Article de méthode

Techniques chirurgicales pour le Placement de cathéter et néphrectomie 5/6 dans les modèles murins de la dialyse péritonéale

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DOI :

10.3791/56746

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19 juillet 2018

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology Research Centre Severo Ochoa, Spanish National Research Council, 2IdiPAZ Research Institute, La Paz University Hospital, 3Princesa Research Institute, La Princesa University Hospital

Dans cet article

Résumé

Cet article présente la méthode pour le placement chirurgical chez les souris d’un cathéter intrapéritonéal attaché à un port d’accès qui est placé à l’arrière de l’animal. En outre, il explique la procédure pour une néphrectomie 5/6 ressembler à l’État et urémique de patients Parkinsoniens.

Résumé

Dialyse péritonéale (DP) est une thérapie de remplacement rénale cohérente sur l’administration et le recouvrement postérieur d’un fluide hyperosmotique dans la cavité péritonéale pour drainer l’eau et toxique des métabolites qui reins fonctionnellement insuffisante ne sont pas en mesure de éliminer. Malheureusement, cette procédure détériore le péritoine. Lésions tissulaires déclenche l’apparition de l’inflammation pour guérir les blessures. Si la lésion persiste et l’inflammation devient chronique, elle peut conduire à la fibrose, qui est un phénomène courant dans de nombreuses maladies. Dans PD, une inflammation chronique et une fibrose, ainsi que d’autres traitements associés à celles-ci, conduire à la détérioration des capacités ultrafiltration, qui signifie l’échec et l’abandon subséquent de la technique. Travailler avec des échantillons humains fournit des informations sur cette détérioration mais présente des limites techniques et éthiques pour obtenir des biopsies. Modèles animaux sont essentiels pour étudier cette détérioration car ils combler ces lacunes.

A développé un modèle de perfusion de souris chronique en 2008, qui bénéficie de la large gamme de souris génétiquement modifiées, ouvrant la possibilité d’étudier les mécanismes impliqués. Ce modèle emploie un dispositif sur mesure conçu pour les souris, consistant en un cathéter fixé à un port d’accès qui est placé sous la peau à l’arrière de l’animal. Cette procédure évite continue perforation du péritoine au cours d’expériences à long terme, réduire l’infection et l’inflammation associées à des injections. Grâce à ce modèle, péritonéal dommages induits par une exposition chronique des fluide PD a été caractérisé et modulé. Cette technique permet l’injection de grandes quantités de fluides et pourrait être utilisée pour l’étude d’autres maladies où l’inoculation des drogues ou autres substances sur des périodes prolongées de temps est nécessaire.

Cet article présente la méthode pour le placement chirurgical du cathéter chez la souris. En outre, il explique la procédure pour une néphrectomie 5/6 imiter l’état d’insuffisance rénale dans les patients Parkinsoniens.

Introduction

Fonction rénale et la maladie rénale

Les reins sont des organes essentiels impliqués dans l’homéostasie, filtration du sang et la production d’hormones. Il y a différentes conditions qui conduisent à une insuffisance rénale et l’apparition subséquente d’urémie, qui a été défini comme le groupe de symptômes systémiques en raison de l’accumulation de déchets dans le sang conservé en raison de troubles rénaux fonction1. En outre, capacité homéostatique est également affectée lorsqu’il y a une insuffisance rénale, l’hypertension artérielle due à une surcharge volumique susceptible de se produire, qui est aussi dangereuse car elle peut conduire à une insuffisance cardiaque1. Lorsque la capacité fonctionnelle des reins est inférieure à 10 % - 15 %, le patient doit subir une des options thérapeutiques suivantes : hémodialyse, dialyse péritonéale (DP) ou la transplantation rénale.

PD est une option intéressante qui permet aux patients de continuer le traitement dans le confort de leur foyer ou pratiquement n’importe où, évitant ainsi la nécessité pour l’hôpital de fréquente visites et séjours. La technique de PD élimine les petites molécules toxiques et excès d’eau générée par le corps2 par le biais de l’instillation d’un fluide osmotique (liquide de dialyse péritonéale, PDF) dans la cavité péritonéale. Cette instillation génère le gradient osmotique nécessaire pour l’échange d’eau entre le capillaire péritonéale et PDF, un processus appelé ultrafiltration (UF) et les solutés.

Péritonéale lésions induites par la dialyse péritonéale

La cavité péritonéale est recouvert d’une membrane (PM), composée d’une monocouche de cellules mésothéliales reposant sur une matrice, qui abrite aussi quelques vaisseaux sanguins, des fibroblastes, des macrophages et des autres populations de cellules. Malheureusement, la membrane péritonéale souffre toujours quelques altérations au cours du traitement de PD, tels que l’apoptose et la perte de cellules mésothéliales, transition mésenchymateuse mésothéliales (MMT) et les cellules endothéliales (fin-MT), recrutement des cellules inflammatoires et des fibrocytes, des altérations vasculaires, angiogenèse, lymphangiogenèse et/ou fibrose3,4,5,6,7,8,9. Ces altérations sont responsables de l’élaboration d’un UF capacité échec10, qui s’oppose à la poursuite de la thérapie, qui exige que le patient doit recevoir un traitement alternatif pour survivre (hémodialyse ou transplantation rénale) . Par conséquent, pour ces patients, il est essentiel de retarder ou de contrôler le développement de ces altérations péritonéales.

Il a été spéculé que l’urémie seul peut causer une inflammation11, mais le plus important facteur local est PDF bioincompatibility. La plupart des PDFs utilisent le glucose comme l’agent osmotique, ce qui provoque une inflammation. En raison de la durée de conservation PDF et la stérilisation, glucose subit un processus de dégradation, et apparaissent de nouveaux produits de cette réaction, générant plus d’inflammation, le TEM et apoptose12,13. En outre, il y a aussi la possibilité de dommages mécaniques en raison de la méthode de l’instillation. Tous ces facteurs, agissant en permanence, peuvent générer un état inflammatoire persistant et récurrent, conduisant à une inflammation chronique, qui conduit à la détérioration de la membrane et, de façon concluante, échec de l’UF. Comment ce dommage pourrait être réduit ou évité est toujours un sujet d’étude.

Analyser le développement des lésions : des échantillons humains de modèles animaux

Travailler avec biopsies humaines est un facteur limitant en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus. Ces échantillons ne peuvent être obtenues de chirurgies effectuées en raison de dysfonctionnement du cathéter ou de la transplantation, généralement après des années de traitement PD. Cette approche est utile pour l’analyse des changements pathologiques subi par une membrane péritonéale exposée au format PDF, mais il n’est pas suffisante pour étudier le développement du processus. Une autre possibilité consiste à analyser les cellules drainées dans les effluents de la dialyse, mais cela ne fonctionne toujours pas fournir un scénario complet. La fusion de ces deux techniques n’est possible avec des modèles animaux. La structure péritonéale est similaire chez les mammifères, et donc il y a des modèles avec différentes espèces animales. Il existe quelques études issus des moutons (Rodela et al. 14 et Barrell et al. 15) et lapin16,17 modèles ; Toutefois, de petits animaux sont préférables car elles sont plus faciles à la maison et maintiennent et sont également plus économiques. L’utilisation de rats18,19,20,21,22,23,24 offre un temps de traitement plus court pour observer altérations Morpho-fonctionnelles. Il a représenté un modèle très utile pour étudier différentes questions telles que l’effet des médicaments anti-fibrosants comme, par exemple BMP-7 (morphogénique osseuse protéine-7)25 et RAS (système rénine-angiotensine) ciblant26,27 , 28.

Toutefois, le modèle murin est devenue un modèle idéal avec nombreux avantages sur les autres. L’avantage des plus intéressante est la possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés de souris pour étudier la base moléculaire et cellulaire des dommages péritonéale. En fait, les souris sont souvent employés pour l’analyse de nombreuses maladies, comme il existe de nombreuses souches différentes avec différents fonds génétiques connues. D’autres avantages incluent le réduit l’espace requis pour le logement, réduit le coût des expériences (en raison de la petite taille de l’animal), facilité de manipulation, la disponibilité des réactifs et le nombre croissant d’informations disponibles sur les différentes souches de souris depuis qu’ils ont été plus couramment utilisé des animaux en recherche.

Un modèle de souris qui emploient un implant a été le modèle le plus récemment créé pour PD29,30et a été montré pour imiter péritonéale détérioration subie par les patients Parkinsoniens dus à l’exposition au format PDF. Ce modèle a collaboré pour comprendre que les processus pathologiques impliqués31,32,,33. En outre, il a été utilisé pour valider les différents traitements possibles pour améliorer cette détérioration à l’aide de modulateurs immunitaires et anti-inflammatoires non stéroïdiens et autres anti-fibrosants et agents anti-angiogéniques, tels que les inhibiteurs de COX-2 (cyclo-oxygénase-2) 34, agonistes de PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ)35, tamoxifène36, Paricalcitol (un activateur du récepteur vitamine D qui module la réaction immunitaire)37,38 de la rapamycine et Nebivolol 39.

Élaboration d’un modèle souris avec un cathéter implanté

Ce modèle vise à ressembler, autant que possible, la technique utilisée chez des patients humains de PD, permettant d’effectuer des traitements prolongées de PD chez de petits animaux. Jusqu’ici, trois techniques pour l’instillation du liquide de dialyse dans le péritoine ont été testées chez des souris. L’une, aveugle perforation du front de la paroi abdominale, est controversé en raison des risques multiples qu’il peut encourir, tels que les dommages péritonéal, saignements et, comme c’est une ponction réalisée aveuglément, viscérale. La deuxième technique est le soi-disant « permanent système ouvert », dans lequel le dispositif d’injection du fluide est placé en dehors du corps. Cette procédure est plus similaire à celui effectué chez l’humain. Toutefois, il ne permet pas le développement d’expériences à long terme, car elle peut augmenter les risques d’infection et requiert généralement l’utilisation de l’anesthésie à instiller PDF, qui peut interférer avec les résultats. La troisième technique est le « système fermé ». Avec cette approche, l’ensemble du dispositif utilisé pour l’instillation fluide est situé à l’intérieur du corps de l’animal. Le liquide est injecté avec une aiguille dans un port d’accès, qui est placé sous la peau. Cette procédure réduit le risque d’infection péritonéale et saignements ainsi que la nécessité d’une anesthésie.

Pour étudier l’effet de l’urémie dans PD, un modèle murin récent a également été établi40 basé sur le modèle de perfusion de PDF avec le cathéter. Ce modèle apporte une nouvelle technique pour effectuer une néphrectomie chez la souris, ce qui réduit la fonction rénale. Dans le présent article, une modification du protocole employé par Ferrantelli et coll. en 201540 a été développée. Ce nouveau protocole permet l’implantation du cathéter en une néphrectomie, réduit la durée de la blessure infligée au cours de la chirurgie et facilite l’accès aux reins.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’utilisation de la biologie moléculaire Centre Severo Ochoa (Madrid, Espagne) et d’institutionnels animalier.

Remarque : Les souris C57BL/6J femelles âgés de 12 à 14 semaines et pesant environ 20 g au début de l’étude ont été utilisées. Tous les animaux étaient logés dans des conditions normales et ont reçu de nourriture et eau ad libitum. Conditions de police sanitaire ont été vérifiées quotidiennement. Le matériel requis, tels que gants, drapé, cathéter, suture et aiguilles, devrait être stérile.

1. Placer le cathéter

Remarque : Si les reins ne sont pas éliminés, ils restent complètement fonctionnels, donc il ne considère pas l’effet de l’urémie, permettant ainsi l’étude de l’exposition PDF en vase clos. La chirurgie consiste en présentant seulement l’extrémité distale du cathéter dans la cavité péritonéale et placer le port d’accès à l’arrière de l’animal, donnant accès à elle. La procédure de placer le cathéter est comme suit :

  1. Placez la souris dans une chambre à induction et fournir l’anesthésie à l’aide de 4 % isoflurane et oxygène avec un débit de 0,4 L/min jusqu'à ce que la perte du réflexe de redressement.
    1. Maintenir l’animal à l’isoflurane de 2 % à 100 % d’oxygène avec un débit de 0,3 L/min au moyen d’un tube de nez conique relié à l’appareil d’anesthésie. Confirmer anesthetization appropriée en évaluant le tonus musculaire et la réponse à la stimulation.
    2. Vérifier le taux et la profondeur de la respiration durant tout le processus. La pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie. Il est préférable que les procédures sont effectuées dans une enceinte à flux pour assurer le maintien de conditions stériles lors de chirurgies.
  2. Raser le flanc droit et le dos des animaux afin d’effectuer la chirurgie et plus tard d’injecter le liquide à l’orifice d’accès dans un endroit propre. Placer l’animal dans une position latérale reposant sur son flanc gauche dans la table d’opération chirurgicale, avec un système thermique pour s’assurer que sa température ne descend pas.
  3. Désinfecter la zone avec une solution de gluconate de chlorhexidine 1 %. Faire une petite incision (0,5 cm) avec des ciseaux émoussé dans la peau sur le flanc droit du corps et de le séparer soigneusement avec l’aide des ciseaux de la couche de muscles adjacents afin que toute la zone du dos de l’animal est bien séparée pour plus tard pouvoir introduire le port d’accès en toute simplicité. S’il vous plaît faire référence à la Figure 1 pour voir les matériaux nécessaires pour suivre la procédure.
  4. Faire une petite incision d’environ 1 mm de diamètre à travers la couche de muscle et insérer l’extrémité du cathéter et le premier anneau en plastique. Les dégâts péritonéale sont minime.
  5. Suture de la paroi péritonéale serré autour de la sonde, avec une suture non résorbable 5.0 ou 6.0. Un anneau en plastique est alors situé à l’intérieur de la cavité péritonéale et l’autre entre le muscle et la peau. Le cathéter est ainsi fixé pour empêcher le fluide de couler dans l’espace sous-cutané.
  6. Insérer le port d’accès dans l’espace sous-cutané vers la queue de la souris, sans la fixer à une position fixe sur la peau, car il peut provoquer des démangeaisons et les animaux peuvent rayer et peu leur peau.
  7. Refermer la plaie de la peau avec une suture non résorbable 5.0 ou 6.0. Retirer l’anesthésie par inhalation et laisser l’animal à reprendre conscience. N’abandonnez pas la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Lorsque complètement rétabli, les souris peuvent être retournée à la compagnie d’autres animaux.
    Remarque : Les expériences peuvent commencer après 4 à 7 jours de récupération post-opératoire.
  8. Fournir une analgésie en dissolvant 3 mL d’ibuprofène (20 mg/mL) dans 250 mL d’eau potable pour la journée de la chirurgie.
  9. Au cours de la période postopératoire, vérifier l’état de santé de l’animal tous les jours, vérifier qu’il n’y a pas de zones rougies sur la peau, les cheveux hérissés ou les blessures.
  10. Injecter le liquide en tenant l’animal (sans anesthésier il) par la queue et en saisissant le port d’accès avec une seule main et l’aiguille avec l’autre. Désinfecter la zone avec la solution de gluconate de chlorhexidine 1 % avant l’injection. Il est intéressant d’utiliser des aiguilles spéciales (aiguilles de Huber), qui sont biseautés pour partie au lieu de pierce le septum en silicone de la cœlio (Figure 1 a). Deux injections par jour pendant 40 jours suffisent pour observer des altérations péritonéales (Figure 3).
  11. Lors de la finition de l’expérience, euthanasier la souris par asphyxie de dioxyde de carbone ou de dislocation cervicale.

2. effectuer une néphrectomie 5/6 et placer le cathéter

Remarque : Il est possible de réaliser une néphrectomie 5/6, qui permet uniquement une fonction rénale résiduelle pour mieux ressembler à la situation dans les patients Parkinsoniens. Il faut dans ce cas, les échantillons de sérum pour analyser l’urée niveaux en extrayant 250 μL de sang par la veine faciale perforer, au moins une journée avant de commencer les interventions chirurgicales, au milieu du traitement et quand sacrifier les animaux. Il est préférable que les procédures sont effectuées dans une enceinte à flux pour assurer le maintien de conditions stériles lors de chirurgies.

  1. Anesthésier les souris par l’isoflurane comme étape 1.1.
  2. Fournir une analgésie avec 0,1 mg/kg de buprénorphine, injectée par voie sous-cutanée au niveau du cou de l’animal et en dissolvant 3 ml d’ibuprofène (20mg/ml) dans 250 ml d’eau potable pour la veille et le jour de la chirurgie.
  3. Rasez les latéraux et le dos des animaux afin d’effectuer les interventions chirurgicales et plus tard d’injecter le liquide à l’orifice d’accès dans un endroit propre.
  4. Effectuer une incision d’environ 0,5 cm de la peau, sur le côté gauche, à proximité des côtes, d’avoir un accès direct au rein gauche.
  5. Ouvrez une petite incision dans le muscle de prendre le rein gauche hors du péritoine, enlever la capsule et la glande surrénale. Pour enlever la capsule est nécessaire pour mieux contenir le rein en dehors de la cavité péritonéale.
  6. Graver et couper les extrémités du rein avec un cauterizer (voir la Figure 1 pour les matériaux nécessaires).
  7. Réintroduire le rein dans la cavité péritonéale et suturer les blessures à la peau et le muscle avec insoluble suture 5.0 ou 6.0.
  8. Le lendemain, complètement enlever le rein droit et insérer le cathéter en utilisant la même incision quant à enlever le rein. Encore une fois, anesthésier la souris à l’isoflurane et injecter par voie sous-cutanée de 0,1 mg/kg de buprénorphine juste avant l’intervention chirurgicale. Aussi dissoudre 3 ml d’ibuprofène (20mg/ml) dans 250 ml d’eau potable la veille et le jour de la chirurgie.
  9. Faire une incision dans la peau d’environ 0,5 cm et avec l’aide des ciseaux, détacher la peau à l’arrière de l’animal dans le muscle d’ouvrir l’espace où se situera le port d’accès.
  10. Effectuer une coupe dans le muscle (de 0,3 à 0,4 cm) de prendre le rein droit hors de la cavité péritonéale.
  11. Retirer la capsule et la glande surrénale à avoir un meilleur accès pour les reins. Ligaturer la veine rénale, l’artère et l’uretère avec suture non résorbable, 5.0 ou 6.0 et enlever le rein complètement.
  12. Suture de la plaie à le muscle péritonéale, introduction de l’extrémité du cathéter afin que le muscle doit rester entre les deux anneaux en plastique, comme expliqué précédemment (étape 1.5).
  13. Introduire le port d’accès dans l’espace sous-cutané et suture de la peau comme indiqué dans les étapes 1.6 et 1.7.
    Remarque : Souris devraient reposer pendant au moins 10 jours de ces chirurgies pour s’assurer que les blessures au muscle péritonéal sont complètement guéries et il n’y aura aucun fuite dans l’espace sous-cutané s’injecter le liquide. Injecter le liquide comme au point 1.10.
  14. Lors de la finition de l’expérience, euthanasier les animaux par asphyxie de dioxyde de carbone ou de dislocation cervicale.

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Résultats

La figure 1 montre tout le matériel nécessaire pour suivre les procédures décrites dans la section protocole. Pour cet exemple, les souris soumises ou non à une néphrectomie (8 animaux par groupe) (Figure 2) ont été exposés pendant 40 jours (deux injections par jour, attendre au moins 2 heures entre les deux) à un mélange de deux différents au format PDF, couramment utilisés dans la pratique clinique : EXTRANEAL (icodextrine basé...

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Discussion

Les premières données publiées analysant les altérations PD en utilisant une technique de « fermer le système » a été réalisées en 2009,29 . Ce système étroit signifie que l’ensemble du dispositif est situé à l’intérieur du corps et le liquide est injecté avec une aiguille dans un port d’accès. Le plus important problème technique dans des modèles animaux à long terme de perfusion fluide au moyen d’une sonde est la présence d’obstruction. Les options possibles sont à effectuer omentectomie ou ajou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Auteurs remercient Ferrantelli E. et G. Liappas pour leur soutien définissant le protocole néphrectomie 5/6, R. Sánchez-Díaz et P. Martín pour l’aide avec les évaluations de l’azote uréique et Hevia E. et F. Núñez pour l’aide avec soin de la souris. Ce travail a été soutenu par des subventions SAF2016-80648R de la « Ministerio de Economía y Competitividad » / Fondo Europeo de Desarrollo Regional (MINECO/FEDER) Manuel López-Cabrera et PI 15/00598 de Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS)-les fonds FEDER, à Abelardo Aguilera.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Minute Souris Port 4Français avec perles de rétention et trous transversauxTechnologies d’accèsMMP-4S-061108A
Posi-Grip Aiguilles à pointe de Huber calibre 25 ga. X 1/2&aigu ; &aigu ;   ;Technologies d’accèsPG25-500
Kit de Cautérisation Haute TempératureBovie18010-00
ForaneabbVie880393.4 HO
Suture non résorbable 6/0Laboratorio Agaró ;6121
Ciseaux  ;Fine Science Tools14079-10
pinceFine Science Tools11002-12
pinceFine Science Tools13002-10
Buprénorphine 0,3 mg/mlproduit pharmaceutique
cotons-tigesproduit pharmaceutique
Dalsy (Ibuprofène) 20mg/mL suspension buvableAbbVie  ; S.R.L.  ;Produit pharmaceutique

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Cavit p riton aletat ur miqueperfusion de liquidemodification g n tiquel sion tissulaire

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