Une Identification sur le réseau neuronale d’ovocytes adulte souris développemental compétent ou incompétent

Summary

Nous présentons ici un protocole pour une évaluation non invasive de la compétence du développement ovocytes effectué au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinative au stade métaphase II. Cette méthode combine l’imagerie Time-lapse avec vélocimétrie par image de particules (PIV) et les analyses de réseau neuronal.

Abstract

Cliniques d’infertilité bénéficierait de la possibilité de sélectionner développemental compétente vs les ovocytes incompétent à l’aide de méthodes non effractives, afin d’améliorer le résultat global de la grossesse. Nous avons récemment mis au point une méthode de classification basée sur des observations microscopiques vivantes des ovocytes de souris au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinale (GV) au stade métaphase II, suivie de l’analyse des mouvements cytoplasmiques survenant au cours de cette période Time-lapse. Nous présentons ici des protocoles détaillés de cette procédure. Les ovocytes sont isolés des follicules antraux entièrement cultivés et cultivés pendant 15 h à l’intérieur d’un microscope équipé pour l’analyse de Time-lapse à 37 ° C et 5 % de CO₂. Les photos sont prises à intervalles de 8 min. Les images sont analysées à l’aide de la méthode Particle Image Velocimetry (PIV) qui calcule, pour chaque ovocyte, le profil des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) qui se produisent tout au long de la période de culture. Enfin, la CMV de chaque ovocyte unique est alimentés par un outil de classification mathématique (réseaux de neurones artificiels Feed-forward, FANN), qui prédit la probabilité d’un gamète développemental compétent ou incompétent avec une précision de 91.03 %. Ce protocole, mis en place pour la souris, pourrait maintenant être testé sur d’autres espèces, y compris les humains, les ovocytes.

Introduction

Infertilité féminine est une pathologie qui affecte un nombre croissant de femmes. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 20 % des couples sont infertiles, avec 40 % à cause de l’infertilité féminine. En outre, un tiers des femmes subissant des traitements contre le cancer (300 000/an et 30 000/an dans les USA ou l’Italie, respectivement) développent une insuffisance ovarienne prématurée.

Une stratégie visant à prévenir l’infertilité chez les patients atteints de cancer est l’isolement et la cryoconservation des follicules ovariens avant le traitement oncologique, suivie de la maturation in vitro (MIV) d’ovocytes GV à l....

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les institutionnels et utilisation et animalier des comités d’éthique à l’Université de Pavie. Animaux était maintenus dans des conditions de 22 ° C, humidité de l’air de 60 % et un cycle lumière/obscurité de 12:12 h.

1. isolement de l’ovaire

1. Injecter par voie intrapéritonéale 2 quatre-à-onze semaines femelles souris CD1 avec 10 U d’hormone folliculo-stimulante avec une seringue à insuline stériles 1 mL.
2. Attendre 46-48 h.
3. Peser la souris et anesthésier avec une injection intramusculaire de 50 mg/kg de Zoletil (cloridrate Tiletamina et Zolazepan....

Results

La figure 2 illustre un ovocyte représentatif de développemental compétent et incompétent, respectivement au début (GV) et à la fin (MII), de la procédure de l’IVM. IVM d’ovocytes de souris adulte se produit au cours de la culture de 15 h. L’observation de Time-lapse enregistre la progression de la méiose et détecte les événements méiotiques majeurs, y compris la GVBD et l’extrusion du premier corps polaire.

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques, on s’occupe de tout en effectuant ce protocole avec les ovocytes de souris ainsi qu’avec celles d’autres espèces. Une fois isolés de leurs follicules, ovocytes doivent être immédiatement transférés dans les gouttes de l’enregistrement, comme la séparation d'avec le cumulus compagnon cellules déclenche le début de la transition de GV-à-MII. Une modification éventuelle du présent protocole pourrait être l’ajout de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) au milieu de M2 utilisé pour isoler l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Traitement hormonal
Hoechst 33342  ;	Sigma-Aldrich	B2261	Pour la coloration de l’hétérochromatine des ovocytes
Culture cellulaire Boîte de Petri 35 mm x 10 mm  ;	Corning  ;	430165	Pour l’isolement des COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquide, avec rouge phénol	Merck-Millipore	MR-015-D	Pour l’isolement des COC
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax  ;	Sigma-Aldrich	M4526	Pour la maturation in vitro des ovocytes
Culture cellulaire Boîte de Pétri 35 mm à fond de verre  ;	WillCo  ;	GWSt-3522	Pour les expériences d’imagerie
BioStation IM-LM  ;	Système	criblage à cellules vivantes	Nikon MFA91001
Pipette Pasteur	Delchimica Scientific Verrerie	6709230	Pour la manipulation des follicules
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410	Pour prévenir la contamination et l’évaporation du milieu
Pénicilline / Streptomycine	Life Technologies	15070063	Pour prévenir la contamination du milieu
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Pour le maquillage &alpha ; MEM medium  ;
L-Glutamine  ;	Life Technologies	25030	Pour le maquillage & alpha ; MEM medium  ;
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Pour le maquillage &alpha ; MEM medium  ;
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Pour le maquillage &alpha ; Média MEM
Pyruvate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	; P4562	Pour le maquillage &alpha ; MEM media
Zoletil (Tiletamina et Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	Pour souris anesthésie
Cell_PIV sofware  ;	Aimablement fourni par Dr. Shane Windsor, Université de Bristol, Royaume-Uni	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;-	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA  ;	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Pour l’informatique	numérique multiparadigme