Article de méthode

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

DOI :

10.3791/56629

⸱

29 janvier 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, 2UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, 4Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, 6Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modification de petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) est une importante modification poteau-de translation (PTM) qui intervient dans la transduction du signal principalement par le biais d’interactions protéine-protéine de modulation. Semblable à la modification de l’ubiquitine, SUMOylation est réalisée par une cascade enzymatique séquentielle dont E1-activation enzymatique (SAE1/SAE2), enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et E3-ligase (c.-à-d., famille PIAS, RanBP2 et Pc2). Cependant, différent de l’ubiquitination, une ligase E3 n’est pas essentiel pour la réaction, mais ne fournissent la précision et l’efficacité pour la conjugaison de SUMO. Protéines modifiées par SUMOylation peuvent être identifiés par l’essai in vivo avec par immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques substrat et immunoblotting avec des anticorps spécifiques à SUMO. Toutefois, la démonstration de l’activité protéine SUMO E3 ligase exige en vitro reconstitution de SUMOylation dosages utilisant des enzymes purifiées, substrat et protéines SUMO. Étant donné que dans les réactions in vitro , habituellement SAE1/SAE2 et Ubc9, seuls sont suffisants pour la conjugaison de SUMO, amélioration de SUMOylation par une ligase E3 putative n’est pas toujours facile à détecter. Nous décrivons ici une mis à jour le in vitro SUMOylation protocole qui identifie toujours modification de SUMO à l’aide d’un système in vitro reconstitué. Un protocole étape par étape pour purifier catalytiquement active K-bZIP, une ligase E3 SUMO-2/3 virale, est également présenté. Les activités de SUMOylation de la K-bZIP purifiée figurent sur p53, un objectif bien connu de SUMO. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour élucider roman SUMO E3 ligases, mais aussi pour avoir révélé leur spécificité paralogue SUMO.

Introduction

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Modification de SUMO a été initialement identifiée comme une modification post-traductionnelle réversible (PTM) qui régule la stabilité protéique1. En plus de la conjugaison directe, SUMO peut être attaché à une protéine par l’intermédiaire des interactions non covalentes par SUMO interaction motifs (SIMs)2. Similaire à la liaison de tyrosyl-phosphorylation par les molécules d’héberger l’homologie Src 2 (SH2) ou la liaison de la phosphotyrosine (PTB) domaines3,4, modification de SUMO fournit une plateforme d’interaction additionnelle pour sélective recrutement de SIM contenant effecteur protéines5,6. En plus de la réglementation de la transduction du signal, SUMOylation de facteurs de transcriptionnelles et de molécules de remodelage de la chromatine servent à moduler l’expression de gène7,8. Études de schémas de SUMOylation pangénomique ont révélé que modification de SUMO est associée de positif9,10 ou négative10,11,12 transcription Règlement, en partie en raison de la spécificité de paralogue de SUMOylation.

Il existe trois principales isoformes SUMO pour protéine conjugaison présent dans les cellules de mammifères ; Il s’agit de SUMO-1 et le très homologues SUMO-2 et le SUMO-3 (dénommé SUMO-2/3)13. SUMO est généralement conjugué au résidu lysine (K) dans le motif de ψKxD/E consensus dans la protéine cible. La carte SIM dans le SUMO E3 ligases est responsable de la spécificité de paralogue14. Contrairement aux voies de l’ubiquitination contenant des centaines de E3 ligases, ont été signalés quelques SUMO E3 ligases identifiés15. Ligase E3 SUMO est définies par les propriétés, y compris leur capacité à (i) lier Ubc9, (ii) se lient portion SUMO via un domaine SIM et (iii) améliorer le transfert de SUMO de Ubc9 sur substrat. Ligase E3 n’est pas absolument requis pour SUMO conjugaison16, mais fournit le substrat et la spécificité de SUMO-paralogue. Depuis habituellement seulement une petite fraction de la protéine substrat total est modifié SUMO, détection de protéines SUMOylated en vivo est toujours un défi. Par conséquent, les dosages exacts et reproductibles sont nécessaires afin d’élucider la fonction précise de modification du SUMO.

L' in vitro SUMOylation test, qui évalue la capacité de Ubc9 purifié de catalyser la SUMOylation de substrats protéiques, est un dosage reconnu pour l’étude de SUMO modification17. Toutefois, l’activité ligase E3 SUMO dans la plupart des cas ne peuvent pas être détectée ou ne peut être détectée avec muté ligase SUMO avec forte activité de ligase E3 SUMO et de spécificité de substrat faible par le protocole standard en raison de la présence d’une quantité abondante de Ubc918 . La réussite de ce test dépend en grande partie le titrage prudent de Ubc9 purifié. L’essai in vitro SUMOylation avec décrite ici est modifié par rapport à une norme SUMOylation protocole (voir Table des matières). L’observation des modification de SUMO mondiale accrue au cours de la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) nous a amenés à identifier la ligase E3 SUMO virale qui peut-être être responsable de la régulation de SUMOylation. Après une projection à petite échelle des protéines interagissants de viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 a été identifié comme un nouveau substrat. Dans ce protocole, nous montrent en détail dans les étapes impliquées dans l’expression et purification de type sauvage K-bZIP, une ligase E3 SUMO virale avec spécificité SUMO-2/3 des cellules d’insecte. La capacité de la K-bZIP purifiée afin d’améliorer la SUMOylation de p53, un substrat bien connu de SUMO, est évaluée en présence de quantités réduites d’enzymes E1 et E2. À l’aide de ce test de SUMOylation modifié, chercheurs peuvent sûrement définissent les capacités de ligase E3 SUMO SUMOylate roman ou substrats connus, qui est une première étape dans l’étude des protéines SUMOylation. En outre, cette méthode permet d’identifier les nouveaux SUMO E3 ligases avec activité de ligase faible mais la spécificité de substrat de haute.

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Protocole

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1. préparation des Baculovirus Expression constructions

  1. Purifier le SUMO E3 ligase K-bZIP en clonant l’ADNc de K-bZIP19 dans un vecteur de baculovirus expression double (voir Table des matières) avec une balise épitope N-terminale. Nous avons eu des succès à l’aide d’une balise de l’octapeptide (indiquée dans le protocole comme vecteur-tag-K-bZIP).
    Remarque : La matrice d’ADN pour le clonage de K-bZIP polymerase chain reaction (PCR) est cDNA reverse transcription de l’ARN isolé de cellules TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 suite de traitement doxycycline20.
    1. Transfert K-bZIP ADNc pleine longueur19 dans le vecteur d’expression double avec CpoI sites de clonage. CPO J’ai digérer le produit PCR et 1 µg du vecteur d’expression double à 37 ° C pendant 3 h21.
    2. Séparer et extraire l’ADN digéré après électrophorèse sur gel d’agarose 0,8 %22. Ligaturer l’insert (K-bZIP) et vector par T4 DNA ligase à 16 ° C, pendant 30 min selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).
    3. Ajouter 5 µL de ligature ADN à 50 µL compétentes d' e. coli cellules « A » (voir Table des matières) dans un tube de 1,5 mL. Mettre sur la glace pendant 30 min. Puis, incuber le tube de 1,5 mL dans un bain d’eau de 42 ° C pour 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.
    4. Ajouter 600 µL de milieu O.S.C. (0,5 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) tryptone, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 20 mM MgSO4et 4 % (p/v) de glucose) dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Puis, centrifuger le tube à température ambiante pendant 3 min à 600 g.
    5. Retirer le surnageant, resuspendre le culot avec 60 µL de milieu Luria-Bertani (LB, 1 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v) extrait de levure et 85 mM NaCl) et bien le répartir sur les boîtes de gélose LB contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber la gélose à 37 ° C pendant 16 h23,24.
    6. Sélectionnez 1 colonie d’inoculer dans le milieu LB de 5 mL contenant 100 µg/mL ampicilline et à la culture à 37 ° C pendant 16 h avec 250 tr/min secouant. Ensuite, extrayez le plasmide, vecteur-tag-K-bZIP, par un kit d’extraction de plasmide selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).
  2. Générer le bacmid recombinant contenant la balise-K-bZIP par transformation de la vector-tag-K-bZIP en compétent e. coli cellules « B » (voir Table des matières).
    1. Mélanger 0,2 µg vector-tag-K-bZIP plasmide et 100 µL compétente E. cellules de coli « B » dans un tube de 1,5 mL et le mettre sur glace pendant 30 min. Incuber le tube dans le bain-marie à 42 ° C pendant 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.
    2. Ajouter 900 µL de milieu O.S.C. dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 4 h avec rotation à 50 tr/min. Ensuite, prenez 10 µL de milieu, ajouter une supplémentaire 50 µL de S.O.C moyen pour diffuser sur plaques de gélose LB contenant 50 kanamycine µg/mL, 7 gentamicine µg/mL, 10 µg/mL, substrat de galactosidase 100 µg/mL et à 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) et incuber les boîtes pendant 48 h à 37 ° C.
    3. Ensemencer une colonie blanche dans le milieu LB de 5 mL contenant 50 µg/mL kanamycine, gentamicine 7 de µg/mL et 10 tétracycline µg/mL. Incuber à 37 ° C avec 250 tr/min, secouer pendant 16 h.
    4. Isoler la bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP, quantifier et remettre en suspension à une concentration de 1 µg/µL25.
  3. Générer des baculovirus recombinants exprimant tag-K-bZIP par transfection 1 µg de bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP en cellules Sf9 dans un puits d’une plaque de 6 puits.
    1. Graine 2 x 106 Sf9 cellules (voir Table des matières) dans un milieu de 2 mL Grace insecte fourni avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % de gentamicine dans chaque puits d’une plaque 6 puits, puis incuber à 27 ° C pendant 1 h.
    2. Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C (voir Table des matières) à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu trypan Coloration ; viabilité cellulaire devrait dépasser 95 %. Maintenir les cellules en utilisant un ratio de sous-culture de 1:3 tous les 2-3 jours (densité minimale ~0.5 x 106 cellules/mL).
    3. Ajouter 2 µL bacmid ADN (1 µg/µL) et 98 µL réduit médias de sérum (voir Table des matières) dans un tube de 2 mL. Puis, ajoutez 4 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) pour le tube et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
    4. Ajouter ce mélange de transfection (104 µL) dans chaque puits et incuber à 27 ° C pendant 12 à 16 h.
    5. Retirez les supports épuisés avec aspiration douce et remplacez par 2 mL d’insecte moyen frais Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine. Les cellules Sf9 adhèrent librement à la surface de la plaque et ne sera pas dérangés avec aspirant doucement.
  4. Recueillir les baculovirus recombinant après transfection et amplifient les baculovirus pour obtenir des stocks de haut-titre (P1) pour d’autres expériences.
    1. 72 h après avoir changé de support, gratter le Sf9 cellules à l’aide d’un poussoir de cellules stériles, recueillir le surnageant de chaque puit individuel dans un tube de 1,5 mL et vortexer pendant 10 s.
    2. Centrifuger à 4 ° C pendant 3 min à 150 x g. frais viré surnageant comme P0 baculovirus et partie aliquote dans des tubes de 1,5 mL (baculovirus 1 mL dans chaque tube). Conserver à-80 ° C.
    3. Cellules7 Sf9 graine 1 x 10 dans le milieu d’insecte de 10 mL Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine dans une boîte de Pétri de 10 cm et incuber à 27 ° C pendant 1 h.
    4. Pour l’amplification des baculovirus recombinant exprimant sa balise-K-bZIP, ajouter 0,5 mL de baculovirus P0 aux cellules Sf9 ensemencés et incuber à 27 ° C pendant 48 h.
    5. Recueillir le surnageant comme P1 baculovirus dans un tube de 15 mL et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.

2. purification du K-bZIP

  1. Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn comme indiqué au point 1.3.2.
  2. Le jour de la transduction, ajouter 1 mL du surnageant contenant des baculovirus (P1) dans 250 mL de cellules Sf9 avec une densité de 2 x 106 cellules/mL.
  3. Incuber les cellules Sf9 pendant 72 h à 27 ° C dans un agitateur orbital avec 140 t/mn secouer, puis recueillir par centrifugation à 2 740 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  4. Éliminer le surnageant et lyse granules cellulaires dans 10 mL de tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M de NaCl, 1 % de détergent un glycérol 2 % (voir Table des matières), inhibiteur de la protéase cocktail) et tourner à 50 tr/min à l’aide d’un mélangeur de suspension à 4 ° C pendant 30 min.
  5. Cellule de centrifugeuse lysat à 15 000 x g pendant 15 min recueillir le liquide surnageant.
  6. Pour purifier le tag-K-bZIP, incuber les lysats cellulaires (10 mL) avec 50 µL d’anticorps marqués des billes magnétiques dans des tubes en polypropylène 14 mL et faire tourner à 50 tr/min pendant 3 h à 4 ° C à l’aide d’un mélangeur de suspension. Après leur capture de protéine, pellet les perles en 800 x centrifugation g pendant 30 s à 4 ° C. Enlever la plupart du surnageant et remettre en suspension les perles dans le volume résiduel d’environ 1 mL transférer dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.
  7. Lavez la protéine capturée en plaçant le tube contenant les perles sur un support magnétique et retirer le surnageant après que les billes magnétiques ont pleinement adhéré à la paroi du tube.
  8. Laver les billes avec tampon de lyse quatre fois.
    1. Ajouter le tampon de lyse 1 mL dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois. Placer le tube de 1,5 mL sur un support magnétique et éliminer le surnageant comme indiqué au point 2.7.
    2. Répétez l’étape précédente, un autre 3 fois.
  9. Laver une fois les perles avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
    1. Ajouter 1 mL de PBS (137 mM NaCl, KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4 2,7 mM) dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois.
    2. Mettre le tuyau de 1,5 mL sur un support magnétique, puis enlever le surnageant.
  10. Éluer tag-K-bZIP protéine de billes magnétiques anticorps marqués en ajoutant 100 µL de l’octapeptide 150 µg/mL dilué dans du PBS dans un tube de 1,5 mL. Tourner le tube pendant 10 min à 50 tr/min par mixer de suspension à la température ambiante. Ensuite, replacez le tube sur le support magnétique et recueillir le surnageant contenant K-bZIP dans un tube propre 1,5 mL.
  11. Analyse 1-5 µL purifiée tag-K-bZIP protéine par SDS-PAGE, suivie de bleu de Coomassie26. Chargez 2 µg, 1 µg et 0,5 µg échantillons d’albumine sérique bovine (BSA) sur le même gel et utilisent pour quantifier avec un programme de traitement d’image, comme ImageJ. Estimation de la concentration de K-bZIP par comparaison aux normes BSA.
  12. Le K-bZIP purifiée est maintenant prêt à être utilisé dans chaque essai de SUMOylation. Diluer le K-bZIP dans du PBS à une concentration finale de 100 ng/µL et magasin en petites parties aliquotes à-80 ° C.

3. SUMOylation Assay

  1. Ajouter 3 µL de 100 ng/µL de tag-K-bZIP purifiée dans le mélange maître de chaque in vitro SUMOylation réaction. Composants en mélange maître contiennent 1 µL de tampon de protéines, 1 x tampon de SUMOylation, protéine de p53 0,5 µL (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 activation enzymatique (conc. stock : 1 µM), 50 nM de E2 conjugaison (conc. stock : 10 µM) et 250 nM chacun des peptides SUMO (SUMO-1 , SUMO-2 ou SUMO-3 ; conc. stock : 5 µM) pour un volume final de 17 µL.
  2. Mélanger doucement et incuber la réaction à 30 ° C pendant 3 h. arrêter la réaction en ajoutant 20 µL de tampon de charge SDS-PAGE 2 (100 millimètres Tris-HCL pH 6,8, dodécylsulfate de sodium 4 %, 0,2 % (p/v) bleu de bromophénol, 20 % (v/v) de glycérol et 200 mM β-mercaptoéthanol) et dénaturer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.
  3. Séparer les échantillons SDS-page, de transférer les protéines séparées sur une membrane en PVDF en utilisant un dispositif de transfert électrophorétique demi-sec et analyse par Western blot à l’aide d’anticorps anti-p53.
    1. Mettre en place l’appareil de gel comme à l’étape 2.11 et charger 20 µL de l’échantillon dans les puits du gel.
    2. Exécutez le gel de 10 % dans une constante courante à 80 V pour environ 120 min (jusqu'à ce que la bande de colorant atteigne le bas du gel). À l’issue de l’électrophorèse, couper l’alimentation.
    3. Débranchez l’appareil gel et gel de cassettes pour sortir le gel et flotter le gel dans le tampon de transfert semi-sec (48 mM Tris-HCl, glycine de 39 mM, méthanol 20 %) pendant 5 min.
    4. Prenez un autre récipient et laisser tremper la membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 min. Ensuite, sortez PVDF méthanol et mis en mémoire tampon de transfert semi-sec. Agiter délicatement la membrane pendant 5 min.
    5. Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil d’électrophorèse demi-sec.
    6. Pré mouillage du filtre en papier et préparez un sandwich de gel sur l’anode de platine de fond comme suit : papier filtre, PVDF membrane, gel et papier filtre.
    7. Cathode sûr cover plaque et de la sécurité, puis exécutez blot à 15 V un courant constant de 90 min. tour coupe l’alimentation électrique, débrancher les appareils semi sèche et retirer la membrane PVDF.
    8. Membrane de PVDF bloc avec un tampon de blocage (lait écrémé 5 % dans un tampon TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % de détergent B (voir Table des matières), pH 7,6)) à température ambiante pendant 1 h avec 30 tr/min, secouant par agitateur orbital.
    9. Hybrider les membranes PVDF avec anticorps anti-p53 dilué (1:1, 000) dans un tampon bloquant pour 12-16 h à 4 ° C avec 30 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension.
    10. Retirez la membrane en PVDF dans un récipient et mettre dans un mélange TBST. Rincer les membranes PVDF avec un mélange TBST deux fois plus.
    11. Tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min à 45 tr/min, secouant par agitateur orbital.
    12. Hybrider les membranes PVDF avec anticorps de anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) diluée (1:4, 000) dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante avec 30 t/mn, secouant à l’aide d’un mélangeur de suspension.
    13. Laver la membrane en PVDF avec un mélange TBST 3 fois comme décrit à l’étape 3.4.10.
    14. Faire tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min avec 45 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension. Supprimez un mélange TBST et PBS pour préserver la membrane en PVDF à 4 ° C pendant 12 h.
    15. Mélanger le réactif substrat chimioluminescent améliorée (substrat de l’ECL) 1 et 2 (1:1) (voir la Table des matières). Retirer la membrane PVDF le PBS, éponger brièvement avec un essuie-tout ou un essuie-glace arrière légers pour absorber l’excès d’humidité et immédiatement ajouter 400 µL de réactif de l’ECL à la surface de chaque membrane pour 3-5 min. enlever excès ECL réactif en tamponnant brièvement, mais ne permettent pas de la m embrane pour sécher complètement.
    16. Exposer la tache à l’aide d’un système d’imagerie luminescence ou autoradiographie film27.

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Résultats

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Selon les informations fournies par le fabricant, la quantité standard d’enzyme E1 et E2 dans le dosage de la SUMOylation est de 50 nM et 500 nM, respectivement. La quantité minimale d’E2 conjugaison Ubc9 qui est capable de SUMOylate p53 a été tout d’abord déterminée par un essai in vitro SUMOylation avec. Aussi bas que le cinquième de la quantité de Ubc9 utilisé dans le standard en vitro protocole d’analyse de SUMOylation a pu efficacement SUMOylate p53 (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L' in vitro SUMOylation protocole décrit ici régulièrement sert à établir le statut de SUMOylation de substrats de Ubc9 identifiés. La limitation majeure en utilisant le protocole standard utilisé pour étudier la fonction de SUMOylation de ligase E3 SUMO est l’abondance de SUMO E1 activation et enzymes de conjugaison E2 Ubc9 qui maximisent la conjugaison de SUMO dans des systèmes in vitro . Compte tenu de ce défi, nous croyons que par titrage de la quantité d’enzymes SUMO E1 et E2 au niveau qu’on peut d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de la ministère des sciences et de la technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 au PCC), de l’Institut National de recherche en santé (INRH-EX105-10215BC au PCC), du ministère de la Science et technologie (plus 105-2314-B-400-019 à HJK) et de la National Health Research Institute (INRH MG-105-SP-10, INRH MG-106-SP-10 au HJK). Ce travail a été également soutenu en partie avec l’Université nationale Yang-Ming sur publication du manuscrit de PCC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou réparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
pFastBacInvitrogen10359-016vecteur baculovirus à double expression vecteur
pCR2.1-TOPO vecteurproduit PCRInvitrogen
compétente  ; E. coli DH5&alpha ;Yeastern BiotechFYE678-80VLcompétent E. coli cellules A
E. coli DH10BacInvitrogen10359-016compétent E. coli cellules B
FugeneHDRoche04709705001réactif de transfection
Opti-MEMGibco31985062milieu sérique réduit
T4 LigaseNEW England BioLabsM0202S
CpoI (RsrII)Thermo ScientificER0741
Bluo-galThermo ScientificB1690substrat galactosidase
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Grace' s Insecte MoyenGibco11605094
Sérum de veau fœtalGibco10082147
GentamicineThermo Fisher15750060
AmpicillineSigma-AldrichA9393-25G
KanamycinSigma-AldrichK0254-20ML
gentamicineGibco15710-064
tétracyclineSigma-Aldrich87128-25G
LB BouillonMerk1.10285.0500
HEPESSigma-AldrichH4034-100G
NaClSigma-AldrichS9888-5KG
KClMerk1.04936.1000
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136-500G
KH2PO4J.T.Baker3246-01
dodécylsulfate de sodiumMerk1.13760.1000
&beta ;-mercaptoethanolBio-Rad161-0710
TRIS (Base)J.T.Baker4109-06
Lait écréméFonterra
glycérolJ.T.Baker2136-01
Triton X-100Amresco0694-1Ldétergent A
Tween 20Amresco0777-500MLdétergent B
Poloxamer 188 solutionSigma-AldrichP5556-100MLdétergent C
Inhibiteur de protéase Cocktail TabletRoche04 693 132 001
3x Flag peptideSigmaF4799
anti-FLAG m2 Perles magnétiquesSigma-AldrichM8823perles magnétiques marquées par anticorps
SUMOlink SUMO-1 KitActive Motif40120protocole SUMOylation standard  ;
SUMOlink SUMO-2/3 KitActive Motif40220protocole SUMOylation standard  ;
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
QIAGEN Plasmid Mini KitQIAGEN12123Kit d’extraction de plasmides
Tubes en polypropylène Falcon352059
Boîte de PétriFalcon351029
Cell lifterCorningCNG3008
Pointe de chargementSorenson BioScience28480
PVDFPerkinPapierNEF1002
buvardBio-Rad1703932
Mini appareil de gel de dalle (Bio-Rad Mini Protean II Cell)Bio-Rad1658001 EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Cellule de transfert électrophorétiqueBio-Rad1703940
Pierce ECL Western BlottingThermo32106ECL mélangeur
de suspension de réactifsDigisystem laboratory instruments  ; Inc.Agitateur orbital SM-3000
Kansin instruments Co.OS701
ImageQuant LAS 4000
imageur biomoléculaire		GE Healthcare28955810
Sf9Thermo ScientificB82501
anticorps anti-p53Cell Signaling#9282
anticorps anti-lapinGE HealthcareNA934-1ML
de cellule filtre

Références

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