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Article de méthode

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

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DOI :

10.3791/56675

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17 novembre 2017

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1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cellule autonome fonction des gènes dans le cerveau peut être étudiées en induisant la perte ou gain de fonction dans des populations clairsemées de cellules. Nous décrivons ici dans l’utérus l’électroporation pour livrer une recombinase Cre en populations clairsemées de mettre au point des neurones corticaux avec floxed gènes à provoquer une perte de fonction in vivo.

Résumé

Les fonctions neuronales cellule autonome de gènes peuvent être révélées par une perte ou gain de fonction d’un gène dans une petite population clairsemée des neurones. Pour ce faire nécessite générant une mosaïque dans laquelle des neurones avec perte ou gain de fonction d’un gène sont entourés de tissu génétiquement non perturbé. Ici, nous combinons le système de recombinaison Cre-lox avec in utero électroporation afin de générer des tissus cérébraux de mosaïque qui peuvent être utilisé pour étudier la fonction cellule autonome de gènes dans les neurones. Constructions d’ADN (disponible par le biais de dépôts), codant pour une étiquette fluorescent et la recombinase Cre, sont introduits dans le développement des neurones corticaux contenant des gènes flanqués de sites loxP dans le cerveau d’embryons de souris à l’aide de in utero électroporation. En outre, les auteurs décrivent les diverses adaptations de la méthode d’électroporation in utero qui augmentent les chances de survie et de la reproductibilité. Cette méthode consiste aussi à établir un titre pour la recombinaison Cre-mediated dans une population clairsemée ou dense des neurones. Préparations histologiques du tissu cérébral marqués n’ont pas besoin (mais peut être adaptées à) l’immunohistochimie. Les constructions utilisées garantissent que fluorescent étiqueté neurones portent le gène de la recombinase Cre. Préparations histologiques permettent une analyse morphologique des neurones par le biais de l’imagerie confocale des arbres dendritiques et axonales et des épines dendritiques. Parce que perte ou gain de fonction est fournie dans les tissus de mosaïque éparse, cette méthode permet l’étude des cellules autonomes nécessité et la suffisance des produits de gène in vivo.

Introduction

Générant une mosaïque génétique est un paradigme expérimental classique pour comprendre la fonction d’un gène d’intérêt. Pour déterminer si un gène est nécessaire pour un phénotype cellulaire, l’approche la plus simple est à l’origine une perte de fonction du gène dans l’ensemble de l’organisme (p. ex. knockout). Toutefois, pour déterminer si un gène est nécessaire précisément dans un certain type de cellule, Knock-out du gène dans l’ensemble de l’organisme n’est pas une approche valable. Au lieu de cela, il faut une méthode qui causera la perte de fonction d’un gène dans une cellule donnée alors qu’il est entouré par le tissu de type sauvage (c'est-à-dire génétiquement non perturbé) — en d’autres termes, création de tissus de mosaïque. Si la cellule mutante montre un phénotype mutant, mais les cellules environnantes de type sauvage n’est pas la fonction des gènes de manière autonome-cellule. Analyse du tissu de mosaïque, dans lequel les cellules mutantes sont entourés de tissu de type sauvage, est idéal pour comprendre les fonctions cellulaires-autonome des gènes, en particulier dans le cerveau où les neurones et cellules gliales forment un vaste réseau interconnecté de tissu.

Plusieurs formes de tissus cérébraux de mosaïque ont fourni des modèles puissants pour étudier les fonctions cellulaires-autonome des gènes. Études axées sur la transplantation de neurones1, femelle mosaïcisme liée à le X2,3,4, et le mosaïsme somatique endogène5,6 ont tiré leurs conclusions fondées sur la mosaïque tissu cérébral. Suppression conditionnelle d’un gène par le système de recombinaison Cre-lox est une méthode qui tire pleinement parti de la grande disponibilité des lignées de souris transgéniques. Dans cette méthode, deux sites loxP sont mis en ligne sur chaque côté d’une séquence requise d’un gène (par exemple un exon), laissant flanqué de sites loxP que tous deux faire face dans la même direction (« floxed »). Recombinase cre accises la séquence entre les sites de loxP7. Recombinaison CRE-négociée est possible en traversant floxed souris à une autre lignée de souris exprimant la recombinase Cre avec un marqueur fluorescent dans un sous-ensemble de cellules (« ligne de journaliste Cre »). Cela a été démontré dans une variété de façons de découvrir les fonctions d’un gène dans des sous-ensembles de cellules, telles que des neurones excitateurs ou astrocytes8. Lignes de journaliste cre peuvent exprimer CreERT2 pour permettre la recombinaison Cre-mediated être induit par drogue (single-neurone marquage avec masquage de Cre-mediated inductible ou SLICK)9. Dans une autre stratégie appelée analyse de mosaïque avec double marqueurs (MADM)10,11, induite par le Cre interchromosomique recombinaison permet un homozygote mutant à créer aux côtés de tissu hétérozygote. Dans ces approches, une nouvelle gamme de souris doit être produite chaque fois pour chaque gène candidat ou sous-type cellulaire qui est testé. Alternativement, une recombinase Cre peut être introduite après la naissance par iontophorèse12 ou par l’intermédiaire de vecteurs viraux (p. ex. virus adéno-associés13 ou lentivirus14 transportant sous-type cellulaire spécifique promoteurs). Cette stratégie crée fort et postnatale d’étiquetage. Pour cibler le développement des neurones du cortex cérébral faiblement et avant la naissance, une stratégie idéale est dans l’utérus l’électroporation de recombinase Cre avec un marqueur fluorescent.

En plus de combiner la recombinaison Cre-lox à travers dans l’utérus l’électroporation pour produire mosaïque tissu in vivo, nous introduisons plusieurs adaptations aux procédures des autres protocoles publiés15,16, 17,18,19,20,21. Nous fournir des informations pour améliorer la réussite dans les enceintes chronométré femelles reproductrices. Nous exposons également nos deux stratégies pour introduire clairsemée et lumineux, marquage des neurones dans les tissus corticaux : une stratégie consiste à titrer les niveaux d’une construction unique codant pour la recombinase Cre et un marqueur fluorescent22. Une autre stratégie consiste à utiliser le système de « Supernova », conçu spécifiquement pour ces paramètres en compte23,24. En outre, nous offrons des améliorations sur la production de pipettes de micro-injection cohérente et des simplifications à la chirurgie d’électroporation in utero . Enfin, nous décrivons les étapes critiques dans une préparation histologique simplifiée qui permet l’analyse des épines dendritiques et arbres dendritiques et axonales, sans autre coloration ou immunohistochimie.

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Protocole

Méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) de James Madison University et animalier et sont en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels.

1. Configuration de la souris

  1. Accueillir un jeune (> P60) souris mâles et femelles floxed homozygotes ensemble pour mettre en place un éleveur paire25.
    Remarque : Un bon contrôle négatif est de mettre en place une paire supplémentaire éleveur de souris de type sauvage, dans lequel Cre l’expression recombinase ne provoquera pas une mosaïque de26.
  2. Permettre à la femelle donner naissance et élever sa première portée avec le mâle. Gardez le mâle avec la femelle pour augmenter la survie de la litière. Après le sevrage, la litière, par exemple à jour après la naissance (P) 21, séparer la femelle et le mâle.
  3. Reproduction murine
    1. Mettre en place un chronométré d’accouplement entre les mâles et femelles25. Utiliser des indices visuels pour déterminer le cycle oestrus des femmes27et recherchez les fiches vaginales le matin après l’accouplement25.
    2. Si une fiche est trouvée, séparer et peser la femelle. Compter le jour comme jour embryonnaire (E) 0,5.
    3. Continuer de peser la femelle tous les 3-5 jours afin de déterminer si elle est enceinte. Les femelles gravides aura une augmentation de 10 à 20 % du poids corporel 7-10 jours après la conception (E0).
      Remarque : Cette étape confirme la grossesse plus tôt et plus fiable qu’une inspection visuelle,25.
    4. Si la femelle n’est pas enceinte, répétez les étapes 1.3.1-1.3.3.
  4. Dès que la grossesse est confirmée, choisir la date de l’électroporation in utero . Pour cibler la couche II/III corticale pyramidale neuronales progéniteurs, effectuer l’électroporation à E15.5.

2. installation de l’ADN

  1. Choisissez un ADN unique construire codant pour une recombinase Cre comme un marqueur fluorescent, comme la protéine fluorescente verte (GFP)28,29. Vous pouvez également utiliser le système de « Supernova », décrit en détail dans les précédentes publications23,24. Voir la liste des matériaux par exemple construit.
  2. Amplifier les exigences de l’ADN à l’étape 2.1 chez e. coli en utilisant des techniques microbiologiques standard30.
  3. Purifier la construction de l’ADN avec un kit de purification de plasmide exempte d’endotoxine suivant les instructions du fabricant. Éluer la construction avec de l’eau exempte d’endotoxine.
    Remarque : Choisir un kit de purification exempte d’endotoxine sur un kit de purification standard est essentiel.
  4. Concentrer l’éluat ADN à 1-3 mg/mL selon désiré étiquetage densité26.
    NOTE : Un titre doit toujours être établi lorsque vous travaillez avec une nouvelle construction de l’ADN, étant donné qu’ils ont des promoteurs et longueurs différentes. Envisager une construction à plusieurs différentes concentrations et/ou s’élève à évaluer l’expression de l’injection. Par exemple, l’injection de 1 µL ou 1,5 µL de 2,0 mg/mL GFP. CRE est capable de provoquer de rares (1 µL) ou dense (1,5 µL) marquage de la couche II/III visuel cortical neurones pyramidaux26.
  5. Ajouter 0,4 % trypan bleu en 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, ajusté à pH 7.4 avec HCl) 01:10 à la solution concentrée d’ADN.
  6. Ajouter 10 x PBS 01:10 à la solution concentrée d’ADN.
  7. Stocker la solution concentrée d’ADN à 4 ° C. La solution peut être conservée indéfiniment.

3. pipette Set-up

  1. À l’aide d’un extracteur capillaire de verre, tirez une pipette avec une très longue pointe conique et très fine (10-15 mm), typique des pipettes pour l’injection de cellules souches embryonnaires ou transfert nucléaire31.
    Remarque : Pour empêcher les débris de contaminer les pipettes, ils convient dans les 2 jours suivant la chirurgie.
    1. Calibrer l’extracteur capillaire de verre en effectuant un essai de rampe, suivant les instructions du fabricant. Utiliser la valeur obtenue de la chaleur pour programmer un tirant du protocole en utilisant les paramètres suivants : chaleur = (valeur de test de rampe + 15), tirer = 30, vel = 120, temps = 100, pression = 200. Insérer le capillaire de verre, fixer à pinces sur extracteur et activer le protocole de tirage programmé, créant un cône sur le capillaire de verre.
    2. Assurez-vous que la longueur du cône est entre 10-15 mm à l’aide d’un microscope optique composé (par exemple 10 X, objectif)31.
  2. Pause-retour la pipette pour former une pointe bords rugueux à 20-25 µm de diamètre.
    1. Centrer une lingette spéciale monocouche (voir la liste des matériaux) sur 50 mL bécher et étirement essuient tendues d’une main. Avec l’autre main, maintenez et pousser une pipette (défilement vers le bas) perpendiculairement et entièrement à travers le centre de la lingette, provoquant une rupture nette dans le cône31.
      Remarque : En poussant la pipette entièrement par le biais de la lingette produira un embout de diamètre 20 à 25 µm environ 70 % du temps.
    2. Confirmer sous un microscope optique composé (par exemple l’objectif 20 x).
      ATTENTION : Utiliser une protection oculaire tout en brisant la vitre.
  3. Calibrer une pipette par aspiration 1 µL de 0,4 % trypan blue en solution 1 PBS x dans un piptte partiellement rempli, puis avoir obtenu son diplôme de la pipette avec marquages 1 µL basée sur la hauteur de 1 µL dans la pipette, à l’aide d’un marqueur à pointe fine d’antialcool. Utilisez la pipette calibrée pour obtenir leur diplôme les autres pipettes avant de le jeter. Garder les pipettes dans un porte-pipette exempt de poussière et autres particules.

4. in Utero électroporation

  1. Placez Graefe forceps, iris ciseaux, Hartman pince mosquito, éponges de gaze non tissées, pince à embout anneau et Pétri sur un plateau en acier inoxydable et envelopper de papier d’aluminium. Placez le plateau et salin de 0,9 % 1 L (0,9 % wt/vol NaCl dans l’eau) en autoclave. Autoclave à 121 ° C et 3,5 kPa pendant 40 min. retirer de l’autoclave et placer dans une zone chirurgicale désinfectée.
    Remarque : Il est essentiel de maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie.
  2. Réchauffer le flacon saline stérilisés à l’autoclave de 1 L dans un petit bain à 38 ° C au moins 2 h avant la chirurgie.
  3. Connecter les électrodes de type pince à épiler et la pédale au générateur (voir la liste des matériaux). Suivant les instructions du fabricant, régler le générateur de livrer cinq impulsions 50 ms 50 V (avec un intervalle de 950 ms) lorsque déclenchée par la pédale. Désinfecter les électrodes de type pince à épiler et placez sur la zone chirurgicale désinfectée.
  4. Faire un cône de nez anesthésie comme publiées antérieurement32, mais utiliser l’extrémité d’un nitrile ou doigt de gant en latex pour former une membrane qui s’adapte en toute sécurité sur l’ouverture du cône de nez. Découper un trou dans le diaphragme suffisamment grand pour contenir sur le museau de la souris.
  5. Profondément anesthésier souris gravides à E15.5 dans une chambre d’induction remplie d’isoflurane (2-4 %) dans l’oxygène pur à 1 L/min. Après environ 1 min, test du réflexe de redressement (doucement inclinez la chambre induction et faire en sorte que la souris ne pas droit lui-même). Peser la souris afin de déterminer les doses d’analgésiques administrés plus tard au cours de la chirurgie.
  6. Transférer la souris dans la zone chirurgicale et administrer par inhalation isoflurane (1-2 %) en oxygène pur à 1 L/min grâce à un cône de nez pour maintenir la souris au plan chirurgical. Utiliser des pinces pour tester le réflexe pédale (pincer la patte délicatement et faire en sorte que la souris ne retourne pas un réflexe) pour vérifier les anesthetization. Surveiller la fréquence respiratoire et l’effort, vous cherchez régulier de respiration profonde, (~ 70-100 respirations/min), et que les muqueuses sont couleur rose et humide.
  7. Appliquer suffisamment pommade ophtalmique vétérinaire au-dessus des yeux pour les couvrir complètement pour la protection contre l’assèchement durant la procédure.
  8. Flex, le disque de métal activateur d’un sachet rempli de sel solution sursaturée (voir la liste des matériaux), activant une cristallisation exothermique du sel. Posez 2 lingettes monopli tâche sur le dessus de la pochette et placez la souris sur la pochette pour maintenir la température du corps.
  9. Massage crème dépilatoire sur la zone abdominale avec des cotons-tiges jusqu'à dissolution de fourrure abdominale (environ 20-40 s), puis essuyez les fourrures abdominale. Nettoyez soigneusement tout reste de la crème dépilatoire et de résidus avec 70 % d’éthanol et coton écouvillons. Placez un drapé chirurgical stérile fenêtré sur la région abdominale.
  10. À l’aide d’une technique aseptique, tirer la peau vers le haut et loin l’abdomen avec une pince de Graefe et pratiquez une incision de la ligne médiane ventrale ~ 2 cm sur la peau à l’aide de ciseaux iris, veiller à ce que le muscle sous-jacent n’est pas coupé.
    NOTE : Une alternative acceptable à faire une incision avec des ciseaux Graefe forceps et iris est d’utiliser un scalpel, tel que publié précédemment17.
  11. Trouver la linea alba à visualiser la ligne médiane de la droit de l’abdomen. Tirer musculaire vers le haut de l’abdomen avec Graefe forceps et faire une autre incision médiane ~ 2 cm il avec des ciseaux iris, exposant ainsi la cavité abdominale (l’utérus est translucide et embryons sera masquées). Veiller à ce que qui sous-tendent les tissus utérins et intestinale n’est pas coupé. Faire l’incision seulement assez grande (généralement ~ 2 cm) de sortir et d’exposer l’utérus confortablement.
    NOTE : Une alternative acceptable à faire une incision avec des ciseaux Graefe forceps et iris est d’utiliser un scalpel, tel que publié précédemment17.
  12. À l’aide d’une pointe de micropipette µL 10 stérile, distribuer le carprofène (dissous dans la solution saline 0,9 % stérile) à 4 mg/kg dans la cavité abdominale pour l’analgésie.
  13. Pince un forceps de moustique Hartman au bord gauche de l’incision d’abdominis rectus. Reposer la pince sur renversé Pétri à gauche de l’incision, en gardant le côté gauche de l’incision ouverte. Clamp forceps de moustique Hartman un autre sur le bord droit de l’incision d’abdominis rectus et reposer la pince sur une boîte de Pétri renversé vers la droite de l’incision, en gardant le côté droit de l’incision ouverte. Placer le tampon de gaze autour de la zone de l’incision.
  14. À l’aide de pince anneau (sans une vis ci-joint), tirez sur l’utérus entre les deux embryons voisins sans écraser ou blesser n’importe quel tissu. Commencer tirant tous les embryons dans l’incision, les pose sur le dessus de la gaze, éponge. Lorsque vous retirez les derniers embryons dans la cavité abdominale, veillez à ne pas tirer sur les ovaires ou le col de l’utérus. Une fois exposé, il est essentiel de conserver l’utérus humide avec du sérum physiologique tiède. L’utérus contient généralement entre 5 et 8 embryons.
    Remarque : Il est possible d’ajouter de la pénicilline et la streptomycine à la saline17.
  15. Connecter une pipette calibrée à l’ensemble de tube d’aspirateur (voir la liste des matériaux) et injecter exactement 1 µL de la solution d’ADN préparée à l’étape 2 par le biais de la paroi de l’utérus dans un ventricule latéral de chaque embryon. Ventricules latéraux apparaissent comme deux taches sur le télencéphale dorsal de l’embryon (patchs sont plus sombres que les tissus du télencéphale environnants). Utiliser le pouce et l’index pendant la microinjection et électroporation pour manipuler les embryons, révélant les ventricules latéraux et en permettant les embryons qui se pousse doucement contre la paroi de l’utérus pendant l’injection. Confirmer injection réussie en observant trypan bleu de remplissage du ventricule latéral.
  16. Placer la cathode des électrodes de type pince (voir la liste des matériaux) sur l’utérus, directement sur le cortex médial et caudal pour cibler le cortex visuel (ciblant d’autres zones du cerveau différentes électrodes exigera)16, 26. Placez l’anode sur l’utérus, juste inférieure et antérieure à tête de l’embryon.
  17. Confirmer que l’anode et la cathode sont en contact avec l’utérus entourant l’embryon aux endroits appropriés. Avec une pédale, déclencher la livraison de cinq impulsions 50 ms 50 V (avec un intervalle de 950 ms) entre les électrodes.
    Remarque : L’injection, charge négative ADN se déplacera vers la cathode et est incorporée dans les cellules de la zone ventriculaire plus proches de la cathode.
  18. Retourner l’utérus dans la cavité abdominale dans le même sens, qu'il a été constaté. Utilisez une solution saline pour lubrifier l’utérus tout en guidant manuellement et très délicatement, prenant soin de ne pas pour déplacer des embryons de leur position dans l’utérus.
  19. Fermer les muscles abdominaux avec des sutures résorbables (voir la liste des matériaux) à l’aide d’un simple point interrompu, attacher les extrémités avec un nœud de chirurgien de. Ne pas agrafe que les extrémités trop près pour le noeud ou le nœud deviendra déverrouillé.
    Remarque : Il est essentiel à la suture des muscles abdominaux tels que les bords de la plaie sont complètement fermés fermés, mais sans provoquer de blanchiment du muscle. Nœuds doivent être serrés, donc ils ne peuvent pas se détacher.
  20. Fermer la couche de la peau avec des sutures résorbables (point interrompu simple, nœud de chirurgien, comme à l’étape 4.19). Appliquez une petite quantité de colle tissu pour sceller la plaie. Appliquer l’adhésif de tissu sur les noeuds pour empêcher le détachant. Utiliser une micropipette pour enlever n’importe quel tissu adhésif entourant la plaie qui peut être aspirée par une micropipette.
  21. Baisser les niveaux d’isoflurane pour 0,5 à 1,5 %. Une fois le tissu adhésif est sec (test en appuyant sur le gant à l’adhésif), retirer du isoflurane et permettre aux femelles de récupérer seul dans une cage chaude. Administrer la buprénorphine par voie intrapéritonéale à 0,03 mg/kg à l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 26G, ½" aiguille.
  22. Continuer à surveiller la souris jusqu'à ce que la souris est complètement rétablie et comporte normalement (c'est-à-dire toilettage, explorant la cage, manger ou boire). Une fois rétabli, placer femelle en cage avec le mâle.
    Remarque : Si toutes les mesures sont suivies, la souris sera généralement reprendre conscience dans les 2 min et commencer immédiatement se déplaçant autour de la cage, montrer aucun signe d’inconfort.
  23. Si la souris donne des signes d’inconfort (p. ex. voûté de posture, les sécrétions de porphyrine)33, administrer carprofène à 0,1 mg/mL dans l’approvisionnement en eau. Si plusieurs signes d’inconfort sont présents, ou si l’inconfort persiste pendant plus de 4 h, malgré l’administration de carprofen, immédiatement euthanasier la souris en administrant une injection létale intrapéritonéale de kétamine (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg)- cocktail d’acépromazine (1,85 mg/kg) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 26 G, ½" d’aiguille et suivre avec une formule secondaire approuvée de l’euthanasie,33.
  24. Pour augmenter la survie des embryons d’électroporation après la naissance, garder la cage dans un endroit calme maintenant salle, exempt de bruits et de vibrations. Enrichir l’environnement avec des igloos en plastique, matériaux de nidification et des compléments alimentaires tels que les graines de tournesol (voir la liste des matériaux). Ne pas déplacer ou déranger la cage, surtout pendant les 3 premiers jours après l’accouchement.

5. histologique préparation pour la microscopie de Fluorescence

Remarque : Ce protocole histologie est optimisé pour la préparation des tissus provenant d’animaux plus vieux que le jour après la naissance (P) 13 qui étaient électroporation in utero. Pour préparer les tissus de jeunes animaux postnatals (P0-P13), il est recommandé de suivre toutes les étapes (y compris transcardial perfusion), bien que le cerveau doit être incluse dans la gélose avant de préparer les sections (étape 5,9). Tissu on peut même préparer des embryons dans 1-2 jours après l’électroporation, à l’aide des méthodes décrites précédemment18,20.

  1. Préparer la solution de paraformaldéhyde (PFA).
    Remarque : Il est impératif de préparer fraîche PFA, dans la journée de l’expérience.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé sous une hotte avec un équipement de protection individuelle approprié.
    1. Faire 50 mL 4 % PFA, chaleur 40 mL d’eau à 60 ° C. Ajouter 2 g PFA en remuant avec verre tige ou agitation bar. Ajouter 10 µL de 10 M NaOH toutes les 2 min jusqu'à dissolution du PFA.
    2. Ajouter 5 mL de 10 x PBS et apporter la solution pour un volume final de 50 mL avec de l’eau.
    3. Après avoir longuement solution à 50 mL, ajuster le pH à 7,4 selon les besoins avec la solution de HCl. Allow 10 M pour refroidir et stocker à 4 ° C.
  2. Euthanasier des souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - cocktail d’acépromazine (1,85 mg/kg) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 26G, ½" aiguille. Transcardially perfuse 10 ou 20 mL x 1 glacee PBS, suivie de 25 ou 40 mL glacee, fraîchement faites 4 % PFA17. Utiliser des volumes plus faibles pour jeunes postnatal (P0-P13) souris et des volumes plus élevés chez les souris âgées (P14 et ci-dessus).
  3. Immédiatement après la perfusion, décapiter la carcasse de la souris entre l’os occipital et vertèbre C1 avec des grands ciseaux et décollez et jeter la majeure partie de la peau qui entoure le crâne à l’aide de ciseaux de l’iris, la peau particulièrement occipital, pariétal et frontal environnant OS. Garder intact le crâne et le cerveau.
  4. Placez le crâne et le cerveau en 10 mL 4 % PFA dans un tube conique de 50 mL à 4 ° C pendant 24 h pour fixer le tissu. Puis ajoutez 30 mL 1 x PBS à tube à fond conique pour diluer la solution à 1 % PFA pour stockage à 4 ° C.
    Remarque : Utiliser un tube conique distinct pour chaque crâne et le cerveau pour être fixé après. Incuber pas le cerveau dans 1 % PFA pendant plus de 2 semaines, ou fluorescence commencera à s’estomper.
  5. Place du cerveau et du crâne sur une surface plane avec monocouche lingettes tâche imbibés de solution 1 PBS x. Utilisez une paire de pinces (voir la liste des matériaux) pour lever les peau ou membrane qui entoure le crâne.
  6. À l’aide de pinces à épiler, retirez d’abord l’os occipital, puis retirez avec précaution les os pariétaux, déplacer les pinces en les éloignant de la surface du cerveau. Retirez soigneusement les méninges pour ne pas endommager le cortex.
  7. L’arrière de la pince à épiler une cale sous le cerveau le long du crâne de rompre des nerfs crâniens et retirer le cerveau.
  8. Pour les jeunes cerveaux postnatal de (P0-P13)
    1. Faire 25 mL de gélose de 4 % en chauffage PBS 1 x 25 mL à 80 ° C. Remuer et dissoudre 1 g de gélose d’un verre tige ou agitation).
    2. Solution de cool à 35 ° C tout en continuant de remuer. Placer le cerveau dans un petit récipient (par exemple le bouchon d’un tube conique de 50 mL) et verser la solution d’agar sur cerveau. Permettre l’agar à durcir.
  9. Faites une coupe coronale manuellement à l’aide d’une simple lame de rasoir à travers le cerveau, environ 0,5 mm de rostral au bregma. Faites une autre coupe coronale à travers le cerveau environ 0,5 mm caudal au cortex visuel. Placer une piscine de la colle cyanoacrylate du même diamètre que l’extrémité rostrale du cerveau sur le centre du disque échantillon vibration microtome. Placer l’extrémité rostrale du cerveau sur le dessus de la piscine de la colle, en veillant à ce que la totalité de la surface rostrale du tissu est lié au disque échantillon avec de la colle.
  10. Monter le plateau de tampon sur vibration microtome et fixer avec levier de serrage intégré. Insérez la lame dans porte-couteau et monter le porte-couteau sur vibration microtome avec vis de serrage intégré. Fixer le disque de spécimen avec cerveau sur bac tampon à l’aide du dispositif de serrage intégré. Réglage de la vitesse programmée à 5,70 (= 0.285 mm/s) et réglage de la fréquence à 5,33 (53,3 Hz).
  11. Remplir la chambre au-dessus du niveau du cerveau avec du PBS 1 x et abaisser la lame dans du PBS. Commencer à prendre 100 µm coronale sections à travers le tissu.
  12. Si ne nécessitant ne pas un traitement supplémentaire, tel que 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) la coloration des noyaux ou immunohistochimie.
    1. Utiliser un pinceau à pointe fin pour transférer des articles directement à partir de la vibration microtome sur une lame de microscope, montage de 4 à 6 sections sur chaque diapositive.
    2. Laisser les sections séchant par mèche solution away avec un pinceau à pointe fine, telle que les tranches de cerveau n’est plus la dérive sur les diapositives.
    3. Ensuite, placez une goutte de milieu de montage (voir la liste des matériaux) sur chaque section sur la diapositive.
    4. Doucement, posez une lamelle de 24 x 50 mm sur le dessus, veiller à ce que 1) aucune bulle d’air forme sur les sections, 2) les sections ne se déplacent pas, et 3) le mountant couvre entièrement la zone située entre la lame et lamelle. Permettent le montage soigner pendant au moins 24-48 h.
  13. Pour colorer les noyaux au DAPI pour examen histologique des limbes corticales
    1. Utiliser un pinceau à pointe fin pour transférer chaque section dans une solution contenant 10 µg/mL DAPI (voir la liste des matériaux) dilué dans du PBS 1 x de la solution mère (20 mg/mL DAPI dans l’eau).
    2. Incuber en solution DAPI pendant 5 min à température ambiante, puis utilisez un pinceau à pointe fin pour transférer la section de la solution DAPI à 1 x PBS et incuber dans du PBS 1 x pendant 5 min à température ambiante. Transférer la section deux fois plus de PBS frais 1 x de 5 min chacun. Puis, à l’aide d’un pinceau à pointe fin, transfert la section sur une lame de microscope, suivez les étapes 5.11.2-5.11.4 et passez à l’étape 5.13.
  14. Faire chauffer un plat de Pétri de verre contenant Valap (parts égales Vaseline, lanoline et paraffine) sur une plaque chauffante à une basse température jusqu'à ce que complètement fondu. Joint exposé bords de diapositives en les badigeonnant de Valap fondu.
  15. Pour inspecter la fluorescence dans les tissus, utiliser un microscope optique ou microscope confocal (voir la liste des matériaux) et un filtre défini adéquat pour visionner le fluorophore (p. ex. DAPI : excitation 325-375 nm, émission 435-485 nm ; GFP : excitation 450-490 nm, émission 500-550 nm)17. Images confocales peuvent être prises avec faible - (4 X, ouverture numérique, NA = 0,20), moyen-(20 X, NA = 0,75) et haute puissance (60 X, NA = 1,40) objectifs.

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Résultats

La construction unique de GFP. CRE (voir la liste des matériaux) a été électroporés à E15.5 et visualisé à P14. Selon la concentration de la construction et le volume d’injection, un résultat dense ou clairsemé, peut être obtenu22,26. Par exemple, l’injection de 1 µL de 2 mg/mL GFP. Résultats de cre une distribution clairsemée des cellules marquées, dont certaines peuvent être vives (Figure 1 a) et lo...

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Discussion

Ici, nous introduisons la combinaisondes in utero électroporation avec recombinase Cre chez la souris floxed pour générer des tissus cérébraux de mosaïque. Un avantage de cette approche est qu’une nouvelle ligne de souris n’a pas besoin d’être générés chaque fois qu’un autre sous-type cellulaire est d’être la cible : in utero électroporation permet de cibler des neurones excitateurs, neurones inhibiteurs ou cellules gliales selon la période et l’emplacement de l’électroporation15...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le généreux soutien du département de biologie de l’Université James Madison et James Madison University lumière microscopie Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele pour obtenir des conseils utiles au sujet de la préparation de jeunes tissus postnatal, et Drs Justin W. Brown et Corey L. Cleland de coordination généreux d’espace et de matériel chirurgical. Cette recherche a été financée en partie par une subvention de recherche concertée par 4-VA, un partenariat de collaboration pour faire progresser le Commonwealth de la Virginie (G.S.V.) et par une Virginie Académie des Science petit projet subvention de recherche (G.S.V.). Appui a été généreusement fourni par une dotation de Betty Jo Butler aimante 58 pour la bourse de recherche de premier cycle (à K.M.B.), une bourse de recherche de l’été de Farrell (pour K.M.B.), une bourse de siècle deuxième James Madison University (pour K.M.B.), un James Madison University bourses du centenaire (à C.J.H.), un James Madison University recherche 30 Lucy Robinson Memorial Scholarship (à Z.L.H.) et un James Madison University College of Science et de la bourse d’aide Faculté de mathématiques (à G.S.V.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souris C57BL/6JThe Jackson Laboratory#000664Voir "1. Configuration de la souris » (étape 1.1, « souris de type sauvage »)
GFP. Cre vecteur videAddGene#20781Voir "2. configuration de l’ADN » (étape 2.1 « construction d’ADN unique qui code pour la Cre recombinase ainsi qu’un marqueur fluorescent »). GFP. Cre vecteur vide était un cadeau de Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138Voir "2. Configuration de l’ADN » (étape 2.1 système « Supernova ») et http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) était un cadeau de Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136Voir "2. Configuration de l’ADN » (étape 2.1 système « Supernova ») et http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) était un cadeau de Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006Voir "2. Configuration de l’ADN » (étape 2.1 système « Supernova ») et http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) était un cadeau de Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362Voir "2. Configuration de l’ADN » (étape 2.3 « Kit de purification de plasmide sans endotoxines »)
Poudre de Trypan Blue, qualité BioReagentSigmaT6146-5GVoir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « bleu trypan »)Chlorure
de sodium, ACS, 2,5 kgVWRBDH9286-2,5KGVoir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « NaCl »)
Chlorure de potassium, ACS, 500 gVWR#97061-566Voir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « KCl »)
Phosphate de sodium dibasique, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GVoir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « Na2HPO4 »)
Phosphate de potassium monobasique, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GVoir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « KH2PO4 »)
Acide chlorhydrique, réactif ACS, 500 mLFisher ScientificA144-500Voir « 2. Configuration de l’ADN » (étape 2.5 « HCl »)
P-97 Extracteur de micropipetteInstrument de sutterP-97Voir « 3. Mise en place de la pipette (étape 3.1 « Extracteur capillaire en verre »)
Instrument de sutteràfilament de 3,0 mm de large« 3. Configuration de la pipette » (étape 3.1 « Extracteur de capillaire en verre »)
Capillaires en verre à paroi mince, 4 », 1 / 0,75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4Voir « 3. Configuration de la pipette » (étape 3.1.1 « capillaire en verre »)
Lingettes Soft-Tech monocouches, 4,5 poPhenixLW-8148Voir « 3. Mise en place de la pipette » (étape 3.2.1 « essuyage de tâche monocouche ») ; d’autres lingettes monocouches (par exemple Kimwipes) peuvent être utilisées.
Pince Graefe, 7 cm, droite, 0,7 mm 1x2 dentsWorld Precision Instruments#14140Voir "4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « Pince Graefe »)
Ciseaux à iris, 11,5 cm, droits, paquet de 12World Precision Instruments#503708-12Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « ciseaux à iris »)
Hartman Moustique Forceps, 9 cm, droite, paquet de 12World Precision Instruments#503728-12Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « Pince anti-moustiques Hartman »)
Éponges non tissées à usage général, 2 » x 2 », 4 plisMedrepexpress#2204-cVoir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « éponges de gaze non tissées »)
Pince à anneau, 10 cm, droite, 2,2 mm IDWorld Precision Instruments#503203Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « pince à anneau « )
Boîtes de Pétri en pyrex complètes, O.D. & fois ; H 100 mm & temps ; 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EAVoir "4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « Boîtes de Pétri »)Plateau d’instruments
de type plat, acier inoxydable, 13-5/8 » x 9-3/4 » x 5/8"AmazonB007SHGAHAVoir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.1 « plateau en acier inoxydable »)
Pince à épiler en platine, 5 mmBTX#45-0489Voir « 4. Électroporation in utero » (étapes 4.3 et 4.16 « électrodes de type pince à épiler »)
ECM 830 PédaleBTX#45-0211Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.3 et 4.17 « pédale »)
ECM 830 GénérateurBTX#45-0052Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.3 « générateur »)
Système d’anesthésie isoflurane chez un seul animal avec petite boîte d’inductionAppareil de Harvard#72-6468Voir « 4. Électroporation in utero » (étapes 4.4 et 4.6 « cône nasal », étape 4.4 « chambre d’induction »)
Pommade ophtalmiqueHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.7 « pommade ophtalmique vétérinaire »)
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.8 « sachet scellé rempli de solution saline sursaturée »)
Gel crème décapant, formule sensibleVeet#062200809951Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.9 « crème dépilatoire »)
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pqt)Phenix Research ProductsTSP-10LKITVoir « 4. Électroporation in utéro » (étape 4.12 « stérile 10 & micro ; Pointe de micropipette L »)
Tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibréesSigma-AldrichA5177Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.15 « Assemblage du tube d’aspiration »)
Suture résorbable tressée, 4-0, Aiguille NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397Voir « 4. Électroporation in utéro » (étape 4.19 « sutures résorbables »
) » LiquiVet Rapid" Adhésif tissulaireMedrepexpressVG3Voir "4. Électroporation in utero » (étape 4.20 « adhésif tissulaire »)
Seringues hypodermiques, polypropylène, embout Luer lock, contenance 1,0 mLSigma-AldrichZ551546-100EAVoir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.21 « Seringue de 1 mL »)
Aiguilles de seringue BD Precisionglide jauge 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EAVoir "4. Électroporation in utero » (étape 4.21 « 26G, ½ ; ” aiguille »)
Nestlets Matériel d’emboîtementAncareNES3600Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.24 « matériaux de nidification »)
Graines de tournesol, huile noire,Bio-ServS5137Voir « 4. Électroporation in utero » (étape 4.24 « graines de tournesol »)
Paraformaldéhyde, 97 %Alfa AesarA11313Voir « 5. Histologie » (étape 5.1.1 « PFA »)
Pince à épiler économique #3, 11 cm, pointes de 0,2 x 0,4 mmWorld Precision Instruments#501976Voir « 5. Histologie » (étape 5.5 « pince à épiler »)Poudre
d’agarAlfa Aesar#10752Voir « 5. Histologie » (étape 5.8.1 « agar »)
Lames de rasoir à un seul tranchant, lame #9Stanley Tools#11-515Voir « 5. Histologie » (étape 5.9 « lame de rasoir à un seul tranchant »)
Disque d’échantillon S D 50 mmLeica#14046327404Voir « 5. Histologie » (étape 5.9 « disque d’échantillon de microtome vibrant »)
Plateau tampon Assemblage SLeica#1404630132Voir « 5. Histologie » (étape 5.10 « plateau tampon »)
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612Voir « 5. Histologie » (étape 5.10 « microtome vibrant »)
Lames de rasoir à double tranchantPersonnaBP9020Voir « 5. Histologie » (étape 5.10 « lame »)
Porte-couteau SLeica#14046230131Voir « 5. Histologie » (étape 5.10 « porte-couteau »)
Studio Elements Golden Taklon Ensemble de pinceaux ronds à manche courtAmazonB0089KU6XEVoir « 5. Histologie » (étape 5.12.1 « pinceau à pointe fine »)
Superfrost Plus Slides ElectronMicroscopy Services#71869-11Voir « 5. Histologie » (étape 5.12.1 « lame de microscope »)
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970Voir « 5. Histologie » (étape 5.12.3-5.12.4 « monteur »)
Verre de couverture, 24 x 50 mm, n° 1Phenix Research ProductsMS1415-10Voir « 5. Histologie » (étape 5.12.4 « lamelle »)
4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542Voir « 5. Histologie » (étape 5.13.1 « DAPI »)
Microscope droit à platine fixeOlympusBX51WIVoir « 5. Histologie » (étape 5.15 « microscope optique »)
Microscope confocal à balayage laserNikonTE2000/C2siVoir « 5. Histologie » (étape 5.15 « microscope confocal »)
Objectif 4x, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XVoir « 5. Histologie » (étape 5.15 « Objectif basse consommation »)
Objectif 20x, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XVoir « 5. Histologie » (étape 5.15 « objectif de puissance moyenne »)
Objectif 60x, NA = 1.40Huile NikonCFI Plan Apo VC 60XVoir « 5. Histologie » (étape 5.15 « objectif haute puissance »)
Voir stérile

Références

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Analyse des mosa ques g n tiquestude du ph notype neuronalInjection de constructions d ADNtalonnage au bleu trypanAnalyse par imagerie confocaleTechnique de marquage parseCiblage des couches corticales
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