Une Identification sur le réseau neuronale d’ovocytes adulte souris développemental compétent ou incompétent

Summary

Nous présentons ici un protocole pour une évaluation non invasive de la compétence du développement ovocytes effectué au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinative au stade métaphase II. Cette méthode combine l’imagerie Time-lapse avec vélocimétrie par image de particules (PIV) et les analyses de réseau neuronal.

Abstract

Cliniques d’infertilité bénéficierait de la possibilité de sélectionner développemental compétente vs les ovocytes incompétent à l’aide de méthodes non effractives, afin d’améliorer le résultat global de la grossesse. Nous avons récemment mis au point une méthode de classification basée sur des observations microscopiques vivantes des ovocytes de souris au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinale (GV) au stade métaphase II, suivie de l’analyse des mouvements cytoplasmiques survenant au cours de cette période Time-lapse. Nous présentons ici des protocoles détaillés de cette procédure. Les ovocytes sont isolés des follicules antraux entièrement cultivés et cultivés pendant 15 h à l’intérieur d’un microscope équipé pour l’analyse de Time-lapse à 37 ° C et 5 % de CO₂. Les photos sont prises à intervalles de 8 min. Les images sont analysées à l’aide de la méthode Particle Image Velocimetry (PIV) qui calcule, pour chaque ovocyte, le profil des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) qui se produisent tout au long de la période de culture. Enfin, la CMV de chaque ovocyte unique est alimentés par un outil de classification mathématique (réseaux de neurones artificiels Feed-forward, FANN), qui prédit la probabilité d’un gamète développemental compétent ou incompétent avec une précision de 91.03 %. Ce protocole, mis en place pour la souris, pourrait maintenant être testé sur d’autres espèces, y compris les humains, les ovocytes.

Introduction

Infertilité féminine est une pathologie qui affecte un nombre croissant de femmes. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 20 % des couples sont infertiles, avec 40 % à cause de l’infertilité féminine. En outre, un tiers des femmes subissant des traitements contre le cancer (300 000/an et 30 000/an dans les USA ou l’Italie, respectivement) développent une insuffisance ovarienne prématurée.

Une stratégie visant à prévenir l’infertilité chez les patients atteints de cancer est l’isolement et la cryoconservation des follicules ovariens avant le traitement oncologique, suivie de la maturation in vitro (MIV) d’ovocytes GV à l’étape MII (transition GV-à-MII). La disponibilité de marqueurs non-invasifs de compétence développementale d’ovocytes améliorerait la fécondation et processus de développement et le succès de grossesse globale^1,2.

Selon leur configuration de chromatine observée après coloration au supravitale fluorochrome Hoechst 33342, mammifères adulte ovocytes sont classés soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole pas entouré (RSN)³. En plus de leur organisation de la chromatine différents, ces deux types d’ovocytes affichent plusieurs différences morphologiques et fonctionnelles^{3,4,5,6,7,8 ,9}, y compris leur compétence méiotique et du développement. Lorsque isolée de l’ovaire et portées à maturation in vitro, les deux type d’ovocytes portée la scène MII et après insémination de sperme, se développent à l’étape 2-cell, mais seulement ceux avec une organisation de la chromatine SN peuvent se développer à terme⁹. Mais bon comme une méthode de classification pour sélectionner compétente vs incompétent ovocytes, le principal inconvénient est l’effet mutagène qui le fluorochrome lui-même et, surtout, la lumière UV utilisé pour sa détection pourraient avoir sur les cellules.

Pour toutes ces raisons, nous avons cherché des autres marqueurs non-invasifs associées à la conformation de la chromatine SN ou DSN qui pourrait remplacer l’utilisation de Hoechst, tout en conservant la même précision de classement élevé. La Time-lapse observation des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) s’impose comme une caractéristique distinctive de l’état de la cellule. Par exemple, des études récentes ont démontré que l’association entre le CMV enregistré au moment de la fécondation et la capacité des souris et des zygotes humains complet préimplantatoire et nés à terme développement^10,11.

Se fondant sur ces études antérieures, nous décrivons ici une plateforme pour la reconnaissance des souris développemental compétent ou incompétent ovocytes adulte^5,6,7,8. La plate-forme est basée sur trois étapes principales : 1) ovocytes isolés des follicules antraux sont classés d’abord selon leur configuration de chromatine soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole n’est pas entouré (NSN) ; 2) images Time-lapse de CMV survenant lors du passage de GV-à-MII de chaque ovocyte unique sont prélevés et analysés par vélocimétrie par image de particules (PIV) ; et 3) les données obtenues avec PIV sont analysées avec un réseau neuronal artificiel de Feed-forward (FANN) pour aveugles classification^12,13. Nous donnons les détails des étapes plus critiques de la procédure destinée à la souris pour le rendre prêt à être testé et utilisé pour les autres espèces de mammifères (p. ex., les bovins, singe et l’homme).

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les institutionnels et utilisation et animalier des comités d’éthique à l’Université de Pavie. Animaux était maintenus dans des conditions de 22 ° C, humidité de l’air de 60 % et un cycle lumière/obscurité de 12:12 h.

1. isolement de l’ovaire

1. Injecter par voie intrapéritonéale 2 quatre-à-onze semaines femelles souris CD1 avec 10 U d’hormone folliculo-stimulante avec une seringue à insuline stériles 1 mL.
2. Attendre 46-48 h.
3. Peser la souris et anesthésier avec une injection intramusculaire de 50 mg/kg de Zoletil (cloridrate Tiletamina et Zolazepan). Euthanasier par dislocation cervicale.
4. Saisir la peau recouvrant la paroi abdominale à l’aide d’une paire de pinces de dissection. Couper la peau et la paroi du corps avec une paire de ciseaux et ouvrir l’incision avec une pince.
5. À l’aide d’une paire de pincettes, déplacer le cran côté, repérer les cornes utérines et localiser les ovaires à leur extrémité.
6. Doucement, maintenez l’ovaire à l’aide de pinces d’horloger et utiliser des ciseaux pour couper le ligament de l’utérus. Répéter l’opération avec l’autre ovaire.
7. Transférer les ovaires prélevés dans un plat de Pétri de culture 35 mm cellule contenant 1 mL de milieu d’isolement M2 préchauffée à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans l’air.
8. Retirez la graisse et l’oviducte à l’aide des ciseaux sous un stéréomicroscope.

2. isolement des Complexes ovocytes Cumulus

1. Percer la surface ovarienne à l’aide de pinces stériles et une aiguille stérile de l’insuline de 1G jusqu'à ce que les complexes d’ovocyte antrale cumulus (COC) sont libérées passivement.
2. Recueillir des COC avec plus de trois couches de cellules de cumulus à l’aide d’une bouche-contrôlés main tiré Pasteur micropipette (200 µm de diamètre) et de les transférer dans une chute de 300 µL de milieu M2 frais.
3. Supprimer les cellules du cumulus qui entourent les ovocytes à l’aide d’une micropipette main tiré de Pasteur (80 µm de diamètre) en pipettant également doucement dedans et dehors pendant quelques secondes,
4. Transfert à plusieurs reprises ovocytes d’une goutte de 20 µL de milieu M2 à une autre, jusqu'à ce que les cellules du cumulus sont complètement éliminés.

3. Classification ovocyte axée sur l’organisation de la chromatine

1. Préparer la solution colorante Hoechst 33342 à une concentration finale de 0,05 µg/mL en M2 moyen à partir d’une solution mère de 5 mg/mL dilué dans du PBS 1 x.
2. 3.5 place µL micro gouttelettes de Hoechst coloration solution au fond d’un couvercle de boîte de Pétri de 35 mm.
3. Transférer chaque ovocyte unique dans un Hoechst coloration goutte, posez le plat sur une plaque de chauffage préchauffé (37 ° C) et couvrir avec un couvercle noir pour éviter l’exposition lumineuse.
4. Après 10 min d’incubation à température ambiante, observer les ovocytes avec un microscope à fluorescence à un grossissement de X 10 sous lumière UV (330-385 nm), pour pas plus de 1-2 s.
5. Classer des ovocytes comme un nucléole entouré (SN) (Figure 1 a), si elles présentent un anneau de chromatine Hoechst positifs entourant le nucléole.
6. Classer des ovocytes comme un nucléole pas entouré (RSN), si leur nucléole n’est pas entouré de chromatine Hoechst séropositifs et spectacles dispersent hétérochromatiques taches dans le noyau (Figure 1 b).

4. neural Network-Based ovocyte Classification

1. Préparer quatre 2 gouttes µL de milieu de α-MEM additionné de 5 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, taurine de 5 mM, 100 U/mL la pénicilline, 75 µg/mL de streptomycine et pyruvate 23,5 µg/µL sodium dans un verre de 35 mm le fond de boîte de Pétri et recouvrez-les avec préchauffé (37 ° C) et l’huile minérale préalablement équilibré pour éviter l’évaporation moyenne.
   Remarque : Si vous utilisez un système de dépistage cell live, maintenez les gouttes à une distance spécifique en utilisant une grille dessinée de 7 x 7 mm comme ligne directrice.
2. Transfert de 3 - 4 ovocytes à chaque goutte.
3. Placez le fond de verre plat de Pétri dans un système de dépistage cell live, équipé d’un logiciel d’enregistrement Time-lapse (voir Table des matières), qui permet l’observation de la maturation des ovocytes dans un environnement à température stable (37 ° C) et CO₂ concentration (5 %).
4. Ouvrez le logiciel d’enregistrement Time-lapse. Sur l’écran, une fenêtre apparaît avec un tir direct de l’ovocyte sur le côté gauche et tous les boutons de réglage sur le côté droit.
5. Sélectionnez le centre de l’ovocyte à positionner au centre de l’écran. Ajuster la mise au point si nécessaire.
6. Cliquez sur le bouton de Ph , puis affectez-lui la Lampe DIA 192 ; le temps d’exposition de 1/125 s; le Gain à 1.99; et la résolution de 1600 x 1200.
7. Sélectionnez FL2 , puis affectez-lui la Lampe DIA 5; le temps d’exposition de 3 s; le Gain à 2,37; et la résolution de 1600 x 1200.
8. Cliquez sur le bouton New point afin d’enregistrer la position de l’ovocyte dans la baisse de la culture. Répéter la même routine pour chaque ovocyte dans la baisse de la culture.
9. Sélectionnez heure , puis affectez-lui le cycle d’Acquisition 8 min et le temps Total de 15 h.
10. Sélectionnez Start time-lapse pour démarrer le cycle d’enregistrement.
11. Ouvrez le logiciel MATLAB et écrire >>cell_piv; puis sélectionnez l' Outil PIV.
12. Choisissez le dossier contenant le film enregistré, puis sélectionnez tous les fichiers .jpeg pour charger la séquence de l’ensemble de l’image. Pour chaque ovocyte, sélectionnez la région d’intérêt (ROI) en cliquant sur le Sélectionnez zone outil.
13. Dans le menu fichier, sélectionnez Processus PIV . Cliquez sur le bouton de l’Outil de visualisation .
    NOTE : Le programme calcule les vecteurs de vitesse dans le retour sur investissement et produit automatiquement un fichier de données, enregistré dans un fichier .mat.
14. Sélectionnez le fichier .mat à ouvrir. Cliquez sur le bouton outil ROI sélectionner et dessiner un cercle autour du contour de l’ovocyte. Cliquez sur Enregistrer sous du menu fichier.
    Remarque : Les vecteurs de cette région sont maintenant affichés et les données de magnitude moyenne dans la fenêtre graphique mis à jour pour ce nouveau ROI.
15. Ouvert les données recueillies de magnitude moyenne des trames entières Time-lapse enregistrement dans un tableur, avec, sur les lignes, la séquence d’image et, sur les colonnes, chaque ovocyte unique analysé.
16. Organiser les données d’ovocytes fois NNO et SN en 10 sous-groupes.
17. 9 sous-groupes permet de former le réseau de neurones artificiels feed-forward par itération (FANN) et 1 sous-groupe pour le blind test.
    1. Répéter un autre 9 fois, changeant l’échantillon test aveugle (10 fois la validation croisée).
18. Ouvrir MATLAB, exécutez le script sur mesure principale et, sur demande, insérez le nom du fichier avec les données d’apprentissage (train.txt), le nombre d’ovocytes NNO et SN, utilisé pour la formation et l’intervalle de temps-faute pour être analysé (en général, de image # 1-2 pour encadrer # 112-113).
19. Appuyez sur entrer pour effectuer la formation.
20. Inscrire le nom du fichier avec les données de tests (test.txt).
21. Ouvrez le vecteur test_outputs_cyt dans l’espace de travail MATLAB.
    NOTE : Une fenêtre s’affiche sur l’écran indiquant, dans la première rangée, la probabilité d’obtenir de vrais positifs (TP ou vrai RSN) et des faux positifs (FP ou faux NSN) pour les ovocytes NNO et SN, respectivement ; au lieu de cela, dans la deuxième rangée, la probabilité d’obtenir de faux négatifs (FN ou faux SN) et effectivement négatifs (TN ou SN vrai) pour les ovocytes NNO et SN, respectivement.
22. Utiliser la formule suivante : (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), pour le calcul de l’exactitude FANN, exprimée en pourcentage.

Results

La figure 2 illustre un ovocyte représentatif de développemental compétent et incompétent, respectivement au début (GV) et à la fin (MII), de la procédure de l’IVM. IVM d’ovocytes de souris adulte se produit au cours de la culture de 15 h. L’observation de Time-lapse enregistre la progression de la méiose et détecte les événements méiotiques majeurs, y compris la GVBD et l’extrusion du premier corps polaire.

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques, on s’occupe de tout en effectuant ce protocole avec les ovocytes de souris ainsi qu’avec celles d’autres espèces. Une fois isolés de leurs follicules, ovocytes doivent être immédiatement transférés dans les gouttes de l’enregistrement, comme la séparation d'avec le cumulus compagnon cellules déclenche le début de la transition de GV-à-MII. Une modification éventuelle du présent protocole pourrait être l’ajout de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) au milieu de M2 utilisé pour isoler l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Traitement hormonal
Hoechst 33342  ;	Sigma-Aldrich	B2261	Pour la coloration de l’hétérochromatine des ovocytes
Culture cellulaire Boîte de Petri 35 mm x 10 mm  ;	Corning  ;	430165	Pour l’isolement des COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquide, avec rouge phénol	Merck-Millipore	MR-015-D	Pour l’isolement des COC
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax  ;	Sigma-Aldrich	M4526	Pour la maturation in vitro des ovocytes
Culture cellulaire Boîte de Pétri 35 mm à fond de verre  ;	WillCo  ;	GWSt-3522	Pour les expériences d’imagerie
BioStation IM-LM  ;	Système	criblage à cellules vivantes	Nikon MFA91001
Pipette Pasteur	Delchimica Scientific Verrerie	6709230	Pour la manipulation des follicules
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410	Pour prévenir la contamination et l’évaporation du milieu
Pénicilline / Streptomycine	Life Technologies	15070063	Pour prévenir la contamination du milieu
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Pour le maquillage &alpha ; MEM medium  ;
L-Glutamine  ;	Life Technologies	25030	Pour le maquillage & alpha ; MEM medium  ;
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Pour le maquillage &alpha ; MEM medium  ;
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Pour le maquillage &alpha ; Média MEM
Pyruvate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	; P4562	Pour le maquillage &alpha ; MEM media
Zoletil (Tiletamina et Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	Pour souris anesthésie
Cell_PIV sofware  ;	Aimablement fourni par Dr. Shane Windsor, Université de Bristol, Royaume-Uni	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;-	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA  ;	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Pour l’informatique	numérique multiparadigme