Article de méthode

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

DOI :

10.3791/56736

⸱

26 février 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

Résumé

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Techniques d’étalement de la chromatine ont été largement utilisés pour évaluer la localisation dynamique de diverses protéines lors de la gamétogenèse, particulièrement pour la spermatogenèse. Ces techniques permettent pour la visualisation de protéines et de profils d’ADN localisation lors d’événements méiotiques comme les chromosomes homologues, appariement, Synapse et ADN de réparation. Tandis que quelques protocoles ont été décrits dans la littérature, les techniques d’étalement de chromatine générales à l’aide d’ovocytes chez les mammifères de la prophase sont limitées et difficiles en raison du calendrier de l’initiation de la méiose dans les ovaires foetaux. En comparaison, les spermatocytes de prophase peuvent être collectées de souris mâles juvéniles avec des rendements plus élevés sans nécessiter de microdissection. Toutefois, il est difficile d’obtenir une population pure synchronisée des cellules à des étapes spécifiques en raison de l’hétérogénéité des populations de cellules germinales méiotiques et après méiose dans les testicules juvéniles et adultes. Pour les étapes ultérieures de la méiose, il est avantageux d’évaluer en cours de la méiose I (MI) ou la méiose II (MII), parce que les groupes des ovocytes matures peuvent être prélevés dans des souris femelles adultes et stimulés pour reprendre la méiose dans la culture des ovocytes. Ici, méthodes pour les préparations de chromatine méiotique répartie à l’aide d’ovocytes disséqué de foetale, néonatale et ovaires adultes sont décrits avec des démonstrations vidéo d’accompagnement. Événements missegregation chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont fréquentes, en particulier au cours de la MI. Ces techniques permettent d’évaluer et de caractériser les effets de mutations différentes ou des expositions environnementales au cours des différentes étapes de l’ovogenèse. Qu’il sont a des différences distinctes entre l’ovogenèse et la spermatogenèse, les techniques décrites dans sont inestimables pour accroître notre compréhension de l’ovogenèse chez les mammifères et les fonctionnalités présente un dimorphisme sexuel de la dynamique du chromosome et protéines au cours de la méiose .

Introduction

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Au cours de la spermatogenèse, grosses vagues semi-synchrone des cellules germinales méiotiques sont rapidement et continuellement réapprovisionnés dans les testicules au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte1. Contrairement aux hommes, la méiose chez les femelles est initiée uniquement pendant le développement du foetus. Après la naissance, les ovocytes restent arrêtées dans un stade de dictyate prolongé de la prophase I avec une vésicule germinale intacte (GV ; enveloppe nucléaire) jusqu'à la puberté. Au début de la puberté, un sous-ensemble d’ovocytes sont cycliquement choisis pour subir la croissance et la maturation, marquant le début de reprise méiotique. Méiotique reprise dans les ovocytes adulte se manifeste par la disparition de la GV dans un processus appelé vésicule germinale ventilation (GVBD). L’ovocyte subit alors la condensation des chromosomes et ségrégation, suivi par extrusion de globule polaire. Les ovocytes deviennent arrêtés à progression au PPFI et sont stimulés pour compléter la deuxième et dernière division méiotique seulement après la fécondation.

La fertilité féminine est fortement tributaire de la réussite de la prophase méiotique j’ai progression. Clé c’est la formation d’une liaison physique entre les chromosomes homologues appelés les chiasmas, médiée par la réparation des induits ADN double brins (CDB) par l’intermédiaire de crossover recombinaison2. Ce processus se produit dans le cadre d’un échafaudage de riches en protéines dynamique appelé complexe synaptonémal (CS) qui se forme entre les chromosomes homologues afin de faciliter leur synapsis3. Le SC est une fermeture à glissière-comme structure tripartite qui se compose de deux éléments latéraux parallèles reliées par des protéines de la région du centre qui détient homologues ensemble tout au long de la réparation de l’ADN en cours. Avant synapsis, précurseurs des éléments latéraux, appelés éléments axiales, forment entre sœur chromatides. Complexe synaptonémal protéines telles que SYCP2 et SYCP3 forment des éléments axiaux qui sont colocalisées pour les axes de la cohésion des chromatides au cours du début de la prophase. Plus tard service accepteurs pour la protéine de filament transversal, SYCP1, ce qui facilite l’assemblage de l’élément central et synapsis entre homologues alignés4. Dans les ovocytes de souris, synapsis complet est indiqué par la présence de 20 complètement chevauchement des tronçons SYCP3 et SYCP1, qui peuvent être visualisées à l’aide de la chromatine propager des préparations. Synapsis est terminé dès l’entrée dans le sous-étage pachytène, par lequel des véhicules multisegments matures qui sont destinés à des chiasmas forme entre homologues sont décorées avec mutL dimères d’homologue (MLH1/3) pour promouvoir leur traitement exact5,6 , 7. l’entretien structurel des complexes de chromosomes (SMC), y compris cohesin, condensin et la SMC5/6 complexes, sont importants pour la régulation de la dynamique des chromosomes et la structure tout au long de la méiose8,9, 10,11,12. Collectivement, ces événements s’assurer bi-orientation correcte des chromosomes homologues à lutter contre les pôles du fuseau après démontage de la SC.

La méiose des cellules est un modèle puissant afin d’examiner les rôles de diverses protéines dans maintenance du génome en raison de l’induction programmée et la réparation ultérieure des ADN CDB. En outre, la méiose chez les mammifères est également un modèle pertinent pour l’étude des modifications épigénétiques et l’empreinte13. Toutefois, il est techniquement difficile d’évaluer ces événements au cours de la méiose femelle, qui se déroule dans les ovaires foetales et néonatales chez les mammifères (Figure 1). Je peux être divisé en 5 sous-stades la prophase : leptonema, du zygotène, pachytène, diplonema et dictyate. Ici, nous décrivons comment isoler et faire la distinction entre fœtales et néonatales des ovaires et des testicules (Figure 2). Adapté de méthodes précédemment décrites, ce manuscrit présente également un protocole (étape 1) avec la vidéo de démonstration pour la préparation de la prophase méiotique femelle je la chromatine propage14,15,16,17 . Lorsqu’il est couplé avec l’immunomarquage, tel que décrit dans les étapes 6 et 7, ce protocole permet une analyse microscopique détaillée de la prophase I événements dans les ovocytes.

L’ovogenèse est sujette aux erreurs et événements de missegregation de chromosomes au cours de la première division méiotique représentent la source la plus fréquente des maladies génétiques dans la descendance18,19. Dans ce manuscrit (étape 2 du protocole), les auteurs décrivent un protocole dans lequel des ovocytes matures étagée de GV sont extraites apprêtées ovaires de souris femelles adultes. Dans des conditions favorables, ovocytes adulte subissent une hormone lutéinisante indépendante reprise de la méiose suite d’isolement et la culture20. La reprise méiotique, ovocytes progressant grâce à la méiose I, puis arrêtent à la métaphase II. Ovocytes restent arrêtées lors de la métaphase II, sauf s’il est fécondé. Dans les étapes 2 à 5, nous adaptons protocoles rapportés antérieurement avec la vidéo de démonstration pour décrire comment collecter, culture et préparer la chromatine se propager préparations21ovocytes MI et MII. Cette chromatine diffusion technique permet clairement immunomarquage des protéines associées aux chromosomes. En outre, ce protocole permet également de distinguer les chromosomes bivalents et vaccin monovalents et peut encore résoudre seule sœur chromatides à faciliter l’appréciation de la ploïdie de l’ovocyte. Par conséquent, en plus de révéler des modèles de localisation des protéines méiotiques, ce protocole peut également servir un outil inestimable pour élucider les causes potentielles de missegregation de chromosomes au cours de la MI et MII.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins. Des expériences ont été effectuées sur des souris C57BL/6J de type sauvage.

1. récolte des ovaires foetales ou néonatales et préparation de la Prophase chromatine se propage

  1. Pour extraire les embryons à 14,5 – 19,5 jours post-coitum (dpc) sacrifier les femelles enceintes par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
    Remarque : Pour les ovaires de 1 à 5 jours après la naissance, passez à l’étape 1.3. La figure 1 résume les étapes de la prophase méiotique enrichis à différents âges embryonnaires et postnatals.
  2. Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faire une ouverture en forme de V. Disséquer sur la corne utérine maternelle, séparer les embryons de placenta et transfert des embryons dans 35 mm plats de Pétri contenant 3 mL de préchauffé 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) à 37 ° C.
    Remarque : Un incubateur fliptop fixé à 37 ° C peut être utilisé pour maintenir la température. En outre, un verre translucide de température régulée peut également servir pour maintenir la température au cours de la manipulation de l’ovaire.
  3. Avec des ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces, sacrifier des embryons ou des chiots par l’intermédiaire de décapitation selon les lignes directrices IACUC. Placer les embryons décapités ou petits dans du PBS préchauffé avant dissection plue.
  4. Disséquer un embryon ou un chiot à un moment dans un séparé 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C. Aller de l’avant en coupant le long de la ligne ventrale médiane de la moitié postérieure de l’embryon, le long de la moitié antérieure sous les pattes avant et directement au-dessus des membres postérieurs et queue comme indiqué dans la Figure 2 a–B.
  5. Ouvrir l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces. À l’aide de pinces à pointe fine de déplacer ou de supprimer le foie et les anses de l’intestin, exposant ainsi les ovaires dans un nouveau 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C (voir le guide Figure2 b). Les ovaires sont situés immédiatement en dessous et derrière le rein vers la paroi postérieure de la cavité péritonéale (Figure 2 b–C). Un guide pour différencier les gonades mâles et femelles est fourni à la Figure 2D.
    Remarque : Pour des conditions optimales, rapidement disséquer des ovaires après que femelle gravide est sacrifiée.
  6. Retirer les deux ovaires de chaque fœtus féminins à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine sous une étendue de la dissection et l’endroit dans un verres de montre ou puits séparés d’un puits multiples plaque contenant 0,5 à 1,0 mL de PBS préchauffé et maintiennent à 37 ° C.
  7. Placer chaque paire d’ovaires dans 0,5 mL de tampon hypo-extraction (17 mM citrate trisodique dihydraté, saccharose 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inhibiteur de la protéase, pH 8,2) dans un verre de montre propre ou un petit puits d’une plaque de 9 puits, en veillant à immerger la maquette des ovaires complè. Incuber pendant au moins 15 minutes, mais pas plus de 30 min.
    Remarque : Faire tampon hypo-extraction douce et utiliser moins de 2 h d’addition de TNT.
  8. Durant l’incubation, à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe, dessinez deux carrés de2 22 x 22 mm sur un verre propre 25 x 75 mm2, lame de microscope une épaisseur de 1 mm comme illustré à la Figure 3 a.
    NOTE : Diapositives peuvent être préparés en avance.
  9. Distribuer 45 – 50 µL de saccharose de 100 mM sur une lame propre et transférer une paire d’ovaires à la baisse.
  10. En utilisant les extrémités pointues des deux aiguilles 27 G, taquiner les ovaires part pour libérer les cellules dans la solution de saccharose. Avec une pince, enlevez les gros morceaux de l’ovaire et soigneusement Pipeter une solution de saccharose pour disperser les cellules.
  11. Place 40 µL de solution de fixation (paraformaldéhyde à 1 % (PFA), 0,2 % de détergent (voir Table des matières), pH 9,2) dans chaque carré de la diapositive préparée. Avec une pointe de pipette 200 µl, étendre la solution fixateur uniformément sur la surface de glissement.
  12. Pipeter 20 µL du mélange sur chaque carré de la diapositive contenant le fixateur saccharose.
    Remarque : Cela équivaut à utiliser une paire d’ovaires par lame.
  13. Incuber les lames dans une chambre humide fermée du jour au lendemain à la température ambiante.
    Remarque : L’incubation pendant la nuit peut varier autour (12-15 h) à la température ambiante.
  14. Ouvrez le couvercle de la chambre et laisser les lames sécher complètement à l’air.
  15. Les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,4 % (voir la Table des matières) pendant 2 min, sécher à l’air et procéder au protocole d’immunomarquage (étape 6).
    Remarque : Il peut être possible de stocker les lames à-80 ° C pour une utilisation ultérieure, mais cela varie en fonction de la protéine d’intérêt. Pour des résultats optimaux, procéder immédiatement au protocole immunomarquage (étape 6).

2. métaphase Je collecte des ovocytes

  1. Afin de maximiser le nombre de follicules antraux isolée de chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, également connu sous le nom équine gonadotrophine chorionique (eCG)).
    Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer la PMSG, dissoudre la bouteille de 5 000 UI dans 100 mL du PBS stérile (5 mL de U/0.1) grand magasin à usage unique aliquotes de 600 µL à-20 ° C.
  2. Après 44 – 48 h, préparer, média de collecte minimale indispensable moyen alpha (MEMα) additionné à 5 % sérum fœtal (SVF) et 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA ; MEMΑ/BSA/FBS). Stériliser les médias à travers un filtre de pores de 0,2 µm. Décanter 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS moyen dans un plat en verre par souris et chaud à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
    Remarque : Autres collection et milieux de culture qui sont commercialement disponibles (M2 et M16) sont aussi couramment utilisés.
    ATTENTION : Nous vous conseillons d’enlever Pétri de l’incubateur de2 CO 5 % un à la fois pour une durée limitée afin de minimiser l’exposition à l’air ambiant pendant les étapes de manipulation.
  3. Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
  4. Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine ; les ovaires sont présenter proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Continuez à tenir l’oviducte et une autre série de fines pinces libèrent l’ovaire de la bourse et la place dans plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS.
    Remarque : Comme à l’étape 1, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes.
  5. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 27 (ou de taille similaire), libérer des complexes ovocytes cumulus manuellement perforera les gros follicules antrums.
  6. Tout en observant à travers un microscope à dissection, recueillir les ovocytes GV-mise en scène en utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5). Ne recueillir que les ovocytes qui sont libérés des follicules antrums. Les ovocytes GV ont un diamètre d’environ 90 µm. les ovocytes GV peut être entourés par 2 ou 3 couches de cellules de la granulosa et ont un diamètre total de près de 200 µm.
  7. Culture des ovocytes dans un verre de montre propre ou une plaque de 9 puits contenant le support MEMα/BSA/FBS pendant 6 h atteindre la métaphase I, à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
  8. Passez à l’étape 4.

3. métaphase II (MII) ovocyte Collection

  1. Afin de maximiser les ovocytes prélevés chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de PMSG. Après 44 – 48 h, injecter par voie intrapéritonéale avec 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG).
    Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer le hCG, dissoudre une bouteille de 10 000 U dans 200 mL de PBS (5 mL de U/0.1). Enregistrez dans parties aliquotes à usage unique de 600 µL à-20 ° C.
  2. Après 12 à 14 heures, préparer le milieu MEMα/BSA/FBS de collection, comme indiqué au point 2.2, ci-dessus.
  3. Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
  4. Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine, les ovaires sont présents proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Puis enlever l’ovaire et l’oviducte et le placer dans le plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS.
    NOTE : Tout comme aux étapes 1 et 2, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes.
  5. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 27 G (ou taille similaire) ou dièse forceps, une brèche dans l’ampoule de l’oviducte de libérer les ovocytes MII.
    NOTE : Veillez à ne pas endommager les ovocytes dans l’ampoule. L’ampoule apparaît enflée et translucides tels que les ovocytes sont visibles (Figure 4).
  6. Récolte des ovocytes MII de l’ampoule de l’oviducte dans une autre boite avec support de collection utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5).
  7. Passez à l’étape 4.

4. ovocyte dépouillant et le retrait de la zone pellucide

  1. Préparer 300 UI/mL d’hyaluronidase dans additionné MEMα à 3 mg/mL de BSA à DDE ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus (2,5 mL/souris) dans un verre de montre et garder à 37 ° C, 5 % de CO2.
    Remarque : L’efficacité Hyaluronidase diminue brusquement après 1 h de préparation. Pour les ovocytes MII, traitement de l’hyaluronidase n’est pas exigé.
  2. Exposer des complexes de cellules de cumulus-ovocytes à 300 UI/mL d’hyaluronidase dans MEMα/BSA pendant 3 min à la DDE des ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus.
    ATTENTION : Ne dépassez pas 3 min exposition à hyaluronidase, car il endommagerait les ovocytes.
  3. Pour laver les ovocytes, transférez les ovocytes dans un plat de moyen MEMα/BSA chauffé fraîche. À l’aide d’une pipette en verre de commande bouche petite ou capillaire (légèrement plus grand que le diamètre de l’ovocyte, qui est environ 90 µm), déposer les complexes vers le haut et vers le bas pour détacher complètement les cellules du cumulus. Laissez les ovocytes à récupérer dans l’incubateur tout en préparant l’étape suivante.
  4. Solution acide Tyrode chaud, MEMα/BSA et médias de Waymouth à 37 ° C (500 µL/souris). Place 300 µL à chaque puits de plaques de verre de 9 puits petites.
  5. Pour supprimer la zone pellucide (ZP) transférer 5 à 10 ovocytes dans une solution de Tyrode. Exposer les ovocytes pour seulement 30-45 s à la solution.
    NOTE : Trop peu d’exposition à la solution ne supprime pas la ZP complètement, les ovocytes qui empêchera l’éclatement et de chromosomes de se propager. Une exposition excessive endommagerait et tuer l’ovocyte. Je regarde la dissolution du ZP sous le microscope à dissection peut aider dans l’optimisation du temps d’exposition.
    ATTENTION : À l’aide d’une solution de Tyrode frais est essentiel, que sa fonction diminue avec l’âge. Utiliser un puits frais de solution Tyrode pour chaque groupe d’ovocytes traitée pour assurer une digestion uniforme de la ZP.
  6. Immédiatement après le retrait de la ZP, laver les ovocytes en transférant dans un milieu MEMα/BSA/FBS chauffé. Répétez cette étape de lavage.
    Remarque : Soyez prudent lors du transfert, comme les ovocytes seront collent facilement et à la pipette en verre ou capillaire après le retrait de la ZP. Prémouillage la pipette en verre ou capillaire dans un milieu de Waymouth minimisera les ovocytes collées entre elles.
  7. Transfert et laisser les ovocytes à récupérer pendant 30 minutes dans un milieu de Waymouth à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
  8. Passez à l’étape 5.

5. MI et MII ovocyte chromatine tartinades

  1. À l’aide d’un stylo PAP, dessinez un rectangle de2 de 11 x 44 mm sur la lame de verre comme sur la Figure 6 a.
  2. Recouvrir la lame avec une fine couche de fixateur (paraformaldéhyde à 1 %, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9,2) par la pipette 100 µL de fixateur sur le toboggan et bascule la culasse en arrière. Cliquez sur la diapositive pour se débarrasser de l’excès fixateur.
  3. Faites glisser l’aiguille en ligne sur la diapositive de fixateur-enduit tout en déposant les ovocytes de 1 cm au-dessus de la lame dans la solution de fixation et relever entre 5 à 10 ovocytes avec une aiguille de pipette petite bouche avec comme support de peu que possible. Effectuez cette étape à l’aide d’un microscope à dissection pour s’assurer que les ovocytes ont été déposés et qu’ils ont fait irruption.
    Remarque : Les ovocytes éclatera immédiatement sur la diapositive. La hauteur à laquelle les ovocytes sont déposés incidence du degré de diffusion de chromatine. Voir résultats représentatifs dans la Figure 6 pour plus de détails.
  4. Incuber les lames dans une chambre humidifiée fermée pendant la nuit pour permettre à la chromatine d’adhérer à température ambiante.
  5. Laisser les lames à sécher complètement et rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de 0,4 % agent mouillant-H2O, pH 8,0.
  6. Passez à l’étape 6.

6. immunomarquage

  1. Préparer le tampon de dilution d’anticorps (ADB) décrit dans le tableau 1.
  2. Préparer deux Jarres Coplin contenant 50 mL de solution tampon (WB) de lavage (10 % ADB dilué dans du PBS) et une coloration contenant 50 mL de solution détergente WB et 0,05 % (par exemple, ajouter 250 µL de 10 % de détergent dans 50 mL WB).
  3. Laver les diapositives qui ont été établis à l’article 1 et 5 du présent Protocole pendant 10 min dans une coloration contenant 50 mL de WB.
    ATTENTION : Ne laissez pas les diapositives sécher à tout moment au cours de l’immunomarquage.
  4. Laver les lames pendant 10 min dans le Coplin jar contenant 50 mL WB et 0,05 % solution détergente. Ensuite, laver les lames dans le restant de Coplin contenant 50 mL de solution de WB pendant 10 min.
  5. Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains anticorps primaires dilué dans ADB. Incuber à 4 ° C durant la nuit dans une chambre humide fermée.
    Remarque : L’Incubation peut être abrégée en 2 à 3 heures à 37 ° C. Utiliser les petites quantités d’anticorps (par exemple, 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm.
  6. Rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.
  7. Répétez les étapes 6.2 et 6.5.
  8. Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains Anticorps secondaires dilué dans ADB. Incuber les lames 1 à 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide fermée.
  9. Les lames 2 fois pendant 10 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.
  10. Les lames 2 fois pendant 5 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-H2O de 0,2 %, pH 8,0.

7. montage diapositives

  1. Pour les tartinades de chromatine prophase préparés à l’étape 2, ajouter 100 µL de milieu de montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Pour MI et MII la chromatine propage préparés en étape 5, ajouter 50 µL de milieu de montage contenant DAPI (1.5µg / mL). Éponger doucement le liquide en excès à l’extérieur.
  2. Placez une lamelle de 22 mm x 60 mm sur le dessus et sceller avec du vernis à ongles transparent. Conserver dans une boîte de glissière à 4 ° C ou -20 ° C jusqu'à l’évaluation par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence.
    NOTE : Touchez légèrement sur la lamelle couvre-objet pour débarrasser du milieu de montage excédentaire avant scellement avec vernis à ongles.

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Résultats

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Nous avons décrit les deux techniques de visualisation et d’évaluer les chromosomes méiotiques dans les ovocytes. La première technique est pris en compte pour évaluer la progression de la prophase dans les ovaires embryonnaires et néonatales. La prophase chromatine propagation préparations sont extrêmement précieuses pour la visualisation de nombreux processus dynamiques au cours de la méiose, y compris les appariements, Synapse et désynapsis, la recombinaison homologue et remodelage épi...

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Discussion

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Préparations de propagation de la chromatine permettent aux chercheurs d’étudier par ordre chronologique la méiose mammifère femelle et la localisation dynamique des protéines impliquées. Les spreads de chromatine embryonnaires et néonatales permettent une analyse attentive des événements tout au long de la prophase méiotique. Métaphase I et métaphase II la chromatine se propage peut servir à distinguer l’unique sœur chromatides de jumelé de sœurs et paires de chromosomes homologues, ainsi qu’évaluer la ploïdie. Par comp...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à G.H. et J.H.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10X Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4Qualité Biologique119-069-161
Boîtes de Pétri de 60 mm x 15 mmDenvilleT1106
Boîtes de Pétri de 35 mm x 12 mmDenvilleT1103
Pince fineVWR300-050
Ciseaux de micro-dissectionTed Pella1340
Dissectionnement  ; ciseaux, pointe pointue, 41/2"VWR82027-578
Montre en verre carré 1 5/8Carolina Biological Supply Company742300Autoclave avant chaque utilisation
SaccharoseSigmaS8501
Citrate trisodique dihydratéSigmaS1804
EDTASigmaE6758
Trizma BaseSigmaT1503
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563Ajouter au tampon hypotonique immédiatement avant l’utilisation
50x Inhibiteur de protéaseRoche11873580001Ajouter au tampon hypotonique immédiatement avant utilisation
Seringue de turberculine avec aiguille (1cc, 27 G x 1/2 in)Becton, Dickinson (BD)309623
Lames en verre ultra givré Gold seal (25X75mm, 1mm d’épaisseur)Thermo3063-002
Stylo Super PAP, grand (bloqueur de liquide)Microscopie électronique Sciences (EMS)71310
16 % Paraformaldéhyde aqueuxMicroscopie électronique Sciences (EMS)15710
Triton X-100SigmaT8787Détergent en manuscrit
Chambre d’humidité Immuno tacheEvergreen240-9020-Z10
Bocaux CoplinFisher08-815
Photo-flo 200Sciences de microscopie électronique (EMS)74257Agent mouillant dans le manuscrit
Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)SigmaG4877Stocker les aliquotes à -20C
Gonadotrophine chorionique humaine (HCG)SigmaC0434Stocker les aliquotes à -20C
Plaques d’observation PYREX avec neuf cavités concavesFisher13-748BAutoclave avant chaque utilisation
Capillaire en verreFisher22260943Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Marque Parafilm MSigmaBR701501Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Tube en caoutchouc latex (3,2 mm de diamètre intérieur x 6,4 mm de diamètre extérieur)Fisher14-178-5BPour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Tube en caoutchouc latex (diamètre intérieur de 6,4 mm x diamètre extérieur de 11,1 mm)Fisher14-178-5DPour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Embout nasal en caoutchouc de silicone flexible, embout buccal en plastique dur et 15 pouces de tube en latexSigmaA5177-5EAPour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Tête micrométrique MitutoyoMituoyo150-208Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Seringue 5 mLBD Biosciences309646Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Filtre à seringue 0,45 &mu ; m filterCorning431220Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
Pipette Pasteur en verre 5 3/4"Fisher13-678-6APour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
83 x 0,5 mm Pointe de pipetteDenvilleP3080Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes
&alpha ;-MEMInvitrogen11415049
le supportde Waymouth Life Technologies
Sérum fœtal bovinFisherA3160602
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA3311Pour milieu de culture ovocytaire
500ml unités filtrantes 0.22umDenvilleF5227
HyaluronidaseSigmaH3506
Tyrode' s solutionSigmaT1788Stocker les aliquotes à -20C
Sérum de chevalSigmaH-1270Pour tampon ADB/lavage
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA1470Pour tampon ADB/lavage
VECTASHIELD Milieu de montage anti-décoloration avec DAPIVector LabsH-1200
Lames de couverture de microscope (22mmx60mm)Fisher12-544-G
Vernis à ongles transparentAmazonN/A
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Observer Z1Zeiss
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Anticorps primaires
Mouse anti-MLH1Life TechnologiesMA5-15431Facteur de dilution - 1:100
Rabbit anti-SYCP1Life TechnologiesPA1-16763Facteur de dilution - 1:1000
Chèvre anti-SCP3Santa Cruzsc-20845Facteur de dilution - 1:50
Protéine anti-centromère humaineAnticorps incorporés15-235Facteur de dilution - 1:100
Lapin anti- TOPOIIAbcamab109524Facteur de dilution - 1:100
Anti-histone H4 de souris (di méthyl K20, tri méthyle K20)Abcamab78517Facteur de dilution - 1:500
Rabbit anti-Rec8Avec l’aimable autorisation de Dr. Karen SchindlerN/AFacteur de dilution - 1:10 000
NameCompanyNuméro de catalogueComments
>Anticorps secondaires
Âne anti-chèvre IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjuguéThermo-Fisher ScientificA-11057Facteur de dilution- 1:500
Âne anti-souris IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjuguéThermo-Fisher ScientificA-21202 Facteur dedilution- 1:500
Âne anti-lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugué Thermo-FisherScientificA-31573Facteur de dilution- 1:500
IgG anti-souris de chèvre (H+L) Conjugué Alexa Fluor 568Thermo-Fisher ScientificA-11004Facteur de dilution - 1:500
IgG anti-humaine de chèvre (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA-11013Facteur de dilution - 1:500
IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Conjugué Alexa Fluor 568Thermo-Fisher ScientificA-11011Facteur de dilution - 1:500
11220035

Références

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Collecte d ovocytesprogression m iotiqueovocytes de sourislocalisation prot iquemorphologie chromosomiques gr gation des chromosomes m iotiquesappariement des chromosomes homologuesanalyse de la synapsevaluation de la r paration de l ADN

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