Sténose de la veine cave inférieure : un modèle murin de la thrombose veineuse profonde

Thrombose veineuse profonde (TVP) est le développement du thrombus dans les veines profondes, habituellement (mais pas seulement) dans les jambes. En conjonctions avec embolie pulmonaire (PE ; désignées ensemble en tant que maladie thromboembolique veineuse, TEV) il se développe à environ 900 000 Américains chaque année et représente un grave problème de santé et un problème économique^1,2. PE, une complication de la TVP, se produit quand un thrombus est détaché de son emplacement initial et atteint les poumons, ce qui peuvent causer la mort et une insuffisance respiratoire. Le nombre de morts de VTE dépasse la mortalité due au sida, accidents de breast cancer et trafic, combiné³.

Le principal facteur causant DVT outre connu des raisons, comme le cancer ou un traumatisme, est le manque de mobilité ^4,5. Cela peut résulter de la chirurgie (orthopédique en particulier), de paralysie, de vols longs-courriers ou d’autres raisons. La circulation sanguine dans les veines dépend de la pompe musculaire et donc résultats d’immobilisation du membre dans le sang stagnant coulent dans les valvules veineuses, qui mène à la thrombose. La méthode décrite ici vise à récapituler ces sang débit distorsion^6,7. Restriction de flux partiel dans la veine cave inférieure (VCI) imite les conditions créées dans les valvules veineuses humaines et conduit à la formation d’un thrombus une structure semblable à des thrombi humaine⁶. Une partie importante d’un thrombus est rouge et se compose d’incorporation de plaquettes, de fibrine et de globules rouges. Thrombus ont un petit « cadre blanc » enrichi en plaquettes (Figure 1), qui ressemblent à des « lignes de Zahn », décrits dans le thrombus veineux humains. Les deux parties du thrombus contiennent aussi des neutrophiles⁸, qui sont parmi les premières cellules à recruter sur le site de thrombus future^6,9. Neutrophiles dans la partie rouge expulseront pièges extracellulaires neutrophiles (filets), alors que les neutrophiles dans la partie blanche semblent être dépourvus de filets⁸. De même à la thrombose veineuse profonde, thrombose chez la souris est accompagnée de niveaux de D-dimères plasmatiques élevées (Figure 2). Héparine de bas poids moléculaire (énoxaparine), utilisé pour la prophylaxie de la thrombose veineuse profonde chez les patients, empêche également la thrombose chez la souris. Un avantage important de cette méthode est absence de dénudation endothéliale⁹, qui est caractéristique de l’humain DVT¹⁰. Cette caractéristique rend la sténose IVC un modèle plus cliniquement pertinent de thrombose veineuse profonde que, par exemple, l’induction de la thrombose par le chlorure ferrique, qui induit une dénudation endothéliale et dans lequel des thrombi se composent principalement de plaquettes^{11, 12,},¹³. Un modèle de stase complète dans la VCI est préféré par plusieurs équipes^14,15,16. Contrairement à une sténose, dans lequel le débit résiduel est maintenue dans le vaisseau, application de stase s’arrête complètement la circulation et limitant ainsi l’accessibilité des substances administrées systématiquement sur le site de thrombose. En outre, il semble que les mécanismes qui sous-tendent la thrombose induite par la sténose et de stase sont différents : sténose entraîne le développement de l’inflammation locale (activation de l’endothélium, la libération du contenu de corps de Weibel-Palade, le recrutement des cellules immunitaires et plaquettes de la paroi des vaisseaux) causant des « immunothrombosis »^6,9,17, alors que la stase semble plutôt thrombose issu, en particulier, facteur tissulaire et autre coagulation et les mécanismes axés sur la fibrinolyse^18,19,20. Ainsi, les modèles de la sténose et stase reflètent légèrement différents aspects du développement de thrombus veineux, bien que leurs mécanismes peuvent certainement se chevaucher. Modèle IVC électrolytique (EIM) de thrombose veineuse profonde^21,22 induit un thrombus obstruant partiellement la paroi des vaisseaux. Par conséquent, il est commode pour tester les effets de l’administration systémique de médicaments différents sur la croissance de thrombus. Ce modèle, suppose Toutefois, perturbation de l’intégrité de mur IVC (insertion d’une aiguille) et l’induction de la thrombose par courant électrique faisant la pertinence physiopathologique de ce mécanisme au moins contestable.

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvés par l’organe d’examen éthique des bien-être Animal et le Home Office du Royaume-Uni (UK, projet licence 40/3745). Souris sur fond de C57BL/6, 8-12 semaines vieux, 19-25 g de poids corporel, des deux sexes sont utilisés.

1. animal anesthésie

1. Placez une souris dans une chambre à induction et d’induire l’anesthésie par un mélange de 5 % isoflurane avec 100 % d’oxygène. Utiliser un débit de 0,5 L/min. Attendez que la souris complètement s’immobilise et sa fréquence de la respiration se fait rare.
2. Retirer la souris de la chambre et raser l’abdomen avec une tondeuse électrique. Enlever les poils de l’abdomen aussi complètement que possible pour éviter la contamination de la cavité abdominale.
3. Placer la souris en décubitus dorsal et nez de souris dans un cône lié au système de l’anesthésie. Diminuer le pourcentage d’isoflurane à 2-3 % (le pourcentage exact peut varier légèrement d’un animal à l’autre). Assurez-vous que l’animal dort avec sa fréquence respiratoire étant inférieure à l’habituel, mais en évitant le halètement. En cas de halètement, diminuer le pourcentage d’isoflurane de 0,5 %.
   1. Vérifier le réflexe de pédale pour confirmer anesthetization bonne et marche chirurgie que si elle est négative. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement.
4. Appliquer une solution anti-bactéricide (1 % Hibitane) sur l’abdomen de la souris et essuyer la zone à l’aide d’un coton stérile bourgeon de manière à l’exclusion de recontamination potentielle du site chirurgical (par exemple, l’intérieur vers l’extérieur de façon circulaire). Répéter 3 fois.

2. application de la sténose de l’IVC et le rétablissement de la souris

Remarque : Tous les instruments aussi bien comme matériaux (cotons-tiges, gaze, une solution saline etc.) entrer en contact avec la zone de chirurgie doit être stérile. L’opérateur doit frotter vers le haut avant la chirurgie et porter des gants stériles et une blouse au cours de la procédure. Poignées de microscope doivent être emballées dans une feuille stérile.

1. Donne souris un traitement anti-douleur avant l’opération et Pendant toute la période expérimentale. Par exemple, utiliser la buprénorphine 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée de 30 min avant la chirurgie et puis toutes les 12 heures jusqu'à ce que l’animal est euthanasié. Comme thrombose dans cette méthode se développe de la même façon à une inflammation stérile, évitez d’utiliser des anti-inflammatoires non stéroïdiens comme une prémédication.
2. Couvrir la souris avec un drap stérile et faire un trou dans le drap pour exposer le site de la chirurgie. À l’aide de ciseaux, faire une incision le long de la ligne médiane abdominale, 1,5 cm vers le bas du sternum. En utilisant les cotons-tiges extérioriser les intestins sur le côté gauche de la souris et recouvrez-les avec de la gaze stérile imbibée d’une solution saline tiède (37 ° C) pour éviter le dessèchement.
3. Identifier la VCI et ses branches latérales (il peut y avoir 0, 1 ou 2 d'entre eux) en direction caudale sur le site de la fusion de la VCI avec la veine rénale gauche. Ligaturer toutes les branches de côté visible avec sutures inertes prolène 7-0 comme à proximité de la VCI que possible.
   1. Essayez de ne pas tenir les branches secondaires avec la pince directement, mais plutôt tirer eux tenant le tissu graisseux qui les entourent avec une pince dans une main et faire un tunnel sous la branche avec une pince dans l’autre main. Ne fermez pas les branches dos.
4. Tissus environnants en tenant avec une pince, tirez la IVC vers le haut et à gauche, produisant des tensions dans le petit secteur entre l’IVC et l’aorte exactement à l’angle entre la VCI et la veine rénale gauche. Tenir compte du fait qu’il est pratiquement impossible de séparer l’aorte de l’IVC même 2-3 mm ci-dessous (en direction caudale).
5. En utilisant les mouvements divergents avec embouts de pinces dans votre main droite faire un trou entre l’aorte et la VCI. Gardez à l’esprit que les mouvements plus fait, plus les chances d’endommager le bateau. Idéalement, essayez de réduire au minimum le nombre de mouvements à 3-5.
6. Préparer un morceau de suture de prolène inerte 7-0 d’environ 2 cm de long. Placez-le dans la cavité péritonéale de la souris sur le côté gauche de l’opérateur à proximité de la VCI.
7. La VCI tirer vers le haut et à gauche à nouveau. Insérez vos conseils bonne pince dans le trou entre l’aorte et la VCI afin que les pointes apparaissent sur l’autre côté de la VCI. Prendre la suture et tirez de nouveau dans le trou (Figure 3A).
8. Faire un noeud provisoire avec la suture mais ne le fermez pas. Placer l’aiguille 30G (« cales ») plié comme un crochet dans le noeud et le fermer maintenant (Figure 3B).
9. Retirer l’entretoise (Figure 3C).
10. Retourner les intestins vers la cavité péritonéale avec un coton IUN et répartissez-les également dedans.
11. Péritoine étroite avec suture vicryl de 6-0 à l’aide de boucles continues. Fermer les boucles de la premières et la dernières sous un noeud.
12. Peau de fermeture à l’aide d’agrafes métalliques.
13. Injecter la souris avec 0,5 mL de tiède (37 ° C) physiologique de glucose par voie sous-cutanée pour rétablir l’équilibre liquide de l’organisme.
14. Placez la souris dans une cage individuelle dans une chambre chaude (25 ° C) ou du local et mettre de la nourriture et gel de l’eau à l’intérieur de la cage. Observer jusqu'à ce que la souris est complètement rétablie (en général, environ 1 h).

Ici, on décrit un modèle de thrombose veineuse profonde induite par la déformation du flux dans la VCI. Induction de la sténose dans la VCI lance distorsion et la stagnation de la circulation sanguine et après un certain temps (dans ce cas, 48 h) traduit par l’élaboration d’un thrombus, structurellement semblables aux humains DVT thrombus (Figure 1A). La présence d’un thrombus à l’intérieur de la VCI est facilement détectable visuellement (Figure 1B). Une similitude importante entre le modèle et la thrombose veineuse profonde humaine est niveaux de D-dimères plasmatiques élevées (Figure 2). D-dimères est un produit de dégradation de la fibrine et sa présence dans le sang indique qu’un processus thrombotique actif se passe.

Le modèle est présenté étape par étape dans la Figure 3A-C. La VCI est soigneusement exposée, fait un trou entre la VCI et l’aorte et une suture (prolène 7-0) est passée à travers le trou sous la VCI. Puis la VCI est ligaturée par la suture sur une entretoise (aiguille de 30G, Figure 3D), après lequel l’entretoise est enlevée. Cette procédure permet d’environ 90 % fermeture du lumen IVC laissant les 10 % restants de brevet. Cela garantit la stagnation de flux sanguin aboutissant à la thrombose.

La figure 4 montre l’inconvénient majeur du modèle, de taille variable de thrombus. Tous ces thrombus ont été obtenus dans la même expérience effectuée sur des souris mâles type sauvage du même origine, âge et poids similaires. Bien que toutes les souris produit thrombus (prévalence de thrombose de 100 %), leur taille varie nettement dans un large éventail.

Figure 1 : Représentant thrombus après 48 h restriction/sténose. (A) un thrombus typique après 48 h IVC sténose. Note rouge (enrichie en globules rouges) et les parties blanches (enrichi en plaquettes). (B) IVC avec (de gauche) ou sans (à droite) un thrombus. Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Élevée des D-dimères plasmatiques après application de sténose IVC. Souris ont été soumises à une sténose IVC. Sang a été prise à des points de l’heure indiquée, 1:9 stabilisé avec 3,8 % citrate de sodium, plasma a été préparé par centrifugation (2 300 x g, 5 min) et D-dimères ont été déterminées par un kit ELISA conformément aux instructions du fabricant. Cercles désignent souris opérés, croisements désignent une sténose IVC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Flow restriction/sténose dans le modèle de la veine cave inférieure (VCI) de thrombose veineuse profonde chez les souris. Les phases successives du modèle sont présentés. (A) un trou entre l’aorte et de la VCI est fait et une suture est tirée dedans autour de la VCI. (B), un noeud est fermé sur une entretoise (aiguille 30 G). (C) l’entretoise est supprimée : avis final que le chirurgien voit avant de fermer la souris. La ligne pointillée jaune délimite la VCI. LRV est synonyme de la veine rénale gauche. Barreaux de l’échelle = 0,2 mm ; D l’entretoise (aiguille 30 G). Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 . Variabilité de la taille du thrombus.
Souris ont été soumises à une sténose IVC 48 h. Présentés sont des thrombi obtenus dans la même expérience. Barres d’échelle de 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.