L’évaluation du développement des tissus dans le CAL de fracture au cours de la guérison osseuse endochondrale est indispensable pour surveiller le processus de guérison. Nous rapportons ici l’utilisation d’une résonance magnétique imagerie (IRM)-fixateur externe compatible pour le fémur de la souris pour permettre à MRI scans pendant la régénération osseuse chez la souris.
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Article de méthode
In Vivo Évaluation du développement de cals de Fracture au cours de la guérison osseuse chez la souris en utilisant un dispositif d’ostéosynthèse IRM-compatible pour le fémur de souris
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Guérison des fractures d’os endochondral est un processus complexe impliquant le développement de tissu fibreux, cartilagineux et osseux dans le CAL de fracture. La quantité des différents tissus dans le CAL fournit des informations importantes sur la rupture des progrès de la guérison. Disponible en vivo techniques longitudinalement surveille l’évolution de tissu de cals dans des études précliniques de guérison des fractures à l’aide de petits animaux comprennent la radiographie numérique et imagerie µCT. Toutefois, ces deux techniques ne sont en mesure de distinguer les tissus minéralisés et non minéralisée. Par conséquent, il est impossible de distinguer le cartilage de tissu fibreux. En revanche, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) visualise les structures anatomiques basés sur leur teneur en eau et pourrait donc être en mesure d’identifier une façon non envahissante des tissus mous et le cartilage dans le CAL de fracture. Nous rapportons ici, l’utilisation d’un fixateur externe compatible IRM-compatible pour le fémur de la souris pour permettre des IRM au cours de la régénération osseuse chez la souris. Les expériences ont démontré que le fixateur et un dispositif de montage sur mesure permettent répétitives IRM, permettant ainsi une analyse longitudinale du développement des tissus fracture-Cal.
Introduction
Guérison de la fracture secondaire est la forme la plus courante de la guérison osseuse. C’est un processus complexe imitant des aspects spécifiques du endochondrale ontogénique ossification1,2,3. L’hématome au début de la fracture se compose principalement de cellules immunitaires, de granulation et de tissu fibreux. Faible tension d’oxygène et des souches biomécaniques hautes entravent une différenciation ostéoblastique à l’écart de la fracture, mais promouvoir la différenciation des cellules progénitrices en chondrocytes4,5,6. Ces cellules commencent à proliférer à l’endroit de la blessure pour former une matrice cartilagineuse assurant une stabilité initiale de l’OS fracturé. Durant la maturation des cals, devenus hypertrophiques, les chondrocytes subissent l’apoptose, ou trans-se différencient en ostéoblastes. La néovascularisation dans la zone de transition du cartilage-aux-os fournit des niveaux élevés d’oxygène, permettant la formation de tissu osseux7. Après le pont osseux de l’écart de la fracture, stabilité biomécanique est augmentée et ostéoclastique remodelage du cal fracture externe se produit pour avoir des os physiologique de contour et la structure3. Par conséquent, les quantités de tissu fibreux, cartilagineux et osseux dans le CAL de fracture fournissent des informations importantes concernant l’OS, processus de guérison. Perturbés ou retardé la guérison devient visible par des altérations du développement des tissus cals tant chez les humains et les souris8,9,10,11. Disponible en vivo techniques pour surveiller longitudinalement cals développement des tissus en préclinique fracture guérison des études à l’aide de petits animaux comprennent la radiographie numérique et µCT imagerie12,13. Toutefois, ces deux techniques ne sont capables de distinguer les tissus minéralisés et non minéralisée. En revanche, l’IRM fournit des tissus mous excellent contraste et pourrait donc être en mesure d’identifier les tissus mous et le cartilage dans le CAL de fracture.
Travaux antérieurs a montré des résultats prometteurs pour post mortem MRI chez la souris avec les fractures articulaires des IRM14 et in vivo chez des souris pendant intramembranaires défect osseux-guérison15. Cependant, les deux études a également déclaré limité contraste tissus et la résolution spatial. Nous avons précédemment démontré la faisabilité de haute résolution en vivo IAM pour une évaluation longitudinale de formation de cals doux pendant endochondrale murine fracture guérison16. Nous rapportons ici le protocole afin d’utiliser un fixateur externe compatible IRM-compatible pour ostéotomie du fémur chez la souris, afin de surveiller le développement des tissus cals longitudinalement au cours de la fracture de l’os endochondral processus de guérison. La conception d’un dispositif de montage sur mesure pour l’insertion du fixateur externe assuré une position normalisée lors d’analyses répétées.
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Protocole
animal toutes les expériences conformé au règlement international pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par les autorités de régulation régionales (no 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Allemagne). Toutes les souris ont été maintenus en groupes de deux à cinq animaux par cage sur une lumière de 14 h, 10 h circadien sombre avec l’eau et la nourriture fournis ad libitum.
1. préparation du matériel chirurgical et de pré-traitement des souris
matériel- stériliser tout chirurgicale. Utiliser une température d’autoclavage de 120 à 135 ° C pendant 20-30 min de temps de stérilisation.
- Achat C57BL/6 souris ou souris d’une autre souche qui varient de 19 à 35 g de poids corporel. Suivre les soins appropriés aux animaux et des protocoles expérimentaux conformément aux lignes directrices nationales qui est approuvé par le chercheur ' s Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme. Prévoyez un minimum de la période d’acclimatation de 7 jours avant de commencer la procédure.
- Fournir une analgésie à toutes les souris par l’intermédiaire de l’eau potable, un jour avant l’opération jusqu’au jour troisième postopératoire.
2. Procédure chirurgicale et l’Application du fixateur externe
- Place la souris dans un tube préchargée avec l’isoflurane et 60 mL/min d’oxygène en 5 à 7 %. Après la perte des réflexes posturaux, retirez le tube d’induction de l’anesthésie de la souris et maintenir l’anesthésie via un masque respiratoire, fournissant de l’oxygène isoflurane et 60 mL/min de 1 à 3 %.
Réflexe
- moniteur la patte de motif et hind de respiration pendant l’anesthésie. Veiller à ce que le rythme de la respiration est environ 100 cycles/min et le réflexe de la patte arrière est absent.
Remarque : la quantité de gaz nécessaire ne dépend de l’âge, le sexe, du poids corporel et la souche de souris.
- moniteur la patte de motif et hind de respiration pendant l’anesthésie. Veiller à ce que le rythme de la respiration est environ 100 cycles/min et le réflexe de la patte arrière est absent.
- Avant la chirurgie, injecter la souris avec une dose unique d’antibiotiques par voie sous-cutanée (clindamycine, 45 mg/kg). En outre, pour le maintien de l’équilibre des fluides physiologique, injecter la souris avec un dépôt de liquide sous-cutanée d’une solution saline de 500 µL (0,9 % NaCl).
- Pour empêcher la cornée séchage, applique pommade ophtalmique pour les yeux de la souris. Placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant l’anesthésie et une intervention chirurgicale pour maintenir physiologique la température du corps.
- Enlever la fourrure de la patte droite et frottez la zone chirurgicale avec un désinfectant à base d’alcool. Couvrir la patte arrière droite avec une petite partie d’un gant stérile pour éviter les zones non stériles. Désinfecter le membre postérieur droit trois fois. Placez un drap stérile sur la souris en entier à l’exception de la zone chirurgicale.
- Incise la peau environ 1 cm longitudinalement le long de la face antérieure du fémur droit avec un scalpel. Séparer carrément le m. biceps femoris et le m. vastus lateralis avec pinces et ciseaux micro. Couper le côté d’origine tendon au trochanter de fémur avec un micro ciseaux pour permettre un accès gratuit à la partie antérolatérale de l’OS. Assurez-vous que le nerf sciatique est conservé.
- Placer le fixateur externe (rigidité axiale de 3 N/mm, Figure 1 A) parallèles sur le fémur. Percer les trous de forage par cortex avec une mèche de 0,45 mm et placer la céramique montage des goupilles dans les trous de forage manuellement. Commencez par la broche plus proximale, suivie par la broche plus distale et les deux broches dans l’intervalle.
- S’assurer qu’il n’est aucune tension, compression ou cisaillement sur le fixateur au cours de la procédure de montage, sinon l’écart atteint ostéotomie ne sera pas suffisant en raison de la relaxation du fixateur.
- Humidifier l’OS avec une petite quantité de NaCl stérile pour éviter la déshydratation au cours de la procédure de sciage.
- Créer une ostéotomie de 0,4 mm à travers l’OS entier entre les deux broches internes à l’aide d’une scie à fil 0,4 mm gigli.
NOTE : Éventuellement, une scie oscillante micro peut être utilisé pour créer l’ostéotomie. Veillez à éviter les copeaux métalliques de la scie à l’aire de l’ostéotomie. - Rincer l’écart de l’ostéotomie soigneusement avec 2 mL de NaCl stérile pour retirer des éclats d’os entre le deux cortex de fracturé.
- Adapter les muscles à l’aide d’une suture continue avec une suture résorbable (voir Table des matières). Adapter ensuite la peau à l’aide des sutures non résorbables interrompus (voir Table des matières). Pour éviter la blessure mordre, ne pas placer la suture à la partie crânienne de la plaie.
Remarque : N’utilisez pas de colle de peau ou de clips depuis souris habituellement Retirez-la de la blessure causant des dommages à la peau. - , Nettoyer la zone chirurgicale avec un désinfectant et placez la souris dans sa cage. moniteur la souris et offre suffisamment de chaleur (par exemple par rayons infrarouges) jusqu'à ce qu’il est tout à fait réveillé. surveiller l’eau, consommation de nourriture et poids corporel après la chirurgie pour Assurez-vous que l’animal n’est pas dans la douleur et de détresse. Fournir une analgésie à toutes les souris par l’intermédiaire de l’eau potable jusqu’au troisième postopératoire jour.
Remarque : La souris peuvent être hébergés dans les groupes de jusqu'à quatre animaux. - Contrôler la souris ' activité s sur 1 à 5 jours après la chirurgie. Pendant ce temps, la souris devait porter le poids sur le membre opéré. Dans le cas contraire, la souris doivent être exclue de l’analyse.
3. IRM et analyse d’images
- avant l’IRM scanner procédure, anesthésier la souris selon le protocole de mesures 2.1 et 2.3 et garder le rythme respiratoire environ 100 cycles/min. ajouter le fixateur externe à la patte droite de la souris avec soin dans un dispositif de montage sur mesure ( Figure 1 B, C).
- Veillez à éviter la flexion ou compression du fixateur au cours de cette étape car cela peut interférer avec la guérison des fractures.
Remarque : L’IRM peut être effectuée aussi tôt que 3 jours après la chirurgie, selon le protocole expérimental et soin des animaux.
- Veillez à éviter la flexion ou compression du fixateur au cours de cette étape car cela peut interférer avec la guérison des fractures.
- Placer la souris sur un berceau à température contrôlée pour être introduit dans l’appareil de MRI. Fixer le dispositif de montage rigide à la bobine de tête de quatre éléments.
- Données de l’IRM acquérir en utilisant un système dédié de MRI de petits animaux haut champ fonctionnant à 11,7 T.
Remarque : la géométrie de l’IRM données acquisition est alignée sur le fémur, orthogonalement aux vis.- D’acquérir des données en appliquant une densité protonique réprimés graisse multi-slice TSE séquence (PD-TSE) à l’aide des paramètres d’acquisition : echo/répétition temps TE = 5,8 ms/TR = 2 500 ms, résolution Δr = 52 × 52 × 350 µm³, champ de vision (FOV) = 20 × 20 mm² et bande passante Δω = 150 KHz.
- Remarque : le temps d’acquisition total de 22 tranches est 36 min.
- Ouvrir les données acquises avec l’analyse d’images. Entrez la taille du voxel comme 0,05 x 0,05 x 0,35 mm 3. Segmenter les différents tissus dans le CAL de fracture (OS, cartilage, le tissu fibreux/moelle épinière) basées sur leur intensité avec seuillage semi-automatique comme suit.
- Cliquez le " Edit nouveau Label champ ", cliquez sur " ajouter matériel " et renommez le matériau à " Cal ". Distinguer la zone cals les tissus environnants, fondée sur le signal hypo-intense le périoste en faisant le " Lasso " outil.
- Click " ajoute au matériel ". Cliquez sur " ajouter matériel " et renommez le matériau à " cartilage ". Segmenter le cartilage à l’aide de la " seuil " outil et " sélectionner uniquement le matériel actuel " de " Cal ". Cliquez sur " cartilage " et " ajoute au matériel ". Répétez ces étapes avec " OS " et " du tissu fibreux/moelle osseuse ".
- Générer des reconstructions 3D du fémur fracturé basés sur les données de segmentation de tissu à l’aide de logiciels d’analyse image. Cliquez sur " Surface générer ", appliquer " aucun " pour " Type de lissage " et cliquez sur " vue de Surface ".
NOTE : Très petites zones hyper intense entourant le frDS de la fracture cortex sont susceptibles d’être des artefacts en raison de la transition entre osseuses et des tissus mous. Ces zones devraient être exclus de l’analyse. Les zones hyper-intense au milieu de la fracture Cal pendant la phase d’endochondrale de fracture guérison représentent tissu cartilagineux. Des zones hypo-intense dans le CAL de fracture distal de l’écart de l’ostéotomie à la phase d’ossification endochondrale et avec la même intensité tout au long de toute fracture Cal à plus tard la guérison stades représentent le tissu nouvellement formé de Cal osseux. Bien que ces régions ont un signal hypo-intense, l’intensité du signal de la maturité osseuse (cortex) est encore plus bas. Après seuillage l’intensité du signal pour le tissu osseux et le tissu cartilagineux dans le CAL de fracture, marquer le reste comme la moelle osseuse et le tissu fibreux. Sont des valeurs pour la segmentation des tissus : tissu osseux (y compris le cortex mûr, l’OS trabéculaire et cals osseux) est segmenté dans la plage 1-3.3 (intensité du signal normalisé au cortex mûr), du tissu fibreux/moelle osseuse dans la fourchette de 3,4 à 5,4, et cals cartilagineux dans la plage de 5.5 et 6.2. - Si nécessaire, répéter l’IRM longitudinalement au cours de la fracture, processus de guérison. Pour surveiller le développement de cals cartilagineux, scan des souris sur 10, 14 et 21 jours après la chirurgie.
Remarque : Les points dans le temps peuvent dépendre le protocole expérimental et soin des animaux.
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Résultats
Tout d’abord, le succès de l’intervention chirurgicale peut être confirmé par l’analyse de l’IRM (voir exemple à la Figure 2). Tous les quatre épingles doivent être placés au milieu de la tige fémorale. La taille de l’écart de l’ostéotomie doit être comprise entre 0,3 et 0,5 mm. Si la taille de l’écart de l’ostéotomie varie grandement de ces valeurs, la souris doivent être exclue de l’analyse.
Deuxi...
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Discussion
Modifications et dépannage :
L’objectif principal de cette étude était de décrire un protocole pour l’utilisation d’un fixateur externe compatible MRI pour ostéotomie du fémur chez la souris avec la possibilité de surveiller le développement des tissus cals longitudinalement pendant le processus de guérison des fractures des os endochondral. La conception d’un dispositif de montage sur mesure pour l’insertion du fixateur externe assuré une position normalisée lors d’analyses r...
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Déclarations de divulgation
L’auteur Matthys Romano est un employé de RISystem AG Davos, Suisse qui produit les implants et les instruments spécifiques utilisés dans cet article de l’implant. Tous les autres auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Nous remercions Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verena Fischer, Katja Prystaz, Yvonne Hägele et Anne Subgang excellent soutien technique. Nous remercions également la Fondation de recherche allemande (CRC1149, INST40/499-1) et l’Allemagne AO Trauma Foundation pour le financement de cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube d’anesthésie | FMI, Seeheim, Allemagne | ZUA-82-ANA-TUB-Appareil | |
| ; | FMI, Seeheim, Allemagne | ZUA-82-GME-MA | |
| Pince artérielle ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BH104R | |
| Autoclave | Systec, Wettenberg, Allemagne | DX-150 | |
| Emballage d’autoclave | Stericlin, Feuchtwangen, Allemagne | 2301-04/06/10/12/16 | |
| Avizo software | FEI, Burlington, USA-Version | 8.0.1 | |
| BioSpec 117/16 Système d’imagerie par résonance magnétique | Bruker Biospin, Ettlingen, Allemagne | 117/16 | |
| Pince Bulldog ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BH 021R | |
| Scalpel en acier au carbone n° 11/15 | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BA211/215 | |
| Goupille de montage en céramique 0,45 mm ; | RISystem, Davos, Suisse | HS691490 | |
| Clindamycine (300 mg / 2ml) | Ratiopharm, Ulm, | Allemagne-Pince | |
| pansement 115 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BD210R | |
| Pince à pansement 130 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BD025R | |
| Mèche revêtue 0,45 mm ; | RISystem, Davos, Suisse | HS820420 | |
| Porte-aiguille Durogrip 125 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BM024R | |
| Foliodrape ; | Hartmann, Heidenheim, Allemagne | 2513026 | |
| Frekaderm | Fresenius, Bad Homburg, Allemagne | 4928211 | |
| Gigli scie 0,44 mm ; | RISystem, Davos, Suisse | RIS.590.110.25 | |
| Perceuse à main | RISystem, Davos, Suisse | RIS.390.130-01 | |
| Plaque chauffante ; | FMI, Seeheim, Allemagne | IOW-3704 | |
| Gants Hygonorm ; | Hygi, Telgte, Allemagne | 2706 | |
| Isoflurane | Abbot, Londres, Royaume-Uni | Forene | |
| Micro pince 155 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BD343R | |
| Micro-ciseaux 120 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | FD013R | |
| Souris FixEx L 0,7 mm ; | RISystem, Davos, Suisse | RIS.611.300-10 | |
| Étui à aiguilles pour forets ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BL911R | |
| Porte-aiguille | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BB078R | |
| Octenisept | Schü ; lke, Norderstedt, Allemagne | 121403 | |
| Osirix software | Pixmeo SARL, Bernex, | Suisse-Version | 4.0 |
| Oxygène, qualité médicale | MTI, Ulm, | Allemagne-Resolon | |
| 5/0 | Resorba, Nü ; rnberg, Allemagne | 88143 | |
| Saline 0.9 % | Braun, Melsungen, Allemagne | 3570350 | |
| Manche de scalpel 125 mm | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BB073R | |
| Ciseaux 150 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BC006R | |
| Scelleuse pour emballage en autoclave ; | Hawo GmbH, Obrigheim, Allemagne | HM500 | |
| Sterican 27 G ; | Braun, Melsungen, Allemagne | 4657705 | |
| Lames chirurgicales stériles n° 11/15 | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | BB511/515 | |
| Gants chirurgicaux ; | Hartmann, Heidenheim, Allemagne | Peha-micron 9425712 | |
| Lampe chirurgicale ; | Maquet SA, Ardon, France | Ligne bleue 80 | |
| Seringues 5 ml ; | Braun, Melsungen, Allemagne | Injekt 4606051V | |
| Pince à tissus 80 mm ; | Aesculap, Tuttlingen, Allemagne | OC091R | |
| Tramadol 25 mg/l | Grü ; nenthal, Aix-la-Chapelle, Allemagne | 100mg/ml | |
| Vasofix Safety ; | Braun, Melsungen, Allemagne | 4268113S-01 | |
| Vicryl 5-0 ; | Ethicon, Norderstedt, Allemagne | V30371 | |
| Pommade oculaire Visdisic ; | Bausch & Lomb, Berlin, Allemagne | 3099559 |
Références
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Réimpressions et autorisations
