse de la maladie8 ,9,10,11,12,13. En effet, des études de génomiques récentes montrent que la période de mi-foetale, qui est composée de prolifération, l’excroissance des processus et la migration, est particulièrement importante dans l’autisme pathogenèse11,14. Ainsi, il est important d’étudier les souches neurales et populations de cellules progénitrices de mieux comprendre ces processus antérieurs. Organoïde systèmes, qui sont le développement du cerveau humain rappel réfléchie pour mieux en raison de leur nature 3D et la structure organisée, contiennent une piscine progénitrices qui a été utilisée pour étudier certains de ces événements antérieurs. Cependant, la population progénitrices dans organoïdes est souvent éparse et plus comme des cellules gliales radiales que neural souches ou progénitrices cellules5,15. Ainsi, il serait utile de prévoir une méthode de haut débit pour l’étude des premiers stades de développement neurologique dans une population de cellules prolifératives activement.

En laboratoire, nous avons créé un protocole qui utilise des cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC (PNJ), une population mixte de tige de neurones et des cellules progénitrices qui est hautement proliférante, d’étudier les processus neurologiques telles que la prolifération, la migration cellulaire, et extension du processus initial (neurites). Ces essais ont été mis au point des techniques utilisées dans notre laboratoire depuis des décennies à étudier avec succès développement neurologique en rat et souris cultures corticale16,17,18,19,20, 21,22,23. Ce qui est important, on a aussi montré que les phénotypes et les signaux réglementaires définies dans les systèmes de culture de rat et la souris sont très révélatrices des mécanismes qui sont actifs en vivo, indiquant la valeur de ces techniques16, 17,18,19,24. Après différenciation initiale de hiPSCs aux PNJs, ces méthodes nous permettent d’étudier les processus de développement vitales en quelques jours. Ces méthodes présentent de nombreux avantages : (1) qu’ils exigent un équipement peu sophistiqué et sont faciles à mettre en œuvre, (2) nombreuses répliques expérimentales peuvent être effectuées dans un court laps de temps, ce qui permet une confirmation rapide de la reproductibilité des résultats et (3) variables de culture telles que les matrices de revêtement, les effets des facteurs de croissance et l’activité des médicaments peuvent être testées rapidement et à moindre coût. Par ailleurs, nous profitons du rôle bien établi des facteurs de croissance extracellulaires comme régulateurs critiques des divers processus de développement. PNJ ont été exposés pour sélectionner les signaux du développement directement stimulent des événements tels que la prolifération, la croissance des neurites et la migration cellulaire et ont trouvé qu’ils améliorent la capacité à repérer les défauts qui ne sont pas évidents dans des conditions de contrôle19 , 25 , 26 , 27 , 28. de même, la facilité d’évaluation des médicaments fournit un moyen puissant pour adopter des techniques de médecine de précision pour tester l’efficacité de diverses interventions thérapeutiques. Ainsi, le présent protocole facilite un haut débit, reproductible et une méthodologie simple pour étudier le développement précoce du cerveau, pathogenèse de la maladie et les effets bénéfiques potentiels de facteurs de croissance et de drogues sur le développement neurologique des phénotypes.

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Protocole

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1. consignes et l’entretien du Cabinet de prévention des risques biotechnologiques

  1. Procédures de sécurité de niveau de biosécurité 2 (BSL-2)
    1. Suivez les directives de l’établissement travaille avec des matériaux de BSL-2. Disposer des matériaux de BSL-2 selon les pratiques de l’institution. Indiquer les pièces et équipements qui sont utilisés pour les matériaux de BSL-2. Portez tous les équipement de protection individuelle (EPI), y compris les gants et blouse de laboratoire.
  2. Entretien du Cabinet de prévention des risques biotechnologiques
    1. Utiliser une armoire de sécurité biologique homologuée pour l’utilisation de matériaux niveau BSL-2.
    2. Allumez la lumière UV dans la prévention des risques biotechnologiques armoire pendant au moins 15 minutes et puis vaporiser des surfaces avec une solution javellisée de 10 %. Laisser la solution d’eau de Javel pour se reposer pendant 15 min, essuyer le cabinet et tourner sur le flux d’air avant de l’utiliser.
  3. Radioactive tritiée [3H]-thymidine (Tritium) des procédures de sécurité
    NOTE : Le Tritium est une source radioactive de catégorie 5, « le plus improbable être dangereuse » catégorie. Suivez les directives de l’institution pour l’utilisation de la radioactivité. Certaines institutions peuvent exiger des certifications ou permet de gérer le tritium.
    1. Reçoivent une formation de l’institution sur la façon de bien gérer et disposer de tritium. Élimination de déchets radioactifs dans des récipients appropriés, conformément aux politiques de l’institution. Porter les EPI pour travailler avec tritium.

2. Induction neurale du CISP

Remarque : Pour rendre les PNJs, une version légèrement modifiée d’un protocole qui accompagne un kit à induction neurale disponibles dans le commerce a été suivie. Le kit se compose des médias de la Neurobasal (n.-b.) et 50 x Supplément de Induction neurale (NIS), qui sert à fabriquer un 1 x milieu d’Induction neurale (NIM). NIS est également utilisé pour faire 100 % Expansion moyenne (voir Section 3.1). Un lien vers le protocole se trouve dans les matériaux et les équipements et les références article43.

  1. CISP de passage quand ils deviennent confluente de 70 à 80 %.
  2. CISP plaque 300 000 en 1 bien de qualifié un CSEh extracellulaire matrice-mimic plaque de 6 puits de gel (gel de l’ECM-mimic) enduit contenant 2 mL de milieu exempt d’engraissement iPSC avec 5 μM d’inhibiteur de la roche. Voir la Section 3.2 pour obtenir des instructions sur les puits de revêtement avec gel ECM-mimic.
  3. Le lendemain, enlever l’iPSC moyen + ROCK CISP inhibiteur et lavage une fois avec 1 x PBS. Ajouter 2 mL de NIM le CISP.
    Remarque : 50 mL de NIM est effectuée en ajoutant 1 mL de 50 x NIS et 250 µL (50 unités/mL, 5 μL/mL) de pénicilline/streptomycine (P/S) à 49 mL des médias NB.
  4. Médias de changement de l’induction neurale tous les 2 jours en aspirant passé moyen et remplacement avec 2 mL de NIM jusqu'à devenus confluentes de cellules (environ 4-5 jours). Changer les médias tous les jours, une fois les cellules confluentes.
  5. Cellules de passage après 7 jours de NIM et plaque dans un gel d’ECM-mimic enduit plaque 6 puits contenant 2 mL 100 % Expansion Media et inhibiteur de ROCK 5 μM. Les cellules sont considérés comme Passage 0 (P0) PNJs à ce stade. Voir la Section 3.1 ci-dessous pour obtenir des instructions faire 100 % Expansion Media.
  6. Cellules de passage en utilisant les méthodes décrites à la Section 3.4. Attendez que les cellules ont atteint P2 sont confluentes avant la dissociation pour souiller de marqueurs NPC et d’enrichissement pour les expériences (Figure 1).

3. les milieux de Culture, revêtement et d’entretien des PNJs

  1. Préparation de médias pour l’entretien de PNJ (augmentation de 100 % Media) :
    1. Faire 50 mL 100 % Expansion médias en combinant 24,5 mL de DMEM/F12 avec 24,5 mL du Nouveau-Brunswick.
    2. Ajouter 1 mL de 50 x NIS au DMEM/F12 + solution NB. Ajouter 250 μL de solution de P/S aux médias.
      NOTE : Media peut être réfrigéré (4 ° C) et utilisé pendant 2 semaines. Des volumes moins importants des médias est possible en ajustant les volumes de DMEM / F12 + NB + NIS en utilisant les ratios de mêmes en ce qui concerne le volume de 50 mL.
  2. Préparation du Gel de l’ECM-mimic revêtus de plaques de Culture pour NPC entretien
    1. Aliquote ECM-mimic gel au volume nécessaire pour faire les 6 mL de solution de travail. Calculer le volume aliquote en regardant la fiche du certificat d’analyse puisque le facteur de dilution de gel ECM-mimic varie d’un lot à l’autre et d’un lot.
    2. Décongeler une aliquote de gel ECM-mimic sur la glace et se dissoudre dans 6 mL de froid DMEM/F12 médias.
    3. Ajouter 1 mL de solution de gel/DMEM/F12 ECM-mimic à chaque puits d’une plaque 6 puits. Incuber la plaque 6 puits avec ECM-mimic-solution de gel pendant 30 min à 37 ° C.
    4. Aspirer la solution de gel ECM-mimic après 30 min d’incubation et remplacer par 100 % Expansion Media ou réfrigérer les plaques (4 ° C, jusqu'à 1 semaine) sans aspirer ECM-mimic-solution de gel.
  3. Entretien des PNJs
    1. Plaque de PNJ à une densité de 1,5 millions de cellules dans un enduit gélifié cupule contenant 2 mL de 100 % Expansion Media ECM-imitateur.
    2. Incuber à 37 ° C dans un milieu humide avec 5 % de CO2les PNJs.
    3. Ajoutez 5 μM d’inhibiteur de la roche aux médias pour les PNJs à P3 ou plus bas, ou pour PNJ décongelés, pour prévenir la mort cellulaire excessive. Modifier les médias après 24h pour enlever l’inhibiteur de la roche.
    4. Cellules de passage tous les jours 4 à 9, selon quand ils deviennent confluentes. Les cellules sont considérés comme confluentes quand ils deviennent une monocouche dense qui couvre tout le fond de la surface du plat.
    5. Plaque de PNJs à une densité de 1 à 1,5 millions de cellules par un puits d’une plaque de 6 puits (voir Section 3.4). Retirez les supports usés toutes les 48 h et remplacez par 2 mL de 100 % Expansion Media.
  4. Soulever, se dissocient et Pellet PNJ pour l’entretien ou ensemencement des Conditions expérimentales
    1. Aspirer les cellules moyennes, laver une fois avec 1 x PBS. Aspirer les PBS et ajouter 500 μl de solution de détachement cellulaire 1 x en 1 bien de confluentes PNJs. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
    2. Ajouter 500 μl de la température ambiante (RT) PBS puis laver le bien, avec une pipette de P-1000 afin d’assurer l’élimination des cellules. Recueillir les cellules + solution de PBS dans un tube conique de 15 mL. Laver la plaque avec 1 mL de PBS et ajouter le liquide dans le tube.
    3. Faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min granuler.
    4. Retirez le culot cellulaire de surnageant et remettre en suspension les cellules de 1 à 5 mL de préchauffé DMEM/F12 médias. Diluer les cellules à une densité de 1 à 4 millions de cellules/mL de médias. Quantifier les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Plaque le nombre requis de lymphocytes, spécifiques pour l’entretien NPC (Section 3.3) ou le test individuel en cours (voir les sections suivantes pour plus de détails).
    6. Ajuster le volume de suspension cellulaire avec les médias afin qu’entre 15 et 100 μL de cellules sont utilisées pour chaque puits/plat. Ce volume de placage petit garantit qu’il n’y a même cellule distribution et que des facteurs de croissance, de drogues ou des substrats dans le milieu ne sont pas dilués.
    7. Incuber les cellules à 37 ° C. Modifier les médias toutes les 48 h pour l’entretien NPC ou voir les détails spécifiques pour les épreuves individuelles.
  5. Préparation des médias pour des Conditions expérimentales (30 % Expansion Media)
    1. Diluer les médias d’Expansion de 100 % de 70 % (appelé 30 % Expansion) en ajoutant une solution NB + 1:1 DMEM/F12 pour faire des médias pour des conditions expérimentales.
    2. Prendre 20 mL de 30 % Expansion Media en ajoutant 6 mL de 100 % Expansion Media et en diluant avec 7 mL de NB et 7 mL de DMEM/F12 médias. Ajouter 5 µL/mL de solution de P/S.
      Remarque : Si 100 % médias contient déjà P/S, puis ajoutez 5 μL/mL pour les combinés-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μL/mL) = 70 μL de P/S au lieu de 100 µl.
    3. Ajouter des substrats de revêtement et de facteurs de croissance à des concentrations souhaitées pour les médias d’agrandissement de 30 %.

4. Appréciation de la synthèse de l’ADN, entrée de la Phase S et nombre de cellules de PNJ

  1. Préparation pour la synthèse d’ADN et S-ouverture de la phase analyse nombre de cellules
    1. Faire un 1 mg/mL de solution de poly-D-lysine (PDL) en dH2O et filtre stériliser. Diluer à 01:10 dH2O faire un 0,1 mg/mL solution PDL et ajouter 300 μl à chaque puits d’une plaque 24 puits ou 1 mL à un plat de 35 mm. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
    2. Laver les puits PDL 3 fois pendant 5 min avec dH2O. aspirer dH2O et ajouter 300 μL/puits ou 1 mL/assiette de laminine (5 μg/mL) diluée dans du PBS de x 1. Recouvrir les plaques avec du parafilm et garder dans un stérile, prévention des risques biotechnologiques cabinet du jour au lendemain au RT (12 à 24 h).
    3. Préparer 30 % Expansion Media (voir la Section 3.5) après 12 à 24 h. Ajouter véhicules, facteurs de croissance ou médicaments d’intérêt à la concentration voulue dans les volumes qui sont moins de 10 % de la solution totale pour éviter la dilution NIS dans les 30 % moyen d’Expansion.
    4. Laver chaque puits de la plaque 24 puits deux fois avec du PBS 1 x (5 min). Aspirer la solution 1 PBS x et ajouter 450 μL de médias (sans ou avec des facteurs de croissance/drogues). Incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 15 min avant l’ensemencement de cellules.
    5. Pour chaque expérience, mis en place 2-3 puits ou vaisselle par État.
    6. PNJ de plaque (voir Section 3.4) :
    7. Test de synthèse d’ADN NPC : 100 000 cellules/puits dans une plaque 24 puits
    8. Phase S entrée : plat 500 000 cellules/35 mm
    9. Analyse nombre de cellules : 50 000 cellules par puits dans une plaque 24 puits
  2. Test de synthèse d’ADN cellulaire précurseurs neuronaux
    1. 100 000 cellules/puits dans une plaque 24 puits de la plaque et évaluer en triple exemplaire/État.
    2. Ajouter radioactif, tritiée [3H]-thymidine au milieu de culture (1.5 μCi/mL) dans chaque puits après 46 h en culture. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h.
      Remarque : Lors de l’utilisation de matières radioactives, reçoivent une formation de votre institution, protocoles de sécurité suivi radioactivité et dispose de matières radioactives dans les rebuts dûment désignés.
    3. Enlever et jeter des médias radioactifs après que 2 h. Ajouter 300 μL de préchauffée à 0,25 % de trypsine-EDTA (0,5 mM) dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
    4. Allumez le moissonneur de la cellule (voir le matériel et l’équipement section) et la pompe et faire en sorte que la pression de la pompe est inférieure à 200 lb/po2. Placer le papier filtre à travers l’espace dans la moissonneuse de cellule et déchirez le coin droit pour marquer l’orientation du papier.
    5. Placer les tubes de collecteurs de moissonneuse de cellule dans un bac vide « en blanc », puis appuyez sur prélavage pour humidifier le papier filtre. Placer les tubes de collecteurs dans les puits d’échantillon et exécuter (start).
    6. Quand la moissonneuse de cellule a terminé le prélèvement d’échantillons, un ascenseur de serrage et avance papier filtre à répéter pour tous les ensembles d’échantillons. Prélaver toujours dans une assiette vide, « vide ».
    7. Sécher le papier-filtre sous une source lumineuse et mis en place des correspondants les flacons dans un plateau. Poinçonner chads papier dans deux flacons et ajouter 2 mL de cocktail de scintillation liquide à chaque flacon. Flacons bouchon et étiquette.
    8. Incuber les flacons à scintillation liquide cocktail pendant au moins 1 h avant de lire les coups par minute (CPM) sur une machine de scintillation.
  3. Test d’entrée phase S NPC
    1. Voir la Section 3.4 pour obtenir la procédure pour soulever, dissocier, pellet et remettre en suspension les cellules.
    2. Plaque de 500 000 cellules par plat dans les 35 mm des plats préparés à la Section 4.1, 1 seul plat/condition pour cette étape.
    3. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 46 heures.
    4. Préparer trois plaques 35 mm recouverts de PDL/Laminin par condition après 24h. Par exemple, s’il y a un plat de 35 mm de 30 % Expansion Media et un plat de 35 mm de 30 % Expansion Media + FGF (10 ng/mL) puis enduire 6 plaques PDL/laminine pour une utilisation sur le lendemain.
    5. Ajouter 2 μL/mL de 5 mM EdU aux cultures après 46 h. Incuber pendant 2 h.
    6. Dissocier et granules des cellules (voir Section 3.4). Resuspendre le culot dans 3 mL de 30 % Expansion Media ou 3 mL de 30 % Expansion Media + désiré de facteurs de croissance/drogues.
    7. Plaque de 1 mL par capsule sur plats revêtus de PDL/laminine. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber à 37 ° C pendant 2 h permettre à des cellules d’adhérer au plat. Voir la Figure 2 pour qu’une chronologie simplifiée.
  4. Analyse de l’entrée de la phase S
    1. Difficulté des plats avec glacée 4 % paraformaldéhyde (PFA dans du PBS 1 x) pendant 20 min. Ensuite, laver la vaisselle 3 fois pendant 5 min avec du PBS 1 x.
    2. Ajouter 1 mL de PBS 1 x 0,05 % d’Azide de Sodium pour prévenir la croissance bactérienne et fongique. Les cellules peuvent être stockés à 4 ° C pendant 6 mois si plats (scellés avec du parafilm) ont été maintenues dans le PBS + Sodium solution d’azoture, quoique pas tout immunologiques antigènes sont bien conservés après de longs retards dans l’analyse.
    3. Dosage des cellules à l’aide d’une réaction commerciale de EdU kit (voir le protocole du fabricant). Détachant des cellules à l’aide de DAPI ou un autre marqueur nucléaire et l’image à l’aide de la microscopie en fluorescence.
    4. Évaluer la proportion de cellules positives EdU sur aveugles (nombre total de cellules) des cellules vivantes total dans 10 domaines systématiquement aléatoires (x 10). N’incluez pas les cellules mortes en analyse.
    5. Utiliser les deux images de contraste de phase et images fluorescentes pour déterminer une coloration positive EdU et de déterminer quelles cellules sont morts ou vivants (Figure 3).
    6. Compter toutes les cellules qui ont toutes deux lissent et même membrane cellulaire dans les paramètres de contraste de phase et un gros noyau non fragmenté par fluorescent DAPI nucléaire tachent, que ces cellules sont en direct (Figure 3 a-B).
    7. Exclure toutes les cellules qui sont la phase lumineuse, ont une membrane de cellule inégale brisée et ont un noyau petit et condensé comme visualisés par l’imagerie, que ces cellules sont morts des fluorescente DAPI (Figure 3 a-B). Évaluer des cellules vivantes pour l’expression de EdU en identifiant les cellules pour lesquelles lumineuse fluorescente EdU tache couvrant le noyau entier ou une coloration fluorescente moucheté dans le noyau (Figure 3).
  5. Analyse nombre de cellules de NPC
    1. Après 2 jours de culture, étiqueter et préparer des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et 0,5 mL tubes de microcentrifuge. Dans chaque tube de 0,5 mL, ajouter 5 μl de bleu de Trypan.
    2. Dans chaque puits d’une plaque 24 puits, éliminer le milieu et ajouter 200 μL de 1 x solution de détachement cellulaire et place en incubateur pendant 10 à 15 min.
    3. Après le temps imparti, une fois que les cellules ont levé, ajouter la quantité désirée de solution 1 PBS x dans chaque puits.
      Remarque : En règle générale, le jour 2, ajoutez 300 μl de PBS 1 x dans les cellules contenant bien plus de 200 μl de la solution de détachement, pour un volume total de 500 μL. Avec temps d’incubation de culture supplémentaires, comme les cellules deviennent plus confluentes, augmenter le volume de dilution si nécessaire. Par exemple, le jour 4, ajouter 500 μl de 1 x PBS et le jour 6, ajoutez 800 μL de PBS 1 x. Le volume total sera de 700 ml et 1 mL, respectivement.
    4. À l’aide d’une pipette de P-1000, Pipetter en haut et en bas dans chaque puits 4 à 5 fois pour éliminer les cellules. Examiner la plaque sous microscope pour s’assurer que toutes les cellules ont détaché. Cellules de transfert pour tubes de 1,5 mL.
    5. Il faut inverser les tubes de 1,5 mL avec cellules dilués 2 à 3 fois. Ensuite prendre un 50 μL aliquote de cellules à partir du milieu du tube et ajouter aux tubes de 0,5 mL avec le fil bleu Trypan (voir 4.5.1).
    6. Solution de la pipette cellule haut et bas de 2 à 3 fois. Ajouter des cellules à l’hémocytomètre et analyser immédiatement. Attendre plus longtemps que 10 min peut augmenter la mort cellulaire ou la présence de cellules qui ont repris le bleu Trypan.
    7. Ajouter avec précaution 10 µL de cellules + mélange bleu Trypan de chaque côté du hémocytomètre pour effectuer des comptages répétés. Compter les cellules à l’aide du microscope à contraste de phase. Ne pas compter les cellules mortes ou les cellules bleus foncés qui ont repris le bleu Trypan.
    8. Pour obtenir l’utilisation de numéro, cellulaire totale moyenne nombre de cellules à compter de 4 coins de l’hémocytomètre et appliquer l’équation suivante :
      Nombre de cellule x volume (mL) x 10,000 de médias moyen = nombre de Total de cellules/puits
    9. Aspirer et répétez la procédure sur les puits restants. Modifier les médias sur les cellules qui ne sont pas être comptées, chaque test de répétition de 48 h. sur 4 jours et 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Préparation des plats et des médias pour l’analyse de neurites
    1. Faire un 1 mg/mL de solution de poly-d-lysine (PDL) en dH2O et filtre stériliser. Diluer à 01:10 dH2O pour faire une solution PDL de 0,1 mg/mL et ajouter 1 mL dans chaque plat de 35 mm. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
    2. Entre-temps, préparer les milieux Expansion de 30 % (voir la Section 3.5) et ajouter 5 μg/mL (5 µL/mL) de solution de la fibronectine (1 mg/mL de bouillon) aux médias.
    3. Une fois que le support est prêt, ajouter véhicules, facteurs de croissance ou médicaments d’intérêt à la concentration désirée.
      Remarque : Il est préférable d’ajouter le véhicule, facteurs de croissance ou de drogues, à des volumes < 10 % de la solution globale pour éviter la dilution de la fibronectine et autres composants dans le milieu de l’expansion de 30 %.
    4. Après 20 min, laver la vaisselle PDL 3 fois pendant 5 min avec dH2O pour enlever l’excès PDL. S’assurer que les plats sont sèches avant d’ajouter des médias.
    5. Placer 1 mL de médias (avec ou sans facteurs de croissance/drogues) + solution de fibronectine dans chaque plat enduit de PDL.
    6. Incuber les plats à 37 ° C pendant au moins 30 min avant l’ensemencement des cellules pour assurer une bonne fixation de la fibronectine de la PDL.
    7. Pour chaque expérience, mis en place 2 ou 3 plats par État (p. ex., 3 plats contenant du véhicule, 3 plats contenant un medicament).
  2. Placage de PNJs pour dosage de neurites
    1. Voir la Section 3.4 pour obtenir la procédure pour soulever, dissocier, pellet et remettre en suspension les cellules.
    2. Plaque 50 000 cellules par plat dans les plats préparés à la Section 5.1. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition égale des cellules.
    3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 48 h.
  3. Analyse des Neurites
    1. Après incubation des cellules pendant 48 h, aspirer moyen et Difficulté des plats avec de la glace froide 4 % PFA pendant 20 min.
    2. Après 20 min, laver la vaisselle 3 fois pendant 5 min avec du PBS 1 x. Après le lavage final, ajouter 1 mL de PBS 1 x 0,05 % d’Azide de Sodium.
    3. Analyser les plats aveuglément sur un microscope à contraste de phase à 32 X. Compter les cellules totales et avec neurites dans 3, lignes de 1 cm, choisis au hasard des postes mais reproductibles. Compter un minimum de 150 cellules par plat pour garantir un échantillonnage adéquat.
      NOTE : Une neurite est définie comme une extension (processus) du corps cellulaire qui est > 2 diamètres de corps cellulaire dans la longueur. Pour les cellules avec plusieurs processus, le processus plus long est considéré pour le critère. Cellules avec des procédés qui sont < 2 corps cellulaire diamètres de longueur ne sont pas inclus (Figure 4).
    4. Additionnez le nombre total de cellules et le nombre total de cellules avec des neurites dans chaque plat. Calculer le % de cellules avec des neurites. Moyenne du pourcentage de cellules avec des neurites à travers des plats répétées. Confiance dans la reproductibilité expérimentale est établie lorsque toutes les lignes dans chaque plat sont similaires, et les moyennes entre les plats sont très similaires, avec l’erreur-type de la moyenne (SEM) < 10 %.
    5. Vous pouvez également analyser les neurites en effectuant l’immunocytochimie pour marqueurs tels que bêta-III-tubuline (TUJ1) ou carte2. Après coloration pour le marqueur d’intérêt, prendre 10 images systématiquement au hasard sur un microscope à fluorescence à 10 X. Image d’au moins 200 cellules. Dans ce cas, acquérir les images pas trop près du bord du plat. Analyser le pourcentage de cellules avec des neurites TUJ1 ou MAP2 + (voir la Figure 10 pour obtenir un exemple).

6. NPC Neurosphère Migration test

  1. Neurosphère Formation
    1. Ajouter 1 mL de 100 % Expansion Media dans un plat de 35 mm avec aucun substrat du revêtement. Incuber les plats pendant au moins 15 min à 37 ° C avant électrodéposition PNJs. préparer 2 ou 3 plats pour s’assurer qu’il sera assez neurospheres pour le test de migration cellulaire.
      Remarque : L’absence d’un substrat de revêtement assure que les PNJ reste suspendues dans les médias, ce qui est essentiels pour la formation Neurosphère. Plats de revêtement empêchera Neurosphère formation.
    2. Voir la Section 3.4 sur mesures pour soulever, se dissocient et cellules de granule. Resuspendre le culot dans 2 à 5 mL de pré chauffé 100 % Expansion Media. Plaque 1 million PNJs dans chaque plat 35 mm préparé à la section 6.1.1.
    3. Incuber les PNJs à 37 ° C pendant 48 à 96 h permettre des PNJ d’agrégation et la forme neurospheres. Évaluer la taille de sphère en utilisant une règle direct sur un microscope à contraste de phase. Attendez que la plupart des sphères atteindre un diamètre approximatif de 100 µm (± 20 μm) (Figure 5). Petites sphères vont complètement se dispersent et se défassent pendant le test de migration.
  2. Préparation des plaques pour l’analyse de Migration Neurosphère
    1. Dissoudre le ECM-mimic gel aliquotes (voir la Section 3.2) dans 6 mL de 30 % Expansion Media. Une fois préparé, ECM-mimic gel/30% solution Expansion Media ajouter véhicules, facteurs de croissance ou de drogues d’intérêts à des concentrations souhaitées.
      Remarque : Véhicule, drogue et concentrations de facteur de croissance doivent être augmentée pour tenir compte de l’ajout de 200 µL de neurospheres dans la Section 6.3.
    2. Plaque de 1 mL de l’ECM-mimic gel solution Media Expansion de 30 % (± véhicules, facteurs de croissance ou de drogues) dans un puits d’une plaque de 6 puits. Faire 2-3 puits par condition expérimentale. Sinon, mets 35 mm peuvent être utilisés. Incuber les boîtes pendant au moins 30 min à 37 ° C.
      Remarque : Ne pas aspirer le ECM-mimic gel/30% solution Expansion Media pour ce dosage. Placage de sphères sur un gel de ECM-Mimic aspiré conduira à migration rapide et excessive.
  3. Neurospheres de placage
    1. Recueillir des neurospheres formé à la Section 6.1 et placez-les dans un tube conique. Laver le 35 mm plats avec 1 mL de solution de 1 PBS x pour assurer tous les neurospheres sont collectées. Tournez en bas les neurospheres recueillies à 100 x g pendant 5 min.
    2. Remettre en suspension les neurospheres en 1 à 3 mL de préchauffé 30 % Expansion Media. Si 1 plat de neurospheres est recueilli, 1 mL de médias est utilisé pour remettre en suspension les sphères. Si 2 plats sont collectés, 2 mL de médias sont ajoutés pour remettre en suspension les sphères, etc. , déposer délicatement et seulement un P-1000 permet de s’assurer que les sphères ne sont pas brisés.
    3. Plaque de 200 μl de la suspension neurospheres dans l’ECM-mimic gel/30% solution d’extension faite à la Section 6.2. Plaques de roche dans toutes les directions à répartir neurospheres. Incuber les boîtes pendant 48 h à 37° C.
    4. Retirer l’ECM-mimic gel/30% Expansion Media solution et fixer les cellules à 4 % PFA, lavage et garder les cellules en 1 x PBS + 0,05 % d’Azide de Sodium.
  4. Analyse des Neurospheres
    1. Acquisition d’images de neurospheres ensemble à l’aide de paramètres de contraste de phase à 10 X. S’assurer que les sphères ne sont touchent pas entre eux. Mesure moyenne migration en utilisant le logiciel ImageJ.
    2. Tracer le contour extérieur de la Neurosphère à l’aide de l’outil en ligne à main levée. La ligne à main levée est accessible par un clic droit sur l’icône « rectiligne ». Traces manuellement à l’aide d’une souris.
    3. Utilisez la fonction de mesure pour calculer la superficie de la trace. Veiller à ce que la « zone » est sélectionné comme un affichage dans la fenêtre « Set Measurements » sous l’onglet analyse. Voir la Figure 6 pour trace du contour extérieur en bleu.
    4. Tracer la masse cellulaire interne de la zone de la sphère et de mesure. Voir la Figure 6 pour trace du contour intérieur en rouge. Quantifier la migration moyenne en soustrayant la masse cellulaire interne de la zone totale Neurosphère.
    5. Neurospheres de mesure qui présentent une masse cellulaire interne dense avec des cellules sur la migration comme un tapis contigu (Figure 6).
    6. N’incluez pas les cellules à l’extérieur de la moquette ou détaché de la Neurosphère pour la mesure. Voir la Figure 6 pour des exemples de cellules (encerclés en blanc) qui sont exclus de la mesure de tapis extérieur. Analyser un minimum de 20 neurospheres pour chaque condition.

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Résultats

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Un des buts de ces études sont de définir l’activité proliférative des PNJ, c'est-à-dire l’augmentation du nombre de cellules. Ce résultat est obtenu en évaluant la synthèse de l’ADN de la population totale de cellules, une approche de haut débit qui mesure l’incorporation de thymidine tritiée traceur radioactif dans des extraits cellulaires et tient compte de toutes les cellules engagées en phase S, qu’ils soient synthèse pendant 5 minutes ou les deux heures ensemble. En outre, ces tests...

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Discussion

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Les protocoles présentés ici illustrent des méthodes rapides et simples pour étudier les processus fondamentaux de développement neurologique et de tester les facteurs de croissance et de médicaments à l’aide de cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC. hiPSC technologie a révolutionné l’étude de la pathogenèse des maladies neurologiques en nous fournissant un accès sans précédent à vivre les cellules neuronales humaines de personnes touchées. En effet, il y a eu de nombreuses études hiPSC des troubles du développem...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le gouverneur du New Jersey Conseil pour la recherche médicale et le traitement de l’autisme (CAUT13APS010 ; CAUT14APL031 ; CAUT15APL041), Nancy Lurie marque la Fondation de la famille et la Fondation de la communauté juive de Greater MetroWest New Jersey Mindworks Charitable Trust de plomb.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PSC Neural Induction Medium :
Protocole Lien : https://goo.gl/euub7a  ;		ThermoFischer ScientificA1647801Il s’agit d’un kit composé d’un milieu neurobasal (NB) et d’un supplément d’induction neuronale (NIS) 50x. Le NIS est utilisé pour fabriquer un milieu d’induction neuronale 1X et un milieu d’expansion à 100 %
Milieu avancé DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010Composant du milieu d’expansion à 100 %
Milieu neurobasalThermoFischer Scientific21103049Composant du NIM et du milieu d’expansion à 100 %.
Corningqualifié hESC354277gel mimique extracellulaire qualifié hESC (gel mimique ECM)  ;
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302Inhibiteur de ROCK
6 plaques de puitsCorningCOR-3506Plaques de polystyrène utilisées pour l’entretien des NPC et pour le test de migration de la neurosphère  ;
Plaques à 24 puitsThermoFischer Scientific2021-05Plaques en polystyrène : Utilisées pour le test de synthèse de l’ADN NPC
Boîtes de 35 mmThermoFischer Scientific2021-01Plaques en polystyrène : Utilisées pour l’entrée en phase S du NPC et le test du neurite
Laminin de souris naturelleInvitrogen23017-015Substrat pour les plaques de revêtement : Utilisé pour la synthèse de l’ADN NPC, l’entrée en phase S et les tests de
nombre de cellulesFibronectinSigmaF1141Substrat pour le revêtement des plaques : Utilisé pour le dosage de la neurite.
Poly-D-LysineSigmaP0899Substrat pour l’enrobage des plaques
de pénicilline/streptomycineThermoFischer Scientific15140122Antibiotique, composant du NIM, 100 % d’expansion et 30 % d’expansion  ;
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Solution de détachement de cellules  ;
2,5 % Trypsine (10X)Gibco15090-04610X solution enzymatique
0,5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261utilisé dans une solution de trypsine pour soulever des cellules pour un essai de synthèse de l’ADN
tritié [3H]-thymidinePerkinElmerNET027E001Tritium radioactif, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Flacons à scintillation Fisherbrand03-337-1Flacons pour comptage par scintillation liquide
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501  ;Cocktail à scintillation liquide
LS 6500 compteur à scintillation liquide polyvalentBeckman Coulter8043-30-1194Compteur à scintillation liquide
Skatron Semi-automatique Cell Harvester Type 11019Dispositifs moléculaires & Skatron Instruments, Inc.Récupérateur de cellules
semi-automatique Click-iT EdU Alexa Fluor® ; 488 Kit d’imagerieThermoFisher ScientificC10337EdU et kit de coloration pour le test d’entrée en phase S
Trypan Blue Solution, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061Évaluation de la viabilité des cellules
Papier filtre GF/CGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Papier filtre en fibre de verre
Facteur de croissance humain basique FGF-2Peprotech100-18B
Polypeptide activateur d’adénylate cyclase hypophysaire (PACAP-38)NeuropeptideBACHEMH-8430
Matrigel essai

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9(2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

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Proliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

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