Un test Simple Immunofluorescence sur les cellules pour détecter des auto-anticorps contre le récepteur N-méthyl-D-Aspartate (NMDA) dans le sang

Résumé

Nous avons exprimé façon ectopique sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte dans les cellules embryonnaires humaines (HEK293) comme antigène pour détecter des auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA dans le sang des patients soupçonnés d’être atteinte d’encéphalite auto-immune. Cette méthode simple peut être appropriée pour le dépistage en milieu clinique.

Résumé

La présence d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA peut causer divers symptômes neuropsychiatriques chez les patients touchés, appelées encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur. Détection de l’auto-anticorps spécifiques contre le récepteur NMDA dans le sang ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) est essentielle pour le diagnostic exact de cette condition. Le récepteur NMDA est une protéine de canal ionique complexe qui contient quatre sous-unités, dont deux sous-unité obligatoire du récepteur NMDA 1 (NR1) et un ou deux récepteurs de NMDA sous-unité 2 a (NR2A), 2 b sous-unité de récepteurs NMDA (NR2B), sous-unité de récepteur NMDA 2C (NR2C), ou récepteur NMDA sous-unité 2D (NR2D). L’épitope d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA a été signalé à être présents sur le domaine extracellulaire de N-terminale de la sous-unité NR1 du récepteur NMDA. L’objectif de cette étude est de développer un test simple immunofluorescence sur les cellules qui peut être utilisé comme un test de dépistage pour détecter la présence d’autoanticorps dirigés contre une sous-unité NR1 du récepteur NMDA dans le sang pour faciliter la recherche clinique et fondamentale de encéphalite auto-immune du récepteur anti-NMDA.

Introduction

L’encéphalite auto-immune récepteur anti-NMDA est une entité nouvellement reconnue de la maladie qui peut survenir chez des patients de tous âges et affecte principalement les patientes^1,2. Il est l’un de l’encéphalite diagnostiqué plus fréquemment chez les patients présentant la première étiologie inconnue d’encéphalite³. Patients atteints d’encéphalite récepteur anti-NMDA habituellement ont des symptômes avant-coureurs d’un mal de tête ou fièvre, suivie par le développement rapide de changement de niveau de conscience et une variété de symptômes neuropsychiatriques aigus, notamment l’agitation, irritabilité , anxiété, insomnie, hallucinations, délire, agressivité, comportements bizarres, des anomalies de mouvement, dérèglement du système nerveux autonome et saisie attaque^4,5. La reconnaissance précoce de cette condition et le traitement à l’immunothérapie sont importants pour un meilleur résultat et même pleine reprise de patients affectés de⁶. Par conséquent, il est suggéré que l’encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur soit considérée comme un diagnostic différentiel important de patients qui présentent des caractéristiques psychotiques aigus ou d’apparition récente^7,8.

Outre les caractéristiques cliniques, détection d’auto-anticorps contre le récepteur NMDA dans le sang ou le LCR est essentielle pour le diagnostic précis de l’anti-NMDA récepteur encéphalite auto-immune⁹. La plupart des tests immunologiques pour détecter l’auto-anticorps de récepteurs anti-NMDA sont disponibles dans quelques recherches laboratoires^10,11, et il n’y a qu’un seul dosage immunofluorescence de base de cellules disponibles dans le commerce pour le dépistage de la anti-NMDA récepteur autoanticorps¹². L’objectif de cette étude est de développer un test par immunofluorescence sur les cellules interne simple qui peut être idéalement utilisé en laboratoire pour dépister la présence d’autoanticorps anti-NMDA récepteur faciliter la recherche clinique du récepteur anti-NMDA encéphalite auto-immune. Le récepteur NMDA est une hétérotétramère ion channel protéine complexe est spécifiquement exprimée dans le cerveau. Il est fait de deux sous-unités de NR1 obligatoires et la combinaison d’un ou deux sous-unités NR2A, NR2B, NR2C ou NR2D¹³. Une précédente étude rapporte que l’épitope principaux ciblé par les anticorps est au niveau du domaine N-terminal extracellulaire des sous-unités NR1⁵. Par conséquent, dans ce protocole, nous exprimer la protéine recombinante humaine de sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la lignée de cellules épithéliales de rein embryonnaire humain (HEK293) et développer un test d’immunofluorescence sur les cellules pour détecter la classe des IgG des autoanticorps récepteur anti-NMDA dans le sang.

Protocole

L’étude a été approuvée par les institutionnels Review Board de Chang Gung Memorial Hospital à Linkuo, Taoyuan, Taïwan (102-2577A3).

1. préparation du plasmide NR1-GFP Expression

1. Mix 10 ng de plasmide NR1-GFP 100 µl de la souche de cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α dans un stérile de 1,5 mL centrifuger tube, pipette le mélange doucement jusqu'à et bas 4 à 6 fois et incuber le tube sur la glace pendant 20 min.
2. Incuber les tubes à 42 ° C pendant 1 min dans un bain d’eau, retirer le tube du bain-marie, ajouter 1 mL de milieu de bouillon (LB) lysogénie dans le tube et incuber les tubes à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant 1 h.
3. Propage 50 µL du mélange sur une gélose LB contenant l’ampicilline (0,1 mg/mL) et incuber la gélose LB à 37 ° C dans un incubateur pendant la nuit.
4. Prélever une colonie unique sur la gélose LB au jour le jour à l’aide d’un embout stérile, et agiter la pointe dans un dans un tube à culture bactérienne contenant 5 mL de milieu LB et l’ampicilline (0,1 mg/mL). Incuber les tubes à 37 ° C dans un incubateur avec agitation du jour au lendemain.
5. Aliquote 3 mL de la culture bactérienne pendant la nuit dans un ballon jaugé de 500 mL qui contient 250 mL stérile LB médium et l’ampicilline (0,1 mg/mL). Incuber le ballon à 37 ° C sous agitation. Vérifiez régulièrement la densité optique (do) de la culture bactérienne à la longueur d’onde de 600 nm en utilisant un spectromètre jusqu'à ce que le DO600 atteint 0,6-1,0.
   NOTE : Mélanger bien 800 µL de la culture bactérienne pendant la nuit avec 200 glycérol µL pour préparer le stock de glycérol et stocker le stock de glycérol moins de-80 ° C pour une utilisation future.
6. Préparer le plasmide expression NR1-GFP de la culture bactérienne de 250 mL
   1. Recueillir les cellules par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
   2. Resuspendre le culot de bactéries dans 10 mL de tampon remise en suspension contenant la RNase A ; Vortex soigneusement jusqu'à ce qu’aucune touffe n’est vu.
   3. Ajouter 10 mL de tampon lyse de la suspension bactérienne, délicatement inverser le mélange 4 - 6 fois et incuber le lysat à température ambiante (RT) pendant 5 min.
   4. Ajouter 10 mL de tampon préalablement réfrigérées précipitation au lysat, retourner doucement le mélange de 4 - 6 fois.
   5. Versez le lysat dans le Canon d’une cartouche filtrante avec la PAC Attendez 10 min à température ambiante.
   6. Retirez le capuchon de la buse de sortie de cartouche, insérez un plongeur dans la cartouche et appuyez doucement sur le piston. Recueillir le filtrée lysat dans un tube de 50 mL.
   7. Ajouter 2,5 mL propriétaire de tampon du fabricant de la filtrée lysat, mixer le mélange en renversant le tube environ 10 fois et incuber le mélange sur la glace pendant 30 min.
   8. Appliquer le mélange de lysat filtré sur une colonne de filtrage qui a été préalablement équilibrée avec 10 mL de tampon équilibration. Laissez la colonne s’écouler par gravité.
   9. Laver la colonne avec le tampon de lavage 30 mL deux fois, puis éluer l’ADN de la colonne à l’aide du tampon d’élution de 15 mL.
   10. Ajouter isopropanol 10,5 mL (0,7 volumes) à la mémoire tampon d’ADN éluée, bien mélanger et centrifuger le mélange à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C.
   11. Décanter le liquide surnageant avec soin, laver le culot d’ADN avec 5 mL exempte d’endotoxine d’éthanol à 70 % une fois et centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min.
   12. Décanter le liquide surnageant, sécher le culot pendant 5-10 min sous une hotte chimique et dissoudre le culot dans 300-500 µL de tampon sans endotoxine.
   13. Déterminer la concentration de plasmide en mesurant l’absorption de la solution à UV 260/280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
       NOTE : Préparer le plasmide d’expression GFP utilisent le même protocole.

2. la transfection des cellules HEK293 avec le plasmide NR1-GFP Expression

1. Aliquote 200 µL de solution de gélatine de 2 % à chaque puits d’une plaque de culture 48 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 30 min.
2. Aspirer la solution de gélatine depuis les cellules de 5 x 10⁴ HEK293 bien et semences dans 200 µL de milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) dans chaque puits. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   Remarque : Les cellules ont été comptés en utilisant un hémocytomètre.
3. Le lendemain, remplacer le milieu de culture usé avec 200 µL de milieu de culture frais contenant 10 % FBS / puits.
4. Pour chaque bien, préparer la solution A en mélangeant 100 ng de plasmide NR1-tGFP avec le milieu de culture de 20 µL et solution B en mélangeant 0,8 µL de réactif de transfection avec 20 µL de milieu de culture. Multipliez le nombre de puits nécessaires pour préparer le volume total à chaque expérience.
5. Préparer la solution C en mélangeant la solution A et solution B et incuber le mélange à ta pendant 20-30 min.
6. Aliquote 40 µL de solution C dans chaque cupule contenant les cellules HEK293, doucement tournoyer la plaque et incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO₂ pendant la nuit.
7. Vérifier l’expression de protéine recombinante NR1-GFP dans les cellules de l’hôte sous microscope à fluorescence avec un grossissement de 40 X X-200 (excitation/émission : 482/502 nm) et procéder à l’analyse de l’immunofluorescence sur les cellules.
   NOTE : Transfecter le plasmide d’expression GFP dans les cellules HEK293 utilisent le même protocole.

3. cell-based Immunofluorescence Assay

1. Aspirez le milieu usé provenant des puits, puis laver chaque puits avec 200 µL de phosphate buffered saline (PBS), trois fois.
2. Ajouter 200 µL de solution paraformaldéhyde à 4 % pour chaque puits ; Incuber la plaque à RT pendant 15 min.
3. Aspirer la solution de paraformaldéhyde provenant des puits et laver chaque bien avec 200 µL de PBS trois fois.
4. Ajouter 200 µL de 10 % de lait écrémé dans le PBST (0,1 % Tween-20 dans du PBS) solution à chaque puits et incuber la plaque à RT pendant 1 h avec agitant doucement.
5. Aspirer le lait écrémé 10 % en solution PBST du puits, puis laver les puits avec 200 µL PBST une fois.
6. Incuber les puits avec plasma dilué (1/100 dans le PBST) que l’anticorps primaire avec agitant doucement à la droite pendant 1 h.
   NOTE : Plasma est obtenu à partir du sang de patients suspectés d’avoir encéphalite auto-immune.
7. Aspirer le plasma dilué provenant des puits et laver chaque puits avec 200 µL de PBST trois fois.
8. Ajouter 200 µL de chèvre anti-IgG humaine couplé avec Alexa Fluor 594 (1:1, 000 dilution dans du PBST) dans chaque puits et incuber la plaque de culture à RT avec agitant doucement pendant 1 h.
9. Aspirer la chèvre anti-IgG humaine couplé avec la solution d’Alexa Fluor 594 et laver chaque puits avec 200 µL de PBST trois fois.
10. Ajouter 100 µL de solution de glycérol (50 % de glycérol dans du PBS et 1/100 000 de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)) dans chaque puits.
11. Observer et les cellules sous un microscope à fluorescence à l’aide d’un 10 X oculaire et 4 X, 10 X et 20 X objectifs d’image.
    Remarque : Utilisez le bon filtre pour chaque colorant : pour NR1-GFP (excitation/émission = 482/502 nm), pour Alexa Fluor 594 (excitation/émission = 561/594 nm), pour le DAPI (excitation/émission = 358/461 nm). Effectuer le contrôle négatif en utilisant les cellules HEK exprimant GFP de la même manière.

Résultats

En moyenne, nous pourrions obtenir 200-300 µg expression exempte d’endotoxine plasmide NR1-GFP et GFP de culture bactérienne 250 mL suivant la procédure décrite à l’article 1 du protocole. Un montant de 100 ng/puits du plasmide expression a été utilisé pour la transfection des cellules HEK293 cultivées dans la plaque 48 puits comme décrit dans l’article 2 du protocole. 30-24 h après la transfection, les cellules expriment le NR1-GFP et protéines recombinantes GFP a peuvent être détectées ...

Discussion

Il existe plusieurs tests immunologiques à base de cellules pour dépister la présence d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA rapportées dans la littérature, y compris direct sur les cellules immunofluorescence essai¹¹, fixé le test d’immunofluorescence sur les cellules⁹ , et axée sur la cytométrie de flux test¹⁴. Le test d’immunofluorescence direct de base de cellules doit être effectué peu de temps après la préparation des cellules de faç...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GRIN1 (marqué GFP) - Récepteur du glutamate humain, ionotrope, N-méthyl D-aspartate 1 (GRIN1), variante de transcrit NR1-1	Origene (Rockville, MD, États-Unis)	RG219368	clone d’ADNc NR1 marqué avec des séquences tGFP C-terminales
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, États-Unis)	PS100010	vecteur mammifère avec marqueur tGFP C-terminal
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Allemagne)	12362
Lipofectamine 2000 Réactif de transfection	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Sérum Réduit Moyen	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, Glucose élevé, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Sérum de veau fœtal caractérisé, Origine US	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Anticorps secondaire anti-IgG humaines (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	A-11014
Contrôle positif : récepteur anti-glutamate (type NMDA)	Euroimmun AG, Lü ; beck, Allemagne	CA 112d-0101
			de dosage Euroimmun