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Article de méthode

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

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DOI :

10.3791/56631

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26 janvier 2018

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1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Résumé

Le développement du cerveau est un processus complexe, qui est contrôlé de manière temporo-spatiale par des gradients de morphogènes et différents programmes transcriptionnelles. En outre, des modifications épigénétiques chromatine, comme la méthylation des histones, ont un rôle important pour établir et maintenir des destins de cellule spécifique au sein de ce processus. La grande majorité de la méthylation des histones se produit sur la queue de l’histone flexible, qui est accessible aux modificateurs d’histone, gommes à effacer et histones lecteur. En revanche, la méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3 et est impliquée dans les différentes fonctions du développement. Méthylation de l’H3K79 est conservée évolutives et se trouvent dans un large éventail d’espèces de l’Homo sapiens à Saccharomyces cerevisiae. La modification se produit dans différentes populations cellulaires au sein d’organismes, y compris les progéniteurs neuraux. L’emplacement de la méthylation de H3K79 dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est difficile à évaluer. Ici, nous présentons des méthodes pour isoler et progénitrices corticale de la culture des cellules (CPC) de tissus embryonnaires cerveau cortical (E11.5-E14.5) ou les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux (CGNPs) de tissus de postnatal (P5-P7) et efficacement immunoprécipitation H3K79me2 pour la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de génome.

Introduction

Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »1. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes4ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale5. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,6). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes2.

Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris9. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux10. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires10. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés11. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination12. Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes10.

Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN13. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison16, dommages à l’ADN réponse17et l’empreinte génomique18. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés19 et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones20. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue14, 19,,21. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte22. La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine23. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation27. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de28,E10.529. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement30. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development31, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement32et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse33. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris32. Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues23. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.

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Protocole

Comités de protection des animaux de l’Université de Fribourg et les autorités locales a approuvé toutes les expériences animales (G12/13, G16/11), mentionnés dans le protocole suivant.

1. les préparatifs

  1. Préparations pour l’isolement de la SCD
    1. Mis sur pied chronométrée accouplement afin d’obtenir des embryons à des stades différents du développement du cortex (entre E11.5 et E14.5). Utilisez la souris de la souche NMRI (Naval Medical Research Institute) qui ont au moins 8 semaines. Après l’accouplement, envisager un plug vaginal positif au E0.5.
    2. Pour avoir suffisamment de matière, utiliser une litière de souris NMRI pour une seule puce H3K79me2 des cortex de E12.5 ou E14.5. Pour les stades embryonnaires, utiliser une litière pour des analyses plus de puce (moyenne de la taille des portées NMRI : 10 embryons).
    3. Thermoélectrique Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) et solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C (stockage à long terme à la droite).
    4. Equilibrez la 4 ° C stocké la trypsine-EDTA (0,05 % p/v) à 37 ° C.
    5. Moyenne de cellules corticales Prepare (CCM) : Compléter le support pour les neurones (voir Table des matières) avec la concentration finale de 2 % (v/v) Supplément de B-27, 5 µg/mL Apo-transferrine, 1 µg/mL de glutathion, 0,5 mM de L-glutamine, dismutase de superoxyde de 0,8 µg/mL et 1 % (v/v) Mélange antibiotique de pénicilline-streptomycine-néomycine. Conserver à 4 ° C. Pour l’expérience, équilibrer le milieu à 37 ° C.
    6. Décongeler l’aliquote de sérum de veau foetal (FCS), il (50 mL chacune) et équilibrer une aliquote à 37 ° C (stockage à long terme à-20 ° C).
    7. Préparer des stocks de DNAse 1 (10 mg/mL) en H2O pour la culture cellulaire. Stocker les aliquotes à-20 ° C.
    8. Le cas échéant, dissoudre les inhibiteurs spécifiques de DOT1L EPZ-5676 ou SGC0946 dans le DMSO à une concentration de stock de 100 mM. Appliquer une concentration de fin de 1 à 5 µM pour les cellules au jour J0 et réappliquez l’inhibiteur tous les deux jours.
    9. Pour la culture du CPC, enduire plaques de culture cellulaire (puits 6 ou 12 puits) avec la poly-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL dans le pH de l’acide borique 150 mM 8,4) pendant au moins 1 h à RT et ensuite avec la laminine (1 mg/mL) dans un milieu CCM à 37 ° C pendant la nuit.
  2. Préparations pour l’isolement de CGNP
    1. Organiser un accouplement approprié de souris pour produire des animaux de P5-P7 pour l’isolement du cervelet (3-5 animaux par puce et condition).
    2. Préparer HBSS/Glucose en ajoutant 6 mg/mL de glucose à tampon HBSS.
    3. Préparer le milieu de culture de cellules CGNP (CGM) en ajoutant 1 % (v/v) Supplément de N2, 1 % (v/v) pénicilline-streptomycine-néomycine, 25 mM KCl et 10 % de FCS à DMEM-F12. Pour la culture de CGNP préparer CGM milieu sans FCS, mais dont le hérisson sonic de 0,6 µg/mL (SHH) (CGM-SHH) et elle est proportionnelle à 37 ° C si nécessaire.
    4. Enduire les plaques de culture de 6 puits cellulaire avec 100 µg/mL poly-D-lysine pendant 1-2 h à ta suppression de cellules gliales. Par la suite laver deux fois avec les ddH stérile2O et sécher les plaques. Stocker les plaques pendant maximum une semaine à 4 ° C.
    5. Pour la culture des plaques de culture de 6 puits cellulaire de manteau de CGNPs avec la poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) à 4 ° C la nuit. Par la suite laver deux fois avec H2O pour culture cellulaire et sécher les plaques.
      Remarque : Les plaques peuvent être stockés pendant maximum une semaine à 4 ° C.
    6. Préparer la trypsine (p/v) de 0.025 % HBSS/glucose et elle est proportionnelle à 37 ° C si nécessaire.
  3. Préparations pour la puce de H3K79me2
    1. Préparer la PFA (1 % dans du PBS, pH 8) fraîchement avant réticulation chromatine. Pour préparer la PFA chauffer 50 mL de PBS au micro-ondes à maximum 65 ° C. Pendant l’agitation constante ajouter 0,5 mg PFA pour le PBS. Puis ajouter 50 µL 10 M NaOH et attendez que PFA est dissoute. Ajouter par la suite, 42,5 µL HCl (37 % v/v) pour obtenir un pH de 8. Vérifiez le pH à nouveau et puis de laisser la solution de 1 % PFA atteindre RT
    2. Préparer les stocks de RNase (1 mg/mL) et de la protéinase K (20 µg/µL) séparément en stérile ddH2O. stocker les aliquotes à-20 ° C.
    3. Préparer les tampons et les réactifs suivants : PBS contenant 0,02 % Tween, tampon de lyse, Glycine, tampon de Dilution, ChIP mémoire tampon 1, tampon 2 de la puce, puce tampon 3 et tampon TE et les stocker à 4 ° C. Préparer le tampon d’élution fraîchement chaque fois.
      1. Préparer les PBS contenant 0,02 % Tween. Magasin pour au plus une semaine à 4 ° C.
      2. Préparer le tampon de lyse en utilisant 50 mM Tris à pH 8,0, 10 mM EDTA, dodécylsulfate de sodium à 1 % (p/v) (SDS) et 1 x inhibiteur de la protéase.
      3. Préparer la glycine de 2,5 M.
      4. Préparer le tampon de dilution à l’aide de Tris de 20 mM à pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton, SDS de 0,25 % (p/v) et 1 x inhibiteur de la protéase.
      5. Préparer la puce mémoire tampon 1 à l’aide des Tris de 20 mM à pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton et 0,2 % (p/v) SDS.
      6. Préparer la puce mémoire tampon 2 à l’aide de 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton et 0,2 % (p/v) SDS.
      7. Préparer la puce mémoire tampon 3 utilisation 20 mM Tris pH 8,0, LiCl, EDTA, 2 mM 250 mM 1 % (v/v) NP-40 et 1 % (p/v) SDS.
      8. Préparer le tampon TE utilisant 20 mM Tris pH 8,0 et 2 mM EDTA.
      9. Préparer le tampon d’élution frais contenant 1 % (p/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. neurales progénitrices isolement du tissu cérébral

  1. Isolement et culture en option du SCD
    1. Euthanasier les animaux gravides par dislocation cervicale et de transférer les embryons à HBSS glacée.
    2. Supprimer le crâne avec des ciseaux et isoler le cerveau, puis supprimer les méninges, le cas échéant, avec les petites pinces et isolat cortex (entiers, DT, soit VT) des deux hémisphères en supprimant toutes les autres parties du cerveau sous le champ binoculaire à l’aide de petites pinces et, le cas nécessaire, petits ciseaux. Stocker le cortex isolé dans un tampon HBSS 5 mL à 4 ° C dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifuger le matériau cérébraux isolés pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C.
    4. Laver le cortex avec 5 mL HBSS glacée et les homogénéiser avec une pointe de pipette de 1 mL par pipetage de haut en bas. Si nécessaire, couper l’extrémité de l’embout de la pipette.
    5. Centrifuger l’échantillon homogénéisé pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Retirez le HBSS.
    6. Ajouter 3 mL de trypsine et incuber l’échantillon pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Ajouter 1 mL de FCS et 30 µL de DNase 1 5 mL CCM à l’échantillon et homogénéiser l’échantillon avec une pipette de verre de 5 mL en pipettant également soigneusement de haut en bas.
    8. Centrifuger les cellules isolées pendant 5 min à 1000 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 5 mL CCM et homogénéiser l’échantillon de nouveau.
    9. Diluer une aliquote de l’échantillon et le compter avec une chambre de comptage Neubauer. Un montant moyen de 4,5 x 106 cellules par embryon est prévu. Pour la culture de la SCD isolé, passez à l’étape 2.1.10. Pour la puce, procéder immédiatement à l’étape 3.
    10. Pour la culture, plaque le SCD sur la poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) et de la laminine (1 mg/mL) enduit plats à une densité variant de 8 x 104 et 2,5 x 105 cellules/cm2 dans le milieu de la CCM et les incuber à 37 ° C, 5 % de CO2et 100 % d’humidité relative.
    11. Comme les CPCs commencent à se différencier en neurones en culture cellulaire (après environ 4 jours), considérer la date de la dissection comme jour in vitro 0 (jour 0). Pour des durées plus longues de la culture, la moitié du milieu changer chaque jour quatrième avec un milieu frais CCM.
    12. Appliquer 1 à 5 µM SGC0946 ou EPZ5676 dissoute dans le DMSO à jour 0 (4-5 h après l’isolement de cellules) et actualisez-le tous les deux jours. Utilisation DMSO comme un traitement de la commande. Tester l’efficacité d’un traitement inhibiteur via des méthodes standard immunoblot, si nécessaire.
  2. Isolement et culture en option du CGNPs
    1. Euthanasier P5-7 animaux par décapitation à l’aide de ciseaux. Enlever la peau du cuir chevelu, ouvrir le crâne et enlever le cerveau à l’aide de pinces et petits ciseaux. Isoler le cervelet et transférez-le vers glacee HBSS/Glucose. Supprimer tous les méninges et les vaisseaux sanguins et transférer le sembable dans 15 mL tubes remplis de froid HBSS/Glucose.
    2. Laver le sembable trois fois avec 10 mL glacee HBSS/Glucose (Collectionnez-les par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C) et homogénéiser sembable ultérieurement en pipettant également doucement de haut en bas avec une pipette 1 mL (maximum 2 - 3 fois) pour obtenir 0,5 à 1 mm3 fragments.
    3. Ajouter 5 mL de 0.025 % trypsine HBSS/glucose et incuber le tissu en agitant dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min. arrêt de la digestion en ajoutant 5 mL du CGM et recueillir le tissu par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Retirez le surnageant et triturer les tissus avec une pointe de pipette de 1 mL dans 1 mL CGM et transférez-le dans un nouveau tube de 15 mL.
      Remarque : Il est important d’éviter les bulles d’air.
      1. Ajouter 5 mL CGM et incuber le mélange pendant 2 min sur la glace pour régler les restes de tissus. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 15 mL. Ajouter 2 mL CGM au tissu résiduel et répéter la procédure de trituration.
    5. Réunir les fractions surnageantes (sans restes de tissu, environ 10 mL au total) et centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C à recueillir les cellules du cervelet. Resuspendre le culot dans 10 mL CGM.
    6. Car les astrocytes respectent plus vite et plus fort poly-D-lysine que CGNPs, plaque de cellules de 100 µg/mL poly-D-lysine couché 6-puits-plaques (jusqu'à 4 mL par puits) et incuber pendant 20 min à 37 ° C pour éliminer les astrocytes.
    7. Secouer la plaque et de recueillir le liquide surnageant. Puis centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un tube de 15 mL. Resuspendre le culot dans 10 mL CGM et compter les cellules avec un Neubauer chambre de comptage.
      Remarque : CGNPs sont rondes, petites et de montrer un halo quand image microscope à contraste de phase.
    8. Si nécessaire, les semences les cellules à 37 ° C préchauffé CGM sur plaques de poly-L-ornithine-enduit (3 x 106 cellules / puits-6) et les incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative.
      Remarque : Si l’ensemencement n’est pas effectuée, poursuivez étape 3.1.
      1. Après 6-12 h, change le milieu à CGM-SHH. Traiter le h CGNPs 6 isolé (ou lorsque vous passez à CGM-SHH) après l’isolement avec DOT1L-inhibiteur et DMSO contrôler et renouveler tous les deux jours (Comparez avec 2.1.12). Tester l’efficacité d’un traitement inhibiteur via des méthodes standard immunoblot si nécessaire. Pour la puce, passez à l’étape 3.3.
        NOTE : Laissant CGM sur les plaques (et avec cette FBS) se traduira par la différenciation des CGNPs dans les neurones granulaires cérébelleux (SCT).

3. fixation des cellules et l’inclinaison de la chromatine

Remarque : Effectuez des opérations 3.1 et 3.2 si les cellules ne sont pas cultivées, s’ils sont passez à l’étape 3.3.

  1. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 4 min à 1000 x g et ajouter 1,3 mL de PBS. Transférer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger pendant 4 min à 1 000 x g à 4° C. Laver l’échantillon deux fois à 1,3 mL PBS.
  2. Étape critique : Ajouter 350 µL 1 % PFA à l’échantillon et il incuber 5 min à 22 ° C. Pour arrêter la réaction, ajoutez 18,4 glycine µL et 1 mL de PBS. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 1 000 x g à 4 ° C.
    1. Laver l’échantillon deux fois avec du PBS glacée. Recueillir les cellules fixes par centrifugation pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Conserver les échantillons sur glace à l’avenir.
      NOTE : Le temps de fixation doit être précisément 5 min pour obtenir des résultats optimaux. Nombre de cellules différentes peut-être nécessiter des adaptations de temps.
  3. Étape critique : Culture CGNPs (ou SCD), ajouter à 1 mL 1 % PFA directement dans les puits de plaque de culture cellulaire. Après une incubation de 5 min à 22 ° C, ajouter une quantité appropriée de glycine et de PBS et récolter les cellules avec un grattoir de cellules.
    1. Les cellules de transfert dans des tubes de 1,5 mL et centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Laver l’échantillon deux fois avec du PBS glacée. Recueillir les cellules fixes par centrifugation pendant 5 minat 1 000 x g à 4 ° C. Conserver les échantillons sur glace à l’avenir.
  4. Étape critique : Ajouter 700 µL de tampon de lyse (+ inhibiteur de protéase) et incuber l’échantillon pendant 15 min à 4 ° C. Vortex l’échantillon chaque 5 min. de cisaillement de la chromatine des cellules lysées 3 x 10 min dans le sonicateur (30 impulsions s, 30 s pause) à la puissance maximale.
    1. Assurez-vous que le volume ne dépasse pas 350 µL par tube. Vortex les échantillons chaque 10 min. vérifier le lysat pour noyaux restants avec un microscope à contraste de phase.
      Remarque : Il est important d’obtenir des résultats optimaux de cisaillement (à comparer avec la Figure 1 b) pour une analyse ultérieure. Dans le cas d’autres méthodes pour la tonte de la chromatine, optimiser la tonte à la chromatine des fragments de taille entre 200-500 PB.
  5. Pellet restes cellulaires pour 10 min, 13 000 x g, 4 ° C. Utiliser le surnageant pour l’étape preclearing 5.2. Congeler les échantillons à-20 ° C pour une utilisation ultérieure, si nécessaire.

4. préparation des perles et présélection

  1. Laver les 45 µL protéine A perles magnétiques/ChIP et 20 µL magnétique perles/échantillon avec 1 mL de PBS glacée contenant 0,02 % Tween trois fois à l’aide d’un support magnétique. Ensuite, ajouter 1 mL de PBS glacée aux talons.
  2. Ajouter à 1 mL de PBS glacée et 45 µL perles/ChIP, 3 µg d’anticorps/puce (H3K79me2 ou lapin IgG). Incuber les échantillons pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur pour lier les anticorps aux talons. En fonction de l’anticorps, utiliser ~ 3 µg anticorps/ChIP.
  3. Lavez les anticorps-bound-perles trois fois avec 1 mL de PBS glacée contenant 0,02 % Tween. Ajouter le volume approprié de perle (à partir du volume de billes magnétiques utilisés) de PBS glacée aux lavé anticorps-couplé-talons.
  4. Ajouter 600 µL de tampon de dilution et de 20 µL de billes magnétiques lavés à l’échantillon de contrôle (volume total 1 320 µL) et incuber pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur. Retirez les perles à l’aide d’un support magnétique. Bénéficiez de 5 % (33 µL) des lysats sous forme d’échantillons d’entrée et les congeler à-20 ° C.

5. immunoprécipitation de la chromatine

  1. Diviser l’extrait pré-approuvée en deux tubes (environ 643,5 µL), ajouter le même volume de tampon de dilution et les anticorps-bound-perles (45 µL/échantillon ; H3K79me2 ou lapin IgG). Incuber les échantillons à 4 ° C durant la nuit sur un rotateur.
  2. Laver les billes avec glacee puce buffer 1, tampon 2 de la puce et ChIP 3 pendant 10 min chaque à 4 ° C sur un agitateur. Par la suite, laver trois fois avec tampon TE pendant 5 min à 4 ° C sur un agitateur.
  3. Éluer les perles avec un tampon d’élution pendant 1 h à 1 400 tr/min dans un shaker à température ambiante.
  4. Ajoute les échantillons d’entrée de 10 µg de RNase (1 mg/mL) par échantillon de puce et de 5 µg et incuber les échantillons pendant 30 min à 37 ° C (1 400 tr/min).
  5. Ajouter 100µg protéinase K (20 µg/µL) par ChIP échantillon et 50 µg / entrée et incuber une nuit à 65 ° C à 1 400 tr/min.

6. purification des échantillons d’éclats

  1. Purifier le ChIP et les échantillons d’entrée avec une purification d’ADN nécessaire (voir la Table des matières) selon le manuel. Utilisez les colonnes de purification plus lorsque plus de 5 µg d’ADN est supposé. Éluer l’échantillon avec 2 x 15 µL de tampon d’élution de l’ADN fourni dans le kit.
  2. Effectuer la quantification des échantillons (utiliser 1 µL) en utilisant un fluorophore visualisation et un fluorospectromètre (voir la Table des matières).

7. l’analyse des échantillons par l’intermédiaire de qPCR

  1. Pour la conception d’amorce pour l’analyse de qPCR, extraire des séquences génomiques d’intérêt depuis le navigateur de visionneuse de génomique intégrative (IGV)34. Concevoir des amorces autour du site d’initiation transcriptionnelle (TSS) d’un gène, car H3K79me2 est susceptible d’être situé là. Comme contrôle, envisager non codantes génomique ou des régions environ 10 Ko en amont du TSS ou 10KO en aval de l’extrémité transcriptionnelle du site (TES).
    1. Générer les amorces avec https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ à l’aide d’une taille de produit entre 70 et 200 PB et une température optimale prédéfinie de 60 ° C. Aux fins du procès, utiliser les amorces pour les régions génomiques, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 et Npm1 énumérés au tableau 1.
  2. Tester les amorces nouvellement conçus avec le programme suivant de qPCR, mix master et un gradient de température de recuit entre 58 et 63 ° C, puis sélectionnez la température de recuit avec la plus grande quantité de produit et la qualité.
    1. Appliquer l’électrophorèse de gel d’ADN pour contrôler la taille du produit attendu. Pour l’analyse de qPCR, utiliser un système de détection de PCR en temps réel (voir Table des matières).
    2. Préparer le mélange maître utilisant 10 mélange principal de la DNA polymérase µL, apprêt µL 0,5 vers l’avant (10 µM), 0,5 inverse l’apprêt µL (10 µM), l’eau sans nucléase 4 µL et 5 µL ADN (1 ng/µL).
    3. Utiliser un programme de qPCR 2 étapes comme suit : 5 min à 95 ° C, 50 x (30 s à 95 ° C, 30 s à 58 ° C à 63 ° C) et le gradient de dénaturation constamment à 4 ° C.
  3. Créer une série de dilutions d’échantillons d’ADN génomiques, cisaillés, purifiés (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL et 0,125 ng/µL) et d’utiliser 5 µL pour un essai d’efficacité à l’aide de qPCR. Déterminer la pente de la courbe d’étalonnage et de calculer l’efficacité de l’amorce de la formule suivante :
    Rendement (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Utiliser des amorces avec des rendements entre 90 % et 105 % dans un cas idéal, ou au moins avec des rendements entre 85 et 115 %.
  4. Pour analyser la puce et les échantillons d’entrée, appliquer 0,1-1 ng de puce ADN mélangé avec respectif avant et apprêt inverse, eau exempte de nucléase et maître de l’ADN polymérase se mélangent dans un volume final de 20 µL de chaque réaction de qPCR.
  5. Déterminer les seuils de cycle (Ct) de puce et échantillons d’entrée et de normaliser l’échantillon Ct Ct les valeurs d’entrée pour calculer l’enrichissement (entrée %) avec la formule suivante. Valeurs det usage C obtenues des IgG contrôle pour déterminer la concentration de fond.
    entrée % = 100-2^(norme − intrants normalisés. ChIP)
    Norm. entrée = Ct (entrée) − journal2(facteur de dilution)
    Norm. Puce = Ct (ChIP) − journal2(facteur de dilution)
    NOTE : norm. = normalisée

8. l’analyse des échantillons d’éclats par séquençage

  1. Transférer les échantillons de puce (échantillon d’ADN d’entrée et immunoprécipitée) à une installation de séquençage.
  2. D’établir un usage de bibliothèque au préalable une préparation de la bibliothèque appropriée nécessaire (voir la Table des matières) et convertir 2 ng de l’entrée de l’ADN et tout de l’ADN d’immunoprécipitée dans les bibliothèques indexées pour la prochaine génération multiplex séquençage sur le indique la plate-forme (voir la Table des matières).
  3. Étape critique : En suivant les instructions du kit, ligaturer adaptateurs de séquençage (avec une concentration de travail de 15 µM) pour mettre fin à des fragments d’ADN réparés et dA à queue. Pour les adaptateurs de séquençage et PCR amorces utilisent oligos approprié (voir la Table des matières). Pour cette quantité d’entrées ADN, utilisez 6 à 9 cycles PCR pour enrichir les fragments d’ADN adaptateur ligaturé.
    Remarque : Normalement, il n’est pas nécessaire d’effectuer une sélection de la taille de l’ADN de l’adaptateur ligaturé. Il est préférable d’utiliser cycles PCR aussi peu que possible, depuis le résultat de cycles de nombreux PCR amplification en PCR double et délivre un GC.
  4. Pour une vérification finale de bibliothèque, prendre 0,5 µL de la réaction totale pour l’analyse de visualiser la distribution de la taille sur un dispositif approprié (voir la Table des matières). Pour la quantification, utiliser un colorant visualisation en combinaison avec un fluorospectromètre ou d’autres méthodes (voir la Table des matières).
  5. Étant donné que H3K79me2 semble être une modification des histones, qui est largement répartie entre grandes régions génomiques, séquencer l’échantillons appariés-fin d’une longueur de lecture de 50 bp et d’une profondeur de séquençage de 75 Mio lectures.
  6. Analyser les données de ChIP-seq avec le Galaxy/Uni Fribourg serveur (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Effectuer le contrôle de la qualité avec ChIPseq obtenu avec FastQC et, le cas échéant, leur carte directement avec Bowtie2 version 2.2.035 avec ou sans coupe. En tant qu’assemblage de génome de référence utiliser mm9 ou le plus récent mm10 version ; et comme annotation référence Ensembl FTP relâcher 79.
  8. Facultatif : Remove lire doublons à l’aide de MarkDuplicates Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) avant d’appeler pic.
  9. Appelez les pics avec MACS2 version 2.1.036 à l’aide de l’option « large » pour H3K79me2.
  10. Pour obtenir un ratio de2 log entre la puce et d’échantillonnage en entrée, le journal2 du nombre de lectures des lectures ratio des deux échantillons utilisez BamCoverage et BamCompare.
  11. Pour tous les autre ChIP-seq spécifique analyse approfondie, appliquer deepTools2 version 2.3.5 ou 2.4.137, c'est-à-dire pour générer des fichiers de piste de couverture (bamCoverage pour la puce, bamCompare pour la comparaison de la puce à l’entrée), pour estimer la puce performances utilisez plotFingerprint et pour générer un aperçu général computeMatrix, plotHeatmap. Sélectionnez des K-moyennes de cluster pendant le processus de computeMatrix pour regrouper les régions génomiques selon la distribution de H3K79me2.
  12. Utilisation des données de ChIP-seq publiées comme H3K79me2 de E14.5 DT déposés à NCBI aux fins du procès (numéro d’Accession : SRP057733).

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Résultats

Régime général d’isolement progénitrices neurales, culture, méthodes d’analyse H3K79me2 puce et puce : La figure 1 montre un diagramme pour effectuer H3K79me2 puce de cellules progénitrices corticales à différents moments au cours du développement du cerveau embryonnaire ou de cellules souches de neurones granulaires cérébelleux en étapes postnatals. Dans un premier temps, le cerveau doit être isolé et le télencéphale (entre E11.5 et E14.5) o...

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Discussion

Il y a deux façons principales pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine pour détecter l’occupation génomique des modifications d’histone, facteurs de transcription, lecteurs de code histone, écrivains ou gommes à effacer. On est la méthode native de la puce à l’aide de nucléase digérée, chromatine native pour l’immunoprécipitation, et l’autre est la méthode présentée à l’aide de la chromatine PFA-fixes et cisaillée, dans lequel les nucléosomes et autres protéines ADN-attaché covalente à l’ADN

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes

Remerciements

Nous remercions Henriette Bertemes pour aider à l’établissement du protocole de culture CGN au sein du laboratoire. Ce livre de la méthode était soutenu par l’épigénétique financés par le DFG CRC992 médicale en finançant à la télévision. Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’équipe de galaxie de Freiburg : Pavankumar Videm, Björn Grüning et Prof. Rolf Backofen, bioinformatique, Université de Freiburg, en Allemagne, financé par Collaborative Research Centre 992 médical épigénétique (subvention DFG SFB/992/1 2012) et ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF subvention 031 A538A RBC (de. NBI)).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-GAPDHAbcam ab8245Category : Antibody
Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category : Antibody
Abbreviation/Commentaire : Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Catégorie :Anticorps
Abbreviation/Commentaire : Anticorps ChIP
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Catégorie :Anticorps
Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Catégorie : Anticorps
Abbreviation/Commentaire : ChIP Ctrl Anticorps
Anti-tubuline alphaAbcamab108629Catégorie : Anticorps
Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:3000
Apo-Transferrine (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour le supplément CCM
B27 (50x)Life Technologies17504044Category : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : Pour CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Pour l’analyse de la chromatine cisaillée
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Ultrasoniseur
Acide borique pH 8.4Sigma AldrichB6768Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour la culture CPC
CFX Connect RT Système de détectionBio-Rad1855201Category : ChIP Analysis
Abbreviation/Commentaire : Système de détection pour qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Catégorie : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : Pour CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Perles magnétiques, pour ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Catégorie : Inhibition de DOT1L
Abréviation/Commentaire : Pour l’inhibition de DOT1L en culture cellulaire
Acide éthylènediamine tétraacétiqueSERVA39760.01Catégorie : ChIP
Abbreviation/Commentaire : EDTA
Sérum de veau fœtal 10 % (v/v)Gibco10082147Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CPC et
CGM GlucoseSigma-AldrichG5767Category : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CGNP
Glutathion (1,25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour CCM
GlycineCarl Roth3187Catégorie : ChIP
Abbréviation/Commentaire : Pour la fixation cellulaire
GoTaq mastermixPromegaA6002Category : ChIP Analysis
Abbreviation/Commentaire : DNA polymerase master mix pour qPCR
Hank' s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category : Cell culture
Abbreviation/Commentaire : HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category : Cell culture
Abbreviation/Commentaire : Pour CCM
LamininSigma-AldrichL2020Catégorie : Culture cellulaire
Abréviation/Commentaire : Pour la culture CPC
Chlorure de lithiumSigma-AldrichL4408Catégorie : ChIP
Abbréviation/Commentaire : LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Catégorie : ChIP
Abréviation/Commentaire : Fluorospectromètre pour quantification de l’ADN
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit pour IlluminaNEBE7645SCategory : ChIP Analysis
Abbreviation/Commentaire : Kit pour la préparation de la bibliothèque
NEBNext Multiplex Oligos pour IlluminaNEBE7335Category : ChIP Analysis
Abbreviation/Commentaire : Oligos pour la préparation de la bibliothèque
Neurobasal mediumGibco21103049Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Catégorie : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Pour tampon ChIP
ParaformaldéhydeCarl Roth335Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : PFA, pour la fixation cellulaire
Pénicilline-Streptomycine-Neomycine 1 % (v/v)Life Technologies15640055Category : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : PSN, pour CCM et CGM
Phosphate salin tamponnéLife Technologies 10010023Category : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : PBS, pour l’isolation CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category : ChIP Analysis
Abbreviation/Commentaire : Visualisation du colorant pour la quantification de l’ADN
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CGNP
Bromhydrate de poly-L-ornithineSigma AldrichP3655Catégorie : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour la culture CPC
Chlorure de potassiumThermo FisherAM9640GCatégorie : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : KCl, pour CGM
Inhibiteur de protéaseRoche4693159001Catégorie : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Pour ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Catégorie : ChIP
Abbreviation/Commentaire : For ChIP
Qiagen Qiagen MinEluteQiagen28004Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Kit pour la purification de l’ADN
RNAseSigma-AldrichR6513Catégorie : ChIP
Abréviation/Commentaire : Pour ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Catégorie : Inhibition de DOT1L
Abbréviation/Commentaire : Pour l’inhibition de DOT1L en culture cellulaire
Bicarbonate de sodiumCarl Roth8551.1Catégorie : ChIP
Abréviation/Commentaire : pour tampon d’élution
Chlorure de sodiumCarl Roth9265Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : NaCl, pour tampon ChIP
Désoxycholate de sodiumSigma-Aldrich30970Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : For ChIP
Sodium dodécylsulfateCarl Roth183Catégorie : ChIP
Abbreviation/Commentaire : SDS, pour ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category : Culture cellulaire
Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement CGNP
Superoxyde dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Catégorie : Culture cellulaire
Abréviation/Commentaire : Pour CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Catégorie : ChIP
Abréviation/Commentaire : TRIS, pour tampon ChIP
Triton X-100Carl RothX100Category : ChIP
Abbreviation/Commentaire : Pour le tampon ChIP
Trypsin-EDTA 0,05 % (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory : Culture cellulaire
Abbreviation/Commentaire : Pour l’isolement CPC
Tween20Carl Roth28320Catégorie : ChIP
Abbréviation/Commentaire : Pour la préparation des billes
Autres appareils de laboratoire : Chambre de comptage Neubauer, Incubateur, Rotateur, Agitateur, Set de disection, Bain-marie
CCM : Milieu
CGM : Milieu
du cellulaire cortical de culture cellulaire CGNP

Références

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