Article de méthode

Un modèle murin de la chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction Cognitive postopératoire et régénération des tissus

DOI :

10.3791/56701

⸱

27 février 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Orthopaedic Surgery, Duke University Medical Center, 3Duke Molecular Physiology Institute, 4Center for Translational Pain Medicine, Duke University Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un modèle de souris de chirurgie orthopédique qui a été utilisée pour étudier les mécanismes de la neuro-inflammation postopératoire et les changements de comportement et lorsqu’il est combiné avec parabiose, pour étudier la régénération des tissus au cours du vieillissement.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chirurgie est couramment utilisée pour améliorer et maintenir la qualité de vie. Malheureusement, chez des patients vulnérables comme les personnes âgées, complications peuvent se produire et diminuent de façon importante l’issue. En effet, après chirurgie orthopédique systématique pour réparer une fracture, jusqu'à 50 % chez les personnes âgées souffrent de complications neurologiques comme délire. En outre, la capacité de guérir et de régénérer les tissus après la chirurgie diminue avec l’âge et peut influer sur la qualité de la réparation de la fracture et même osseuse intégration des implants. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes qui animent ces changements de fonction de l’âge pourrait fournir des cibles stratégiques pour minimiser le risque de ces complications et optimiser les résultats. Ici, nous présentons un modèle murin cliniquement pertinente de la fracture du tibia. L’évolution postopératoire chez ces souris imite certains des incapacités cognitives couramment observées après une chirurgie orthopédique systématique chez l’homme. En bref, une incision est effectuée dans le membre postérieur droit dans des conditions rigoureusement aseptiques. Les muscles sont dissociées, et une broche en acier inoxydable de 0,38 mm est insérée dans la crête supérieure du tibia, à l’intérieur du canal intramédullaire. Ostéotomie est ensuite effectuée, et la plaie est agrafée. Nous avons utilisé ce modèle pour étudier les effets du traumatisme chirurgical sur la neuro-inflammation postopératoire et les changements de comportement. En appliquant ce modèle de fracture en combinaison avec parabiose, un modèle chirurgical dans lequel 2 souris sont anastomosés, nous avons étudié les cellules et facteurs sécrétés systémiquement rajeunissent régénération de tissus et de la fonction orgue après une blessure. En suivant notre protocole étape par étape, ces modèles peuvent être reproduits de haute fidélité et peuvent être adaptés pour interroger plusieurs voies biologiques qui sont altérées par traumatisme chirurgical.

Introduction

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La chirurgie a transformé le système de santé médicaux et contribue en permanence à une technologie de pointe, amélioration de la sécurité et maintenue la qualité de vie. Malheureusement, la chirurgie induit également des réponses physiopathologiques qui peuvent conduire à des complications postopératoires, notamment des infections de plaies et déficiences neurologiques voire de mortalité, en particulier dans les patients âgés de1,2. Chirurgie orthopédique est effectuée régulièrement, surtout chez les aînés, pour améliorer la qualité de vie et de réparer les blessures osseuses fréquentes. Cependant, jusqu'à 50 % des patients de chirurgie orthopédique qui sont de 65 ans et plus vieux expérience déficiences neurologiques telles que la démence postopératoire. Cela constamment est en corrélation avec un pronostic sombre, c'est-à-dire, 5 fois un risque accru de mortalité à 6 mois, déclin fonctionnel persistant, augmenté fois par patiente, une augmentation de durée d’hospitalisation et des taux plus élevés de placement en soins infirmiers de soins infirmiers 3 , 4 , 5. certains facteurs de risque, y compris un âge avancé, ont été identifiés, mais on en sait peu sur les mécanismes responsables de déficiences neurologiques après la chirurgie.

Étant donné que les fractures sont très fréquents chez les personnes âgées, nous avons établi un modèle murin de fracture du tibia pour déterminer l’impact du traumatisme périphérique sur récupération post-opératoire, y compris la neuroinflammation et cerveau santé (fonctions cognitives)6, 7. ce modèle, initialement décrit par Harry et al. 8, se compose d’enclouage intramédullaire et fracture du tibia sous anesthésie générale et une analgésie et imite ainsi les blessures de la peau, les traumatismes musculaires, et OS réparation associée communes fractures d’os long et réparer chez les êtres humains. Après cette procédure, souris montrent des changements dans les marqueurs inflammatoires semblables aux changements observés dans les humains9,10, ainsi qu’activation microgliale dans l’hippocampe, qui est associée à des déficits de mémoire déclarative et neuroplasticité hippocampique6,7,11. Nous avons précédemment associé ce modèle de fracture parabiose. Parabiose est un modèle chirurgical dans lequel 2 souris sont anastomosés et partagent donc un système circulatoire. Ce modèle a permis une percée dans la compréhension des effets régulateurs des cellules circulantes et des facteurs humoraux sur la fonction des organes dans le cadre de l’âge et la maladie12,13,14. En utilisant cette approche, nous avons récemment découvert les facteurs systémiques associés avec une fracture de la fonction de l’âge12de guérison.

Ici, nous introduisons un protocole qui combine le modèle de la fracture du tibia avec parabiose étude os-à-cerveau âge-dépendante mécanismes, qui sont rapportent à la neuro-immunologie et la médecine régénérative. Protocole 1 a décrit la procédure parabiose et les détails du protocole 1 b de la procédure de fracture du tibia (Figure 1 a). Ce peuvent être effectuées indépendamment ou en combinaison, selon la nature de l’interrogatoire.

Protocole

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Toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par l’animalier institutionnel & utilisation Comité (IACUC) à l’Université Duke.

1. des animaux

  1. Garder la souris dans un environnement climatisé avec cycles de lumière/obscurité de 12 h et à un accès satisfaisant à l’eau et de nourriture standard. Maison de même pas plus de 5 portée par cage et éviter les conditions qui pourraient encourager les combats.
  2. Utilisez souris C57BL6/J les femelles à l’âge (jeune) de 3 mois ou 18 mois d’âge (vieux).
  3. Pour parabiose, acclimater 2 souris ensemble pour au moins deux semaines avant la chirurgie. Les souris sont sauvage C57BL6/J ou eGFP +.
  4. Vérifier la condition corporelle et l’aspect global de souris tous les jours.

2. préopératoire Setup pour parabiose et chirurgie orthopédique

  1. Peser les 2 souris.
  2. Administrer une anesthésie générale via un système d’anesthésie à un constante O2 débit de 0,2 L/min. utilisation 5 % isoflurane pour l’induction dans une chambre à induction.
    NOTE : La profondeur de l’anesthésie peut être confirmée à l’aide d’une pincée d’orteil.
  3. Placez les souris sur un coussin chauffant en position couchée. Utiliser une sonde rectale pour surveiller la température du corps tout au long de l’intervention chirurgicale.
  4. Pour maintenir l’anesthésie, abaisser la concentration inhalée d’isoflurane à 2,0 % à 0,2 L/min grâce à un masque facial. Moniteur pour assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie.
  5. Surveiller les paramètres physiologiques (rythme respiratoire, saturation en oxygène et le coeur battement) non invasive utilisant un pulse oxymètre (facultatif).

3. parabiose chirurgie (protocole 1 a)

  1. Administrer les analgésiques (buprénorphine, SR/slow release, 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée) après l’induction et avant toute manipulation chirurgicale. Injecter la bupivacaïne (0,25 %) aux flancs juste avant l’ouverture. Appliquer du lubrifiant oculaire.
    Remarque : Le protocole parabiose peut être effectué indépendamment de la fracture du tibia.
  2. Pour tout le corps interne suturer, utiliser le matériel de suture polydioxanone 4-0. Pour tous la suture externe, utiliser le matériel de suture en polypropylène de 4-0.
  3. Chacun des 2 souris suivant une ligne contiguë du coude, le flanc et le genou sur le côté pour être rejoint raser. Désinfecter avec de l’iode + gommage de peau alcool 70 % plus 3 en alternant les cycles en prévision de l’incision.
    Utilisaient des instruments stérilisés à l’autoclave et de maintenir un champ stérile.
    NOTE : Placez la souris sauvage vers la droite de la souris eGFP et préparer le flanc gauche de la souris sauvage et le flanc droit de la souris eGFP chirurgicaux (Figure 1).
  4. Sur chaque souris, utilisez un ciseau à pratiquer une incision de la peau le long du flanc, allant proximale du genou à proximale par rapport au coude et sans déranger les muscles sous la peau.
  5. Rejoignez les triceps des animaux avec 2 sutures interrompus.
  6. Rejoignez les parois du corps le long des flancs par une suture en cours d’exécution, continue de 7-9 passes.
  7. Rejoignez les quadriceps de l’animal avec 2 sutures interrompus.
  8. Fermer la peau des 2 parabionts avec sutures interrompus.
  9. Laissez les souris se réveiller dans l’air ambiant.
  10. Pour assurer le succès de ce protocole, la santé des paires doit être maintenue : surveiller les paires par jour ; effectuer le conditon, marquant deux fois par semaine ; et peser les paires deux fois par semaine.
    Remarque : Chaque paire est logé individuellement.
    Remarque : Si vous utilisez régulièrement buprénorphine (c’est à dire pas SR/slow release) puis administrer 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée dans 1 mL de solution saline par souris deux fois par jour pendant 3 jours.
  11. Permettre à 4 semaines de temps de récupération pour assurer la circulation partagée entre parabionts si vous effectuez une chirurgie de fracture du tibia.

4. tibial Fracture chirurgie (protocole 1 b)

  1. Administrer les analgésiques (buprénorphine, 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée) après l’induction et avant toute manipulation chirurgicale. Injecter la bupivacaïne (0,25 %) sur le site chirurgical proximal du genou juste avant l’ouverture. Appliquer du lubrifiant oculaire.
  2. Raser la face médiale du membre postérieur droit de la souris pour exposer la zone chirurgicale et désinfecter avec iode + gommage de peau alcool 70 % sur 3 en alternance de cycles. Maintenir un champ opératoire stérile tout au long de la procédure. Pour limiter la contamination ; utiliser des instruments stérilisés à l’autoclave et gants ; compléter la chirurgie sous un microscope à dissection (facultatif) ; et utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température du corps.
    Remarque : Si le protocole est effectué sur parabionts, seulement 1 souris est rompue à la paire (du tibia droit le droit de la souris). Voir Figure 1 b pour un diagramme schématique de la fracture sur parabionts.
  3. Utilisez les ciseaux pour faire une incision de la peau le long de la face médiale du membre postérieur droit proximal du genou jusqu'à la mi-diaphyse du tibia sur le droit de la souris.
  4. Exposer le mi-diaphyse du tibia et localiser visuellement la diaphyse. Fléchir le genou et visualiser le plateau tibial en utilisant le ligament patellaire-fémorale comme point de repère.
  5. Visualiser le tendon rotulien ; Percer manuellement en faisant rouler le pouce et l’index un trou de 0,5 mm dans le canal intramédullaire à l’aide d’une aiguille de calibre 25.
    Remarque : Le trou percé traversera parallèle le long du tibia, dans le plateau tibial.
  6. Insérer une broche en acier inoxydable de 0,38 mm dans le trou de 15 mm dans la cavité médullaire jusqu'à ce que la résistance est ressentie et couper à ras avec le plateau tibial, à l’aide d’un coupe-fil (voir supplémentaire 1 vidéo pour une reconstruction 3D).
  7. À l’aide de ciseaux de Bonn droites, fracture du mi-diaphyse du tibia (diaphyse). Voir Figure 1 pour un diagramme schématique de la fracture.
  8. Visuellement observer l’emplacement de la fracture et les tissus adjacents d’inspecter pour la stabilisation de la hausse de la fracture.
  9. Fermer avec des agrafes par voie cutanée.
  10. Placez les souris sur coussinets chauffants pour récupérer avant leur retour à une cage propre maison. Injecter 1 mL préchauffé (37 ° C) soluté physiologique par voie sous-cutanée dans chacune des souris pour remplacer les liquides.
  11. Vérifier la souris tous les jours des signes de boiterie, une infection ou un saignement.
    Remarque : Si vous utilisez régulièrement buprénorphine (c’est à dire pas SR/slow release) puis administrer 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée dans 1 mL de solution saline par jour pendant 3 jours.

Résultats

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Après que ostéotomies transversales ont été soigneusement effectuées dans des conditions stériles avec insertion stable des épingles et suture appropriée, les souris ont montré aucun signe de boiterie, une infection ou saignement à la jambe gauche après la chirurgie. Orthopédique de guérison a été évaluée à l’aide de l’analyse radiographique et histomorphométrie après safranine-O coloration (Figure 2). Radiographies des tibias fracturés midshaft indiquent plus dépôt de tissus dans les cals de fracture des souris jeunes que chez les cals de fracture des souris âgées. Callosités de fracture étaient détartrées et incorporées à la paraffine en préparation pour l’analyse histologique. Sections ont été colorées avec la safranine-O et les dépôts de tissus a été quantifiée à l’aide d’histomorphométrie analyse. Callosités fracture de jeunes souris contenaient plus les os et les tissus moins fibreuses que les callosités de la fracture de souris âgées.

Fracture du tibia induit une inflammation systémique et central6,7,11,15,16. En effet, les niveaux périphériques des cytokines pro-inflammatoires et profils moléculaires associés à risque (DAMPs) sont rapidement élevées après chirurgie orthopédique, aussi bien dans les souris et les humains7,17,18. Ceci contribue à l’activation des cellules microgliales du cerveau par l’intermédiaire de plusieurs mécanismes de signalisation impliquant les voies neuronales, cellulaire et humorale7,15,19,20, 21. Après la chirurgie, la dysfonction endothéliale, ouverture de la barrière hémato - encéphalique et périphérique macrophage infiltration contribuent à aiguë neuroinflammation hippocampe dans les types sauvages et Ccr2DP / + Cx3cr1GFP / + souris adultes15 , 19et ont été associés à des déficits de mémoire subséquent qui ressemblent à des humain délire et dysfonction cognitive postopératoire15,19,22. Cette réponse thérapeutiques est exacerbée chez les animaux âgés, avec des changements significatifs dans la morphologie des microglies, tel que détecté par immunomarquage IBA-1 (Figure 3).

Utilisant le modèle de fracture du tibia décrit ici, nous avons également constaté la neurogenèse hippocampique transitoirement altérée, comme en témoigne une réduction doublecortin (DCX) immunomarquage dans le gyrus denté20. Des mesures électrophysiologiques de la potentialisation à long terme (LTP), un substitut pour la fonction de mémoire, a révélé une perturbation dépendante du temps dans la neuroplasticité postopératoire11. Souris après chirurgie affichent aussi une déficience en fonction de la mémoire de l’hippocampe-dépendantes, par exemple à l’aide de peur conditionné évaluation comportementale (Figure 4). Dans le conditionnement de la peur, les souris sont placés dans une chambre et exposés à un signal auditif suivi d’un stimulus aversif (c.-à-d., choc). Trois jours après la chirurgie tibiale, souris sont testés dans la salle de conditionnement, cette fois sans aucune stimulation auditive ou aversion, et comportement de congélation est enregistré comme un indice de mémoire (pour un protocole détaillé voir23).

Un âge avancé est un facteur de risque critique pour le déclin de la mémoire. Pourtant, comme nous vieillissons, la capacité de réparation tissulaire et régénération diminue aussi bien que ces mécanismes restent mal compris. Ainsi, nous avons utilisé les protocoles décrits dans les présentes pour effectuer hétérochronique parabiose (appariement des animaux jeunes ou âgés) et évalué fracture de guérison dans la souris âgée (pour un parabiose détaillé protocole voir24). Partage de sang entre les paires de parabiotic a été confirmé et constaté qu’elle égale12. Exposition à une réparation osseuse de jeune circulation améliorée avec union antérieure, augmente de déposition osseuse et diminue la fibrose (Figure 5)12. Ce rajeunissement de la régénération osseuse est produite indépendamment des ostéoblastes endogènes de l’ostéocalcine positifs (Figure 5, brun, cellules), mais plutôt s’est appuyé sur des cellules CD45 positives qui ont migré de la jeune parabiont (cellules de laFigure 5, bleu) . Ces résultats indiquent que les cellules hématopoïétiques CD45 séropositifs sécrètent un créneau jeune et en bonne santé, qui est en mesure de signaler aux cellules âgées ostéoblastique incitant à devenir plus actifs.

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Figure 1 : représentation schématique de la chirurgie de fracture du tibia et de parabiose. Chronologie (A) pour la parabiose et de fracture du tibia (protocole 1 a) ou de fracture du tibia seul (protocole 1 b). (B) tibias de souris de 20 mois par paires parabiotic isochrones ou hétérochronique fracturées (jambe droite de la souris de droite est rompue, comme marqués d’un X). Gris souris représentent des souris de type sauvage alors que la souris vertes dépeignent eGFP souris. (C) le diagramme schématique du modèle de la fracture du tibia avec enclouage intramédullaire et Mid-tige fracturation. Voir aussi supplémentaire 1 vidéo pour une reconstruction 3D du membre postérieur et enclouage du tibia. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : fracture du tibia de guérison au sein des modèles de souris jeunes et moins jeunes. Tibias de jeunes ou moins jeunes souris ont été fracturés et callosités de fracture étaient étudiées 21 jours post lésion. (A) l’imagerie radiographique et une coloration histologiques (safranine-O) ont été utilisées pour évaluer la fracture fracture callosités 21 jours post. La coloration montre tissus collagènes en bleu et protéoglycanes (contenus dans le cartilage) en rouge. Les lignes pointillées indiquent l’emplacement approximatif de la Cal de fracture. (B) histomorphométrie a été utilisée pour évaluer la quantité d’os, du cartilage et tissu fibreux déposés au sein de la fracture fracture Cal 21 jours post. Données sont exprimées en moyenne ± 95 % intervalle de confiance, * P < 0,05, statistiquement significative (ANOVA à, test de Dunnett), barres d’échelle représentent 2 mm, et les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope, l’objectif de 1,25 x. n = 9 pour chaque échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : chirurgie induite par l’activation de la fonction de l’âge des microglies dans l’hippocampe. Chirurgie de fracture du tibia induit plue neuroinflammation hippocampe chez les souris âgées (20 mois) par rapport aux souris C57BL6/J 4 mois. Cerveau-section coloration avec le marqueur microgliales IBA-1 montre plus positive des cellules et des modifications morphologiques chirurgie regroupe 24 h après la chirurgie. Des images ont été obtenues avec un microscope à épifluorescence avec un grossissement de 100 x. ; barre d’échelle représente 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Impaired neurogenèse, potentialisation à long terme et la fonction de mémoire après une chirurgie de fracture du tibia. DCX (A), un marqueur quantitatif de la neurogenèse, est significativement réduite dans le gyrus denté hippocampe à 24 h après la chirurgie. Des images ont été obtenues avec un objectif de microscope confocal à balayage laser avec un grossissement de 10 x ; l’échelle bar représente 10 µm. électrophysiologie (B) dans des tranches d’hippocampe de contrôles ou souris 24h après la chirurgie. Potentialisation à long terme (LTP) a été induite par la stimulation haute fréquence (HFS) et enregistré plus de 1 h. potentiels postsynaptiques excitateurs de champ (fEPSPs) ont été enregistrées de CA1 stratum radiatum à l’aide d’une pipette d’enregistrement extracellulaire remplie régulièrement liquide céphalorachidien artificiel. Après 24 h après la chirurgie, induction de LTP est remarquablement réduite par rapport aux souris témoins. Données sont exprimées en moyenne ± s.e.m. n = 3, * p < 0,05 1-way ANOVA. (C) Hippocampal dépendant fonction mémoire (défini comme % de gel à l’aide de la trace peur conditionné) est altérée chez les souris après chirurgie par rapport aux témoins et les animaux exposés à l’anesthésie seulement. Données sont exprimées en moyenne ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0,05 1-way ANOVA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : chirurgie parabiose mène au rajeunissement de prise de greffe de guérison, le sang-partage et donateurs-cellule fracture. Isochrone et hétérochronique parabiose jumelages ont été établies et la souris âgée dans chaque paire a été fracturée et évaluée pour la guérison osseuse. Fracture (A) les callosités ont été étudiées à l’aide de l’imagerie radiographique. Les lignes pointillées indiquent l’emplacement approximatif de la Cal de fracture. (B) greffe de cellules eGFP + a été confirmée dans la moelle osseuse. Immunohistochimie (C) de la Cal de fracture a été utilisé pour identifier les cellules du donneur eGFP+ (bleus) et les cellules ostéoblastique ostéocalcine+ (bruns) de la parabiont. Barres d’échelle représentent 50 µm et images ont été obtenues à l’aide d’un objectif 40 x. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Reconstruction 3D du membre postérieur et enclouage du tibia. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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Les fractures sont un problème clinique fréquent et demeurent des principales causes de morbidité, particulièrement chez les personnes âgées en pleine croissance. Ici, nous introduisons un protocole étape par étape pour un modèle murin de fracture du tibia pour étudier les mécanismes responsables de la neuro-inflammation postopératoire et les troubles cognitifs. Ce modèle peut être associé à la chirurgie pour étudier les interactions neuro-immunitaires, régénération des tissus et autres processus de signalisation parabiose. Comprendre ces mécanismes fournira des cibles stratégiques afin de minimiser les risques de complications postopératoires et optimiser les résultats.

Plusieurs modèles orthopédiques ont été développés pour étudier la réparation osseuse dans les rongeurs,25. Nous avons adopté et modifié cette procédure de fracture du tibia, initialement décrite par Harry et al. 8, pour étudier les effets de la chirurgie orthopédique sur le fonctionnement du cerveau. Nous avons également utilisé ce modèle de fracture en combinaison avec notre modèle parabiose pour étudier les facteurs qui sont responsables de la cicatrisation osseuse et la régénération des tissus de la fonction de l’âge. Lorsque faites sous anesthésie générale volatile, cette procédure de fracture du tibia nécessite seulement environ 15 min par animal, résultats à zéro à la mortalité minimum (en fonction de l’âge de la souris et les susceptibilités génétiques sous-jacents) et récapitule commune insultes, associées à la fracture des os longs et traumatisme chirurgical orthopédique. Ainsi, ce modèle est idéal pour interroger les voies biologiques et effectuer des évaluations longitudinales. Toutefois, il est essentiel que l’ostéotomie et épinglage sont reproductibles, et qu’un dommage aux tissus mous est conforme. Lésions des tissus mous peuvent être modulées, par exemple en dénudant le périoste et en pinçant les muscles environnants pour rendre la chirurgie plus traumatisante. Modèles de fracture traumatique induite par un traumatisme contondant non fixe ou flexion trois points ne fournirait pas cette cohérence ou l’exactitude. Ces procédures se traduisent souvent par la nouvelle blessure, ce qui conduit à une réponse inflammatoire prolongée. À l’inverse, les modèles de fracture comportant une fixation rigide ont une inflammation plus modérée, ce qui ne pas entièrement récapituler les dommages associés à la chirurgie orthopédique26,27.

Autres modèles en utilisant l’épinglage en alliage de titane ont été développés pour arthroplastie humaine étroitement mimique et peuvent être plus pertinents d’interroger l’instabilité de la prothèse, ostéolyse et complications liées à la prothèse en souris28,29 . Modèles de forage comme celle présentée ici, fournir une stabilisation suffisante, et souris peuvent être testés dans des paradigmes comportements sans déficits importants qui pourraient confondre des tâches telles que peur conditionné ou ouvert champ locomotion/anxiété essais6 ,7,11,15,19,20. Cependant, déformations rotationnels peuvent se produire si la fixation n’est pas verrouillée correctement. Certains modèles utilisent un fixateur externe, ce qui assure une stabilisation supérieure mais est difficile à mettre en œuvre dans un tibia de souris, bien qu’il puisse être appliqué avec succès dans un fémur de souris27.

Des déficiences cognitives, y compris le délire et la dysfonction cognitive postopératoire, sont des complications fréquentes après chirurgie orthopédique pour réparation de fracture, en particulier dans les patients âgés et fragiles,30. Ce modèle de souris cliniquement pertinente de la chirurgie de fracture du tibia illustre que cette cytokine systémique postopératoire release6,7,17, réduite la barrière hémato - encéphalique fonction15,19 et modifié des microglies morphologie16,22, contribuent à l’altération de la mémoire et peut représenter des caractéristiques essentielles des complications neurologiques postopératoires chez beaucoup de patients après une chirurgie orthopédique. Il est important de noter que les autres interventions chirurgicales ont été utilisés pour modéliser la dysfonction cognitive postopératoire chez les souris. Il s’agit d’abdominale31,32,33 et chirurgie vasculaire34 , ainsi que traumatisme superficiel35,,36. La technique parabiose s’applique à l’ensemble de ces modèles, qui partagent des points de terminaison semblables, y compris l’inflammation, l’activation gliale et des déficits comportementaux, qui pourraient être véhiculés par des mécanismes communs.

Études qui incluent parabiose ont révélé de nouveaux rôles pour la circulation des facteurs qui affectent la fonction cognitive, neuro-inflammation et rajeunissement des tissus animaux âgés37,38,39,40 ,41,,42. Nous avons montré que parabiose peut être combiné avec succès avec le modèle de fracture du tibia décrit ici pour interroger les voies régénératrices et étudier des mécanismes faisant intervenir des facteurs véhiculés par le sang que l’influence de guérison et de fracture réparer12. Ici, nous avons démontré que la capacité de réparation de fracture d’un animal âgé peut être rajeunie quand l’animal âgé est anastomosée à un jeune animal. Ce revirement d’âge a été enraciné dans la greffe de cellules hématopoïétiques sur le site de la fracture. Fait intéressant, ce rajeunissement aussi permettrait de réaliser des transplantation de jeunes de la moelle osseuse des souris âgées. À cet égard, greffe de moelle osseuse peut être considéré comme une approche plus directe et plus simple à parabiose. Cependant, parabiose est un modèle plus robuste pour étudier la fonction des cellules circulantes et facteurs. Nous attendons qu’une combinaison de modèles de chirurgie orthopédique et de parabiose jouera un rôle important en répondant à des questions cruciales en soins périopératoires et biologie du vieillissement.

En résumé, nous introduisons un protocole étape par étape pour un modèle murin de fracture du tibia pour étudier les mécanismes responsables de la neuro-inflammation postopératoire et les troubles cognitifs après des interventions chirurgicales orthopédiques. Ce modèle peut être associé à une procédure parabiose pour étudier les interactions neuro-immunitaires, régénération des tissus et autres voies. Définir ces mécanismes fournira des cibles stratégiques afin de minimiser les risques de complications postopératoires et optimiser les résultats.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Kathy Gage, BS (département d’anesthésiologie, centre de médecine de Duke University, Durham, Caroline du Nord) pour l’aide à la rédaction. NT reconnaît le soutien d’une subvention de l’Innovation de rêve de Duke anesthésiologie et NIH/NIA R01 AG057525-01.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-017-25D’autres agents volatils ou anesthésie injectable peuvent également être utilisés
BuprénorphineReckitt-Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496- 6757-1Facultatif et selon les recommandations individuelles du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux
ÉthanolFisher Scientific04-355-451Solution à 70 % pour le traitement antiseptique de peau et nettoyage
10 % povidone iodeDynarexPour le traitement antiseptique de la peau
SomnoSuiteKent ScientificSS-01Low Flow  ; Système d’anesthésie
MouseSTATKent ScientificPS1161Oxymètre de pouls & Cardiofréquencemètre
RasoirWahl9854L
StéréomicroscopeLeicaMZ6
Manche de scalpelOutils de sciences fines10003-12
Lames de scalpel - #11Outils de sciences fines10011-00
Pinces AdsonOutils de sciences fines11006-12Nécessaire pour décaper le périoste
Iris PinceOutils de sciences fines11066-07Utile (1x2 dents) pour causer des traumatismes musculaires/tissus mous localisés
Ciseaux de Bonn (droits)Outils de sciences fines14084-08Bon pour l’ostéotomie, note à changer régulièrement au fur et à mesure que cela devient émoussé
Ciseaux finsOutils de sciences fines14058-09Ciseaux tranchants pour couper les sutures
22G x 3.5 In Quincke  ; Aiguille vertébraleBD405181Utiliser une tige intérieure pour épingler
Porte-aiguillesOutils scientifiques fins12001-13
SutureLook1079B
C57BL6/JJackson Laboratory  ; stock n° 000664
eGFP+ (exprimant la protéine fluorescente verte améliorée de manière ubiquitaire)Jackson Laboratory  ; N° de stock 003291

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
  2. Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
  3. Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
  4. Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
  5. Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
  6. Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
  7. Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
  8. Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
  9. Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211(2016).
  10. Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
  11. Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
  12. Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131(2015).
  13. Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
  14. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90(2011).
  15. Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
  16. Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
  17. Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
  18. Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
  19. Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
  20. Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
  21. Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
  22. Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).
  23. Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
  24. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
  26. Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
  27. Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
  28. Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
  29. Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
  30. AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
  31. Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268(2016).
  32. Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
  33. Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346(2015).
  34. Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
  35. Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
  36. Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
  37. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
  38. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
  39. Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
  40. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
  41. Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
  42. Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).

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