In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Wan-Shan Yang; Mel Campbell; Hsing-Jien Kung; Pei-Ching Chang

doi:10.3791/56629

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Article de méthode

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

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DOI :

10.3791/56629

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29 janvier 2018

Wan-Shan Yang¹ , Mel Campbell² , Hsing-Jien Kung²^,³^,⁴^,⁵ , Pei-Ching Chang¹^,⁶

¹Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, ²UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, ³Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, ⁴Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, ⁵Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, ⁶Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

Dans cet article

Résumé

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

Résumé

Modification de petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) est une importante modification poteau-de translation (PTM) qui intervient dans la transduction du signal principalement par le biais d’interactions protéine-protéine de modulation. Semblable à la modification de l’ubiquitine, SUMOylation est réalisée par une cascade enzymatique séquentielle dont E1-activation enzymatique (SAE1/SAE2), enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et E3-ligase (c.-à-d., famille PIAS, RanBP2 et Pc2). Cependant, différent de l’ubiquitination, une ligase E3 n’est pas essentiel pour la réaction, mais ne fournissent la précision et l’efficacité pour la conjugaison de SUMO. Protéines modifiées par SUMOylation peuvent être identifiés par l’essai in vivo avec par immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques substrat et immunoblotting avec des anticorps spécifiques à SUMO. Toutefois, la démonstration de l’activité protéine SUMO E3 ligase exige en vitro reconstitution de SUMOylation dosages utilisant des enzymes purifiées, substrat et protéines SUMO. Étant donné que dans les réactions in vitro , habituellement SAE1/SAE2 et Ubc9, seuls sont suffisants pour la conjugaison de SUMO, amélioration de SUMOylation par une ligase E3 putative n’est pas toujours facile à détecter. Nous décrivons ici une mis à jour le in vitro SUMOylation protocole qui identifie toujours modification de SUMO à l’aide d’un système in vitro reconstitué. Un protocole étape par étape pour purifier catalytiquement active K-bZIP, une ligase E3 SUMO-2/3 virale, est également présenté. Les activités de SUMOylation de la K-bZIP purifiée figurent sur p53, un objectif bien connu de SUMO. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour élucider roman SUMO E3 ligases, mais aussi pour avoir révélé leur spécificité paralogue SUMO.

Introduction

Modification de SUMO a été initialement identifiée comme une modification post-traductionnelle réversible (PTM) qui régule la stabilité protéique¹. En plus de la conjugaison directe, SUMO peut être attaché à une protéine par l’intermédiaire des interactions non covalentes par SUMO interaction motifs (SIMs)². Similaire à la liaison de tyrosyl-phosphorylation par les molécules d’héberger l’homologie Src 2 (SH2) ou la liaison de la phosphotyrosine (PTB) domaines³^,⁴, modification de SUMO fournit une plateforme d’interaction additionnelle pour sélective recrutement de....