Un pH de Novel In Vitro Live-imagerie phagocytose médiée par dosage de l’Astrocyte utilisant Synaptosomes indicateur conjugué

Résumé

Ce protocole présente un test in vitro d’imagerie live phagocytose pour mesurer la capacité phagocytaire des astrocytes. La microglie et les astrocytes purifiée de rat sont utilisées avec synaptosomes conjugué indicateur de pH. Cette méthode peut détecter la cinétique de dégradation et d’une durée de temps réel et fournit une plate-forme de dépistage approprié pour identifier les facteurs modulant la phagocytose astrocyte.

Résumé

Les astrocytes sont le type de grandes cellules dans le cerveau et contacter directement les synapses et les vaisseaux sanguins. Bien que les cellules microgliales ont été considérés comme les principales cellules immunitaires et seulement les phagocytes dans le cerveau, les études récentes ont montré que les astrocytes participent également dans divers processus phagocytaires, telles que l’élimination de synapse développement et apurement des plaques de bêta-amyloïde dans la maladie d’Alzheimer (ma). Malgré ces résultats, l’efficacité d’une durée d’astrocyte et la dégradation de leurs cibles ne sont pas claires comparé à celui des cellules microgliales. Ce manque d’information est principalement en raison de l’absence d’un système de test dans lequel la cinétique de l’astrocyte et la microglie-médiée par phagocytose sont facilement comparables. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé à long terme d’imagerie live in vitro phagocytose des tests afin d’évaluer la capacité phagocytaire des astrocytes purifiées et la microglie. Dans ce test, détection en temps réel d’enlisement et d’avilissement est possible à l’aide de synaptosomes conjugué indicateur pH, qui émettent une fluorescence rouge vif dans les organites acides, tels que les lysosomes. Notre nouveau dosage fournit la détection simple et efficace de phagocytose par le biais d’images en direct. En outre, cet essai in vitro phagocytose avec utilisable comme une plate-forme de dépistage pour identifier les produits chimiques et des composés qui peuvent renforcer ou inhiber la capacité phagocytaire des astrocytes. Comme l’ont démontré des dysfonctionnement synaptique de l’élagage et l’accumulation de protéine pathogène provoque des troubles mentaux ou maladies neurodégénératives, produits chimiques et composés qui modulent la capacité phagocytaire des cellules gliales devraient être utiles dans le traitement de diverses troubles neurologiques.

Introduction

Les cellules gliales, qui font référence à des cellules non excitables dans le cerveau, sont le type de cellule majeur dans le système nerveux central (CNS). Auparavant, les cellules gliales étaient considérées comme des cellules de soutien simples qui principalement jouent un rôle passif dans le maintien de la survie neuronale et propriétés synaptiques basales. Cependant, des preuves nouvelles a révélé que les cellules gliales jouent un rôle plus actif dans divers aspects de la neurobiologie, comme le maintien de l’homéostasie du cerveau, médiation synapse formation^1,2,3 et ....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’utilisation (IACUC), KA2016-08 et The Korea Advanced Institute of Science et technologie institutionnelle animalier.

1. synaptosomes Purification

Remarque : Ces procédures sont adaptés d’un article précédemment publié¹⁹ avec quelques modifications pour améliorer le rendement des synaptosomes purifiées (Figure 1).

1. Préparer les milieux gradient de densité discontinu.
   1. Placer ce qui suit sur la glace : 3 %, 10 % et 23 % densité gradients solutions tampon dégradé (amener à 250 mL d....

Résultats

Dans cet essai de la phagocytose dans vitro avec imagerie vivre à long terme, nous avons utilisé des synaptosomes des homogénats de cerveau de souris adultes, qui ont été séparés dans la solution dégradée entre solution dégradé de 23 % et 10 % dégradé par ultracentrifugation ( La figure 3). Après la préparation, synaptosomes exposés PS dans leur membrane externe (Figure 4), ce qui laisse croire qu’ils ont perdu leur fonc.......

Discussion

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour une longue durée d’imagerie live in vitro phagocytose analyse en utilisant des cellules gliales purifiées et synaptosomes conjugué indicateur de pH. Nous montrons que par rapport à la microglie, astrocytes possèdent la capacité de dégradation et d’une durée différente lors de la phagocytose des synaptosomes. En outre, nos résultats suggèrent que les facteurs astrocyte-sécrétée, qui contiennent des molécules ponts comme GAS6, des protéines et MEGE8, sont essenti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Purification des synaptosomes
Percoll	GE soins de santé sciences de la vie	17-0891-01
Démarrage rapide Bradford Protein Assay Kit 2	BIO-RAD	5000202
Conjugaison de l’indicateur de pH
solution de sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	LPS
sondes Molecula	P36600
Immunopanning
10X Earle' s solution saline équilibrée (EBSS)	Sigma	E7510
Albumine sérique bovine	Bovogen	BSA025
Désoxyrébonucase 1 (DNase)	Worthington	IS002007
(DMEM)	Gibco	11960-044
(dPBS)	Welgene	LB001-02
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)	Vector	Labs L-1100
IgG+IgM(H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-005-044
IgM anti-souris de chèvre (&mu ;-chain)	Jackson ImmunoResearch	115-005-020
Facteur de croissance épidermique se liant à l’héparine	Sigma	E4643
Anticorps HepaCAM humain	R& D systems	MAB4108
Integrine bêta 5 anticorps monoclonal (KN52)	eBioscience	14-0497-82
L-cystéine	Sigma	C7880
L-glutamate	Gibco	25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC)	Sigma	A8199
Milieu neurobasal	Gibco	21103-049
O4 hybridoma supernatant(IgM de souris)	Bansal et al.23
Papain	Worthington	Is003126
Pénicilline/streptomycine	Gibco	15140-122
Pluristrainer 20 &mu ; m	PluriSelect	43-50020-03
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Progestérone	Sigma	P8783
Dichlorhydrate de putrescine	Sigma	P5780
Anti-souris purifié CD45	BD Pharmingen	550539
Souris purifiée anti-rat CD45	BD Pharmingen	554875
Pyruvate de sodium	Gibco	11360-070
Sélénite de sodium	Sigma	S5261
Transferrine	Sigma	T1147
Trypsine	Sigma	T9935
Inhibiteur de trypsine	Worthington	LS003086
Tube ultra-transparent (Tube, Thinwall, Ultra-Clear)	Beckman Coulter	344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance avec membrane Omega (10k)	PALL	MAP010C37
Macrosep Advance avec membrane Omega (30k)
Phagocytosis
Juli stage	NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DMSO100 Appareils centrifuges Appareils centrifuges Essai d’imagerie en direct PALL MAP030C37