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Article de méthode

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

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DOI :

10.3791/56767

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11 avril 2018

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1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

Dans cet article

Résumé

Le protocole suivant est axé sur la mise en place d’une culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de patient (STS). Ce modèle pourrait nous aider à mieux comprendre la base moléculaire et le profil pharmacologique de ces tumeurs malignes rares et pourrait constituer un point de départ pour poursuivre les recherches visant à améliorer la gestion de STS.

Résumé

Sarcomes des tissus mous (STS) représentent un éventail de malignités hétérogènes avec un diagnostic difficile, classification et gestion. A ce jour, plus de 50 sous-types histologiques de ces rares tumeurs solides ont été identifiés. Ainsi, en raison de leur extraordinaire diversité et la faible incidence, notre compréhension de la biologie de ces tumeurs est encore limitée. Dérivé de patient cultures représentent la plate-forme idéale pour étudier la pharmacologie et physiopathologie de la STS. Nous avons donc développé un humain modèle préclinique de mailles à partir de spécimens de tumeur provenant de patients devant subir une résection chirurgicale. Patient provenant des cultures de cellules STS ont été obtenues à partir de spécimens chirurgicales par digestion de collagénase et isolés par filtration. Cellules ont été comptés, épépinées et laissés pendant 14 jours dans des cultures monocouches standard et ensuite traitées par analyse en aval. Avant de procéder à des analyses moléculaires ou pharmaceutiques, la mise en place de cultures primaires STS a été confirmée par le biais de l’évaluation des caractéristiques cytomorphologic et, lorsque disponibles, les marqueurs immunohistochimiques. Cette méthode représente un outil utile 1) afin d’étudier l’histoire naturelle de ces tumeurs malignes mal explorées et 2) pour tester les effets des différentes drogues dans le but de mieux connaître leurs mécanismes d’action.

Introduction

Sarcomes des tissus mous (STS) incluent un éventail de lésions hétérogènes de la comptabilité d’origine mésenchymateuse à 1 % de toutes les tumeurs solides1,2, et la nouvelle classification de l’Organisation mondiale de la santé reconnaît la présence de plus de 50 3de différents sous-types. Parmi ceux-ci, les plus courantes histotypes sont sarcome d’adipocytes ou liposarcome et leiomyosarcomes, représentant 15 % et 11 % de toutes les mailles adultes, respectivement4,5. Bien que STS peuvent développer dans différentes parties du corps, les extrémités et rétropéritoine sont les sites les plus communs, qui se produisent dans les 60 % et 20 % des cas, respectivement de6.

La pierre angulaire du traitement pour maladie localisée est la résection chirurgicale large, tandis que les avantages de la chimiothérapie adjuvante et néoadjuvante sont encore peu clairs et ne sont considérées que dans certains cas7. Dans le cadre métastatique, une chimiothérapie est la norme de diligence mais montre des résultats limités,8. Une meilleure compréhension de la biologie moléculaire des STS contribuerait à améliorer le diagnostic différentiel actuel, d’optimiser les traitements disponibles et identifier de nouvelles cibles pour la thérapie.

Dans ce contexte, la recherche sur le cancer a été exécutée pendant de nombreuses années, l’utilisation de lignées cellulaires immortalisées9. Ces modèles expérimentaux sont normalement cultivés en monocouche standard prend en charge ou implantés dans immunodéficientes rongeurs d’établir en vivo xénogreffe modèles10. Lignées cellulaires immortalisées représentent un matériau facile à gérer et facile-à-store avec qui un grand nombre des expériences de recherche peut être effectué. Ils sont, en fait, le moins cher et plus couramment outil dans les études précliniques11.

Cependant, modèles de cancer lignée cellulaire basée ont également certaines limites, par exemple prolongé la culture dans un système monocouche avec un nombre croissant de passages induit phénotypique et dérive génétique, fabrication de cellules moins probablement pour récapituler les principales tumeurs caractéristiques. En outre, les cultures de cellules ligne ne parviennent pas à reproduire l’interaction cellule-cellule et la signalisation diaphonie de molécule qui imitent le comportement biologique des tumeurs et de caractériser le microenvironnement tumoral. Ces questions forment la base de l’écart existant entre les résultats cliniques et précliniques12.

Compte tenu de ce qui précède, l’intérêt dans les cultures primaires dérivés de patients a augmenté de13. En effet, l’excision des tissus normales et malignes réduit le risque de perdre le phénotype cellulaire du cancer et l’hétérogénéité, offrant ainsi une matière première qui est plus représentatif du microenvironnement tumoral. En outre, l’utilisation des échantillons de tumeur fraîches récoltées dans les patients subissant une résection chirurgicale permet d’enquêter sur les tumeurs unique et de comparer différentes lésions de la même partie d’un patient corps14. Pour les motifs qui précèdent, les cultures de cellules provenant de tissus fournissent une matière précieuse pour étudier les tumeurs physiopathologie et pharmacologie15,16,17, notamment en STS dans des lignées cellulaires qui disponible dans le commerce de sarcome sont limitées18. Nous avons ainsi optimisé une méthode pour établir une culture de cellules primaires de STS dérivé de patient à partir de tissu de tumeur excisées chirurgicalement13,19,20. Notre méthode consiste à la désagrégation de l’échantillon de la tumeur en petits fragments tissulaires suivies d’une nuit ou plus dissociation enzymatique de tissu pour obtenir une suspension de cellules du même. Le lendemain, la digestion enzymatique est arrêtée en ajoutant les frais des milieux de culture et de la suspension obtenue est filtrée pour enlever des fragments tissulaires, cellule-agrégats et excès de matrice ou débris. Enfin, une fraction des cellules tumorales isolées est cytospinned sur lames de verre, fixé et stockés pour analyse en aval visée à confirmer la création de STS culture primaire de cytomorphologiques, immunohistochimiques et évaluation cytogénétique moléculaire (p. ex. analyse de poissons d’amplification de MDM2 représente le diagnostic différentiel standard pour un liposarcome bien différencié et le liposarcome dédifférenciée) 4. les cellules restantes sont ensemencées dans une culture monocouche standard pour les études de profilage et pharmacologiques d’expression des gènes. Toutes les expériences sont effectuées à l’aide de faible passage cultures primaires afin d’éviter la sélection de cancer spécifique sous-clones et analysés par un pathologiste expérimenté sarcome. Nous avons donc créé un entièrement humain m ex vivo modèle13,19,20. Cette très polyvalent, facile à poignée modèle pourrait constituer un outil utile pour différents types de recherche préclinique, par exemple pour identifier de nouveaux marqueurs moléculaires pour le diagnostic et le pronostic ou pour acquérir une meilleure compréhension de l’activité et les mécanismes de action de standards et les nouveaux médicaments utilisés dans le traitement des mailles.

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Protocole

STS cellules sont isolées d’une tumeur masse chirurgicalement excisée de patients atteints de STS. Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique Local et s’effectue selon des lignes directrices de bonnes pratiques cliniques et la déclaration d’Helsinki. Tous les patients ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Les spécimens chirurgicaux sont analysées par un pathologiste expérimenté sarcome et traitées dans un délai de 3 heures de chirurgie.

1. tumeur prélèvement et traitement :

  1. Prélever les échantillons de tumeur à l’aide d’un pathologiste de sarcome dans un contenant d’urine stérile de 100 mL avec 50 mL de milieu de faible concentration de glucose DMEM scellé avec un film de paraffine.
  2. Stocker les échantillons à 4 ° C pendant un maximum de 3 h après résection de la tumeur.
  3. Effectuer toutes les étapes suivantes sous hotte stérile de vitroplants.
    1. Stériliser le capot avec l’éthanol à 70 % et porter des gants stériles.
    2. Stériliser les pinces en acier inox avec l’éthanol à 70 % (utiliser une gaze stérile).
    3. Retirez le film de paraffine du bac à urine et jeter.
    4. Laver l’extérieur du conteneur urine avec l’éthanol à 70 %.
    5. Ouvrir une boîte de Pétri carrée.
    6. Ouvrez le conteneur de l’urine et transférer les échantillons de tumeur dans la boîte de Pétri carrée à l’aide de la pince à épiler stérilisée en acier inox.
  4. Laver les spécimens de tumeur avec du PBS.
  5. Ouvrir un bistouri stérile.
    1. Râpez finement les spécimens de la tumeur en morceaux3 1-2 mm.
    2. Recueillir un quart de l’ensemble de l’échantillon dans un tube de 2 mL.
    3. Ajouter 1 mL de réactif de trizol (acheté) dans le tube et immédiatement congeler à-80 ° C (l’échantillon qui servira à l’analyse en aval pour l’évaluation de l’expression génique de STS).
  6. Recueillir le reste de la matière de tumeur finement râpé dans un tube de 15 mL.
    1. Ajouter 4 mL de collagénase de type I solution (type de collagénase j’est dissous dans du PBS, à une concentration de 4 µg/mL).
    2. Diluer la collagénase de type I solution avec 4 mL de milieux de culture haute DMEM (concentration finale de type collagénase I est de 2 µg/mL).
    3. Fermer le tube de 15 mL et sceller avec le film de paraffine.
    4. Mettre le tube de 15 mL dans un shaker roulant dans un incubateur à 37 ° C dans des conditions en remuant pendant 15 min activer la digestion.
    5. Après 15 min ranger le tube dans le shaker roulant sous remuant conditions à température ambiante pendant la nuit.
  7. Le lendemain mettre le tube de 15 mL sous la hotte stérile.
  8. Filtrer doucement la suspension de cellules à travers un filtre stérile de 100µm, fixé sur le haut d’un tube de 50 mL.
  9. Lavez le filtre avec les milieux de culture haute DMEM, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, de glutamine 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
  10. Jetez le filtre stérile de 100 µm, fermer le tube de 50 mL et centrifuger à 225 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
  11. Jeter le surnageant en renversant le tube.
  12. Remettre en suspension les cellules avec 1 à 2 mL DMEM haute culture media additionné de sérum de veau fœtal 10 %, de glutamine 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
    Remarque : Le volume dépend de la quantité d’échantillon de tumeur traitée.
  13. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer.
    1. Diluer l’échantillon 1:2 dans le bleu trypan et 10 µL de la dilution permet de compter les cellules.
    2. Comptez au moins deux fois et calculer la moyenne des répliques de connaître le nombre moyen de cellules recueillies.
  14. Cellules de la plaque dans une culture monocouche standard à une densité de 80 000 cellules/cm2.
    Remarque : Toujours inclure des contrôles dans des expériences. Effectuer au moins 3 répétitions techniques pour chaque condition. Effectuez au moins 2 réplicats biologiques. Pour la pharmacologie préclinique, l’expression des gènes et analyses d’expression de protéine, expériences procéder avec un faible nombre de passages de la culture dans les 30 à 45 jours de cellule semis pour éviter de perdre des phénotypes cellulaires du cancer.
  15. Préparation des échantillons cytologiques.
    1. Recueillir 100 000 cellules dans 200 µL de milieux de culture haute DMEM, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, de glutamine 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
    2. Pipette de la solution (pipette de 200 µL) dans un entonnoir jetable équipé d’un filtre et monté avec une lame de verre.
    3. Ouvrez le cytocentrifuge et insérez les échantillons.
    4. Exécutez le cytocentrifuge à 18,6 x g pendant 20 min.
    5. Jeter l’entonnoir équipé du filtre.
    6. Fixer les lames dans l’acétone pendant 10 min, suivie de chloroforme pendant 5 min.
    7. Stocker les lames à-20 ° C.
      Remarque : Décongeler et hydrater les échantillons avant la coloration et effectuer la coloration, suivant les instructions du fabricant. Préparer au moins 3 répétitions techniques.

2. Cultures de cellules de m :

  1. Modifier les médias une fois par semaine (DMEM haute culture media additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % de glutamine et 1 % la pénicilline/streptomycine).
    1. Jeter le milieu de culture à l’aide d’une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter nouveau milieu frais à l’aide d’une pipette de 200-1 000 µL.
    3. Passage de la cellule :
      1. Détacher les cellules lorsque la confluence est d’environ 90 % :
        Remarque : STS amplification de culture cellulaire doit être effectuée une fois par semaine en fonction des conditions de culture.
      2. Moyen de jeter, laver avec du PBS et ajouter 2 à 3 mL de trypsine 1 x dans du PBS
        Remarque : Le volume de la trypsine utilisé dépend de la quantité de cellules cultivées obtenus.
      3. Incuber les cellules pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
      4. Prélever des cellules individuelles de la plaque à l’aide d’une pipette de 200-1 000 µL.
      5. Pipetter les cellules individuelles dans un tube de 15 mL et ajouter 4 mL de milieux de culture haute DMEM, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, de glutamine 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine pour arrêter la réaction enzymatique.
      6. Centrifuger à 225 g pendant 5 min à température ambiante.
      7. Jeter le surnageant.
      8. Resuspendre le culot cellulaire en ajoutant 1 mL de milieux de culture haute DMEM, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, de glutamine 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
      9. Les cellules dans un ballon avec un volume final selon les instructions du fabricant ou une nouvelle plaque de culture des graines.
        Remarque : Pas divisé en cellules de plus de 1:3.

3. en aval Analyses :

Remarque : Une variété d’expériences différentes peut être effectuée à l’aide de ce modèle (voir ci-dessous). Il est donc crucial de décider au cours de la phase de conception de l’étude qui analyse sera effectuée afin qu’un nombre suffisant d’échantillons et les répétitions peut être préparé.

  1. Tests de prolifération comme 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MTT
  2. Des tests d’apoptose comme transférase terminale de deoxynucleotidyl (TdT) nick end labeling essai (TUNEL)
  3. Analyse immunohistochimique
  4. Analyse de l’expression génique
  5. Analyse par Western blot
  6. Analyse d’ELISA
  7. Fluorescence-lancée de cellules tri analyse (FACS)
  8. Modèle de xénogreffe de in vivo

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Résultats

Nous avons conçu une méthode simple pour obtenir la mise en place d’une culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de patient et signaler ici un exemple des résultats obtenus sur un histotype spécifique de m13. Le protocole a été utilisé pour la mise en place de cultures primaires de différentes mailles histotypes y compris liposarcome bien différencié, dédifférenciées production liposarcome, liposarcome, myxofibrosarcoma, indifférencié, liposarcome pléomor...

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Discussion

Les modèles précliniques bien définis sont nécessaires pour élucider le fond moléculaire des tumeurs, prédire le pronostic et élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer. Ceci est particulièrement important pour des tumeurs rares tels que STS dont forte hétérogénéité en termes de morphologie, un comportement agressif, clinique et potentiel défis notre compréhension de la biologie de STS et de gestion des patients21. Par ailleurs, les quelques lignées de cel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Gráinne Tierney pour aide à la rédaction.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM High GlucoseEuroCloneECB7501L
Sérum fœtal bovinEuroCloneECS0180D
GlutamineGibco25030-024
Paraformaldéhyde 4 % solution aqueuse, grade EMMicroscopie électronique Sciences157-4-100
Pénicilline streptomycineGibco15140122
Réactif de triazoleAmbion Life-Technologies15596018
TrypsinEuroCloneECB3052D

Références

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).

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