In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

Résumé

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

Résumé

Cette technique combine fibre optique médiée par fluorescence enregistrements avec la livraison précise de reporters de gène recombinant virus adeno-associé basé. Cet nouvelle et facile à utiliser en vivo fluorescence surveillance système a été développé pour enregistrer le rythme transcriptionnel du gène de l’horloge, Cry1, dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de déplacer librement les souris. Pour ce faire, un journaliste de fluorescence de transcription Cry1 a été conçu et emballé en virus Adeno-associé. Purifié, concentré de virus a été injecté dans la SCN, suivie de l’introduction d’une fibre optique, qui a été ensuite fixée sur la surface du cerveau de la souris. Les animaux ont été retournés à leurs cages maison et jouir d’un délai de 1 mois de convalescence postopératoire assurer suffisamment expression du Rapporteur. Fluorescence a été enregistré puis en se déplaçant librement souris via un en vivo surveillance système qui a été construit dans notre établissement. Pour l' en vivo système d’enregistrement, un laser à 488 nm a été couplé avec un 1 × 4-séparateur de faisceau qui divise la lumière en quatre sorties d’excitation de laser de puissance égale. Cette configuration a permis d’enregistrer simultanément des quatre animaux. Chacun des signaux émis par fluorescence ont été recueillie via un tube photomultiplicateur et une carte d’acquisition de données. En revanche à la précédente bioluminescence in vivo horloge circadienne technique d’enregistrement, cette fluorescence in vivo système d’enregistrement permet l’enregistrement de l’expression génique horloge circadienne pendant le cycle de lumière.

Introduction

Chez les mammifères, le noyau suprachiasmatique (SCN) régit les rythme circadien de l’organisme entier pour coordonner la réponse de l’individu à exogène de changements environnementaux (p. ex., lumière, température, stress, etc.)¹. Composants d’horloge de base se composent de PAR1-3, 2-Cry1, horlogeet Bmal1et jouent un rôle central dans la régulation de l’horloge circadienne de chaque cellule. Chaque cellule dans le SCN contient l’activateur de la transcription, horloge/BMAL1, qui agit comme un hétérodimère pour induire l’expression de PER et CRY. Le PER / CRY complexe inhibe alors la fonct....

Protocole

Toutes les procédures dans le présent protocole ont été effectués avec l’approbation de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Institut National des Sciences biologiques, Pékin, conformément à la réglementation gouvernementale de la Chine.

1. construction du Reporter Cry1 Fluorescence

Remarque : Des études antérieures de rythme circadiens en utilisant le système de bioluminescence^2,12,13 fusible un promoteur circadiens avec une déstabilisation luciférase (dLuc) pour induire....

Résultats

Fluorescence journaliste Cry1 était Voir la Figure1 a. En utilisant l’approche détaillée ci-dessus, 500 nL du rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 a été injecté avec succès dans le SCN d’une souris adulte et exposé expression robuste de Vénus (Figure 1 b, 1C). Les signaux de fluorescence enregistrés dans des conditions de foncé/dark (DD) (Figure 2) et 12h / 12h .......

Discussion

Contrairement à l’ex vivo des méthodes, telles que la tranche culture^4,5, RT-PCR¹⁶et in situ hybridation¹⁷, qui exigent que les animaux soient tuées, l' in vivo enregistrement méthode permet chercheurs pour étudier l’expression des gènes circadiens chez un animal vivant. Ainsi, cette technologie offre la possibilité d’évaluer l’effet des différentes perturbations physiques (p. ex........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KOD Plus Neo	TOYOBO	KOD-401	Réactif
pVENUS-N1	addgene	#61854	Plasmide
pcDNA3.3_d2eGFP	addgene	#26821	Plasmide
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA	addgene	#20297	Plasmide
MluI	Thermo Scientific	FD0564	Réactif
EcoRI	Thermo Scientific	FD0274	Réactif
Gibson Assembly Mix	NEB	E2611s	Réactif
Lipofectamine 2000	Thermo Scientific	12566014
Réactif Seringue	Filtre EMD Millipore	SLHV033RS	0,45  ; et micro ; m  ;
Colonnes d’héparine	HiTrap gelifesciences	17-0406-01	1 mL  ;
Filtre centrifuge Amicon ultra-4	EMD Millipore	; UFC810024	100 000 MWCO
Nucléase benzonase	Sigma-Aldrich	E1014	Réactif
Désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D5670	Produire une solution fraîche pour chaque
appareil stéréotaxique de souris	en lot B& E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Équipement
pentobarbital	SigmaAldrich	#1507002
Réactif appareil stéréotaxique	souris B& E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Équipement
Solution de peroxyde d’hydrogène	SigmaAldrich	#216763
Réactif Fibre optique	Thorlabs	FT200EMT	0,39 NA et Oslash ; 200 et micro ;
Pompe à microseringue	Nanoliter 2000 Injecteur, WPI		Equipment
virole en céramique	Shanghai Fiblaser		230&thinsp ; &mu ; m D.I., 2,5 mm D.E.
Gene Observer	BiolinkÉquipement Optics

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