Nous avons généré avec succès deux essais de substrat spécifique γ-sécrétase. Les deux analyses cellulaires présentés ici visent à quantifier les activités enzymatiques de la γ-secretase via la sortie de reporters luciférase firefly.
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Article de méthode
Mesure quantitative de la protéine précurseur de l’amyloïde véhiculée par γ-sécrétase et Notch clivage dans Cell-based Luciferase Reporter Assay plates-formes
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous avons mis au point une paire de reporter sur les cellules des épreuves de gène pour mesurer quantitativement la γ-secretase clivage des substrats distincts. Ce manuscrit décrit les procédures qui peuvent être utilisés pour surveiller le clivage γ-sécrétase-mediated de APP-C99 ou Notch, utilisant un système de Gal4 firefly pilotée par le promoteur luciferase reporter. Ces tests ont été établies par stablement co transfectants cellules HEK293 avec le gène rapporteur luciférase axée sur la famille Gal4 et soit le fragment de Gal4/VP16-tag C-terminale de l’APP (APP-C99 ; Cellules CG), ou le tag Gal4/VP16 cran-ΔE (NΔE ; Cellules NG). À l’aide de ces tests de journaliste en parallèle, nous avons démontré qu’un inhibiteur de l’ErbB2, CL-387 785, préférentiellement pour supprimer le clivage γ-sécrétase des APP-C99 dans les cellules CG, mais pas NΔE dans les cellules de NG. Les réponses différentielles exposées par les cellules de la CG et NG, avec CL-387 785, représentent une caractéristique préférée pour modulateurs de la γ-secretase, et ces réponses sont en contraste frappant avec le pan-inhibition de la γ-secretase induite par DAPT. Nos études fournissent des preuves directes que les activités de γ-sécrétase vers différents substrats peuvent être différenciées dans un contexte cellulaire. Ces nouveaux tests peuvent donc être des outils utiles à la découverte de médicaments pour l’amélioration des traitements AD.
Introduction
Les formes oligomères de β amyloïde (Aß) sont censés être la cause principale de la neurodégénérescence dans le cerveau des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (ma)1. Les peptides bêta-amyloïdes sont produites par le clivage progressif de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), tout d’abord par la β-secretase, puis par γ-sécrétase2. Au cours de la dernière décennie, des approches thérapeutiques vers un traitement d’AD ont mis l’accent sur la prévention de la production de bêta-amyloïdes3. La majorité des études ont porté sur soit l’augmentation de l’activité α-secretase, ce qui peut empêcher la γ-secretase clivage de l’APP et ainsi diminuer la production de bêta-amyloïdes ou l’inhibition de la β-et/ou γ-sécrétase activités4. Malheureusement, l’inhibition non-sélective de β - ou γ-secrétases entraîne des effets secondaires inévitables qui sont en raison de l’interférence avec le fonctionnement d’autres substrats physiologiques de β - et γ-sécrétase5,6. En ce qui concerne les inhibiteurs de la γ-secretase, des études récentes ont signalé la découverte d’un certain nombre de modulateurs chimiques et génétiques qui peuvent réglementer la production de bêta-amyloïdes tout en exerçant des effets négligeables sur la transformation de γ-sécrétase-mediated essentielle des encoche7 ,8,9,10,11,12, cependant, succès thérapeutiques n’ont pas encore été développé. Ainsi, plus systématiques écrans sont garantis pour découvrir de nouveaux modificateurs génétiques et chimiques qui pourraient moduler sélectivement le traitement d’APP véhiculée par γ-sécrétase.
Γ-sécrétase est connue en conjonction avec plus de 90 différentes protéines ancrées à la membrane. Parmi ces substrats est ordre, dont l’activité est essentielle pour déterminer le destin cellulaire et différenciation au cours du développement,13. Modulant sélectivement catalysée par γ-sécrétase APP traitement en l’absence d’affecter le cran traitement seront essentiel pour minimiser Notch-effets secondaires des inhibiteurs de la γ-secretase, et cette sélectivité est considérée comme des principaux facteurs qui seront dicter l’efficacité biologique de modulateurs de γ-sécrétase potentiels pour le traitement chronique de AD. Il y a eu un certain nombre de dérivés arylsulfonamide, tels que GSI-953 (begacestat) et le BMS-708163 (avagacestat), qui ont été affectés présentent une inhibition puissante et sélective de la γ-sécrétase14,15. Une étude antérieure a montré que l’inhibition différentielle de γ-sécrétase clivage de l’APP et l’encoche peut être observée à l’aide d’un test quantitatif par ELISA en combinaison avec validation en vivo à l’aide de poisson-zèbre,16. En outre, paradigmes de test basés sur les cellules ont été établis pour traiter la sélectivité de substrat potentiels de la γ-secretase vers APP et Notch17,18. À l’aide des protocoles similaires à celles décrites dans les présentes, nous avons récemment découvert une nouvelle classe de (D)-leucinamides qui modulent puissamment γ-sécrétase clivage de l’APP avec encoche d’épargne sélectivité19. Ensemble, ce recueil d’études fournit une preuve de concept soutenant l’idée que la sélectivité/disponibilité des substrats de la γ-secretase peut être soumis à la modulation chimique et vérification expérimentale. Toutefois, ces plates-formes de dosage dépendent souvent relativement faible débit lectures et approches à forte main-d'oeuvre qui pourraient respectent pas les normes industrielles pour les programmes de recherche.
Nous avons généré récemment dosages de gène de journaliste luciférase à base de cellules qui peuvent de déterminer quantitativement l’activité catalytique de la γ-secretase vers deux substrats distincts, le fragment de C-terminal acid amino-99 d’APP (APP-C99) et l’extracellulaire domaine-supprimé un peptide Notch (NΔE). Les APP-C99 et NΔE ont été couramment comme substrats directes de la γ-secretase lors d’essais différents. Pour générer des essais de gène journaliste luciférase homogène et cohérente pour le clivage de la γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, nous avons généré une ligne de cellule stables dérivés HEK (CG) qui exprime constitutivement une Gal4 pilotée par le promoteur firefly luciferase reporter ( GAL4-Luc) et la protéine de fusion de Gal4/VP16-tag APP-C99 (C99-GV). En outre, nous avons généré une autre ligne de cellule stables dérivés HEK (NG) qui exprime constitutivement Gal4-Luc et Gal4/VP16-le tag NΔE (NΔE-GV). À l’aide de ces tests de nouveaux substrats spécifiques γ-secretase, nous fournissons maintenant une méthode permettant de quantifier et de distinguer l’activité catalytique de la γ-secretase vers différents substrats (APP-C99 dans les cellules CG), ou NΔE dans les cellules de NG. En outre, les dosages de substrat spécifique γ-sécrétase visaient à être propice aux plates-formes de criblage de haute teneur. Ces tests nouvellement généré γ-sécrétase pourraient ouvrir la voie à la découverte de nouveaux γ-sécrétase modulateurs susceptibles d’améliorer la fonction cognitive de supprimer la production de bêta-amyloïdes sans suscitant indésirable inhibition de cran pour le traitement de la nouvelle génération de AD.
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Protocole
1. mesure des signaux rapporteur luciférase qui Correspond au clivage de la γ-sécrétase des APP-C99 ou NΔE
Remarque : Veuillez consulter les publications précédentes pour obtenir une description détaillée de la génération de CG et NG cellules20,21.
-
Graines de cellules NG ou CG (20, 000 cellules/puits) sur Microplaque 96 puits à un volume final de 200 μL/puits dans le milieu qui est composé de Eagle modifié (DMEM) majoré de 10 % bovin sérum fœtal de Dulbecco (SVF), 5 μg/mL blasticidine, 250 antibiotique μg/mL (par exemple zeocin) et 200 μg/mL hygromycine B.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre.
- Transférer les microplaques dans une étuve à2 CO humidifiée et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Retirer 100 μl de milieu de croissance de chaque puits.
- Ajouter 100 μL/puits de croissance moyenne contenant 2 tétracycline μg/mL avec soit 0,2 % du diméthylsulfoxyde (DMSO), 2 μM CL-387 785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) ou autres connexes ErbB1/ErbB2 inhibiteurs.
- Incuber les cellules traitées de CG ou NG en microplaques à 37 ° C pendant 24 h.
- Retirer 150 μL/puits milieu de microplaques.
- Ajouter 50 μL/puits luciférase test réactif (voir Table des matières).
-
Transférer les microplaques à un lecteur de microplaques de luminescence.
- Maintenir les plaques de microtitration à température ambiante pendant 5 min avec agitation douce.
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Déterminer la luciférase Firefly (FL)-émis luminescence en utilisant un programme prédéfini stocké dans le lecteur de microplaques de luminescence.
- Ouvrez le logiciel de contrôle d’instrument (voir Table des matières pour plus d’informations de l’instrument).
- Dans le menu « Tool », sélectionnez « Luminometry ».
- Avec les paramètres « Paramètres », choisissez « Sans filtre » pour filtre d’émission, cochez « Normal » pour ouverture d’émission, inscrivez « 1 » pour les temps de comptage et cliquez sur « OK » pour mettre en place la lecture de la luminescence.
- Sous l’onglet « Contrôle d’instruments », faites défiler la liste des protocoles actifs, puis sélectionnez le protocole pré-enregistrée pour la lecture de luminescence.
- Sous l’onglet « Affichage en direct », définir l’échelle de la liste du menu déroulant et sélectionnez « Logarithme » ou « Linéaire » pour le Type.
- Sous l’onglet « Température », sélectionnez « Off » pour le chauffage de la plaque.
- Cliquez sur le bouton « Démarrer » pour effectuer la luminescence de lecture.
- Au besoin, exporter les résultats dans un format de feuille de calcul à l’aide de le « Explorer » intégrée dans le logiciel de contrôle.
2. quantification de l’activité de la γ-Secretase
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Définir un avertisseur de luminescence de CG ou cellules NG traitées avec 0,1 % DMSO en milieu de culture contenant 1 tétracycline μg/mL seul en tant qu’activité de γ-sécrétase relative de 100 %.
- Estimer la luminescence d’arrière-plan des cellules CG ou NG en traitant les cellules avec le milieu de croissance qui n’inclut pas de tétracycline.
- Normaliser les signaux de la luciférase de CG ou NG des cellules qui sont cultivées avec milieu de culture contenant 1 tétracycline μg/mL et soit 1 μM CL-387 785 ou 1 μM de DAPT avec le signal de la luciférase émis par CG imprégnées de DMSO ou NG cellules (activité γ-sécrétase relative de 100 %, comme définies en 2.1).
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Résultats
Inhibition de ErbB2 par CL-387 785 peut promouvoir différentiellement le traitement des APP-C99 par Γ -sécrétase sans affecter le clivage de l’encoche
Pour établir un test cellulaire qui permet de mesurer quantitativement le clivage protéolytique d’un substrat particulier γ-secretase, nous avons généré la lignée de cellules HEK293 dérivés CG par transfection stable de co d’une tétracycline-inducible terminalement Gal4/VP16-tag APP-C99 ...
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Discussion
Des résultats prometteurs d’un essai de phase 1 b sur de l’immunothérapie aducanumab AD ont fermement établi le rôle essentiel des bêta-amyloïdes dans la pathogenèse des AD22 et suggèrent que les approches anti-bêta-amyloïdes sont toujours une stratégie viable pour le développement de médicaments anti-AD. Nous décrivons ici les analyses cellulaires pour quantifier la protéolyse catalysée par γ-sécrétase des APP-C99 et NΔE à l’aide de systèmes de rapporteur luciférase firefly. APP-C99 et NΔE sont l...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient le laboratoire central de l’Institut de cellulaire et la biologie organismique, l’Academia Sinica, pour le support technique. Cette étude a été financée par le ministère de la Science et technologie, Taïwan (plus 103-2320-B-001-016-MY3 à Y.-F. L.), le programme d’Innovation translationnelle du développement biopharmaceutique – technologie supportant la plateforme Axis Scheme (NP7 à Y.-F.L.) et l’Académie chinoise des sciences (à Y.-F.L.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| VictorLight lecteur de plaques de luminescence | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Classe II, Type 2 Armoire de sécurité biologique | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco' s Milieu Eagle modifié (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | composant principal du milieu de croissance |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidine | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycine B | Gibco | 10687010 | |
| Hémocytomère | Sigma-Aldrich | Aldrich | |
| à 96 puits | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciférase réactif | Promega | E2510 | |
| Humidifié CO2 incubateur | Revco | Ultima II | |
| Lignée cellulaire T-REx293 | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 version du logiciel 3.0 | Logiciel de contrôle de l’instrument PerkinElmer du lecteur de microplaques à luminescence |
Références
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Réimpressions et autorisations
Mots-clés
Dosage de la gamma s cr tasemesure du clivage de l APPanalyse du clivage de Notchsyst me rapporteur lucif raseculture cellulaire HEK293traitement au CL 387 785tude de l inhibition par le DAPTanalyse de la s lectivit du substratrecherche sur la maladie d Alzheimerplateforme de d couverte de m dicaments
