Protocole expérimental pour la détection de la fonction mitochondriale chez les hépatocytes exposés aux pesticides organochlorés

Summary

Comprendre l’influence des pesticides organochlorés environnementaux (PCO) sur la fonction mitochondriale dans les hépatocytes est important dans l’exploration du mécanisme des PCO causant des troubles métaboliques. Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique.

Abstract

Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique pour une meilleure compréhension de la cause des troubles métaboliques causés par les pesticides organochlorés environnementaux (PCO) chez les hépatocytes. Les cellules d’hépG2 ont été exposées à l’β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) pendant 24 h à une dose équivalente d’exposition interne dans la population générale. L’ultrastructure dans les hépatocytes a été examinée par microscopie électronique de transmission (TEM) pour montrer les dommages des mitochondries. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial membranaire (MMP) dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. L’intensité de fluorescence de mitochondries après tachée par la sonde fluorescente verte mitochondriale a été observée avec une microscopie de fluorescence. La réaction de luciferin-luciferase a été employée pour déterminer des niveaux d’ATP. Le MMP a été détecté par le colorant cationique JC-1 et analysé sous cytométrie de flux. L’OCR a été mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire. En résumé, ces protocoles ont été utilisés dans la détection de la fonction mitochondriale dans les hépatocytes avec pour étudier les dommages mitochondries.

Introduction

Les effets des pesticides organochlorés (PCO) sur la santé, par exemple l’interférence reproductrice, la toxicité immunologique, les changements métaboliques ont été précédemment étudiés^1,2,3. Les méthodes pour détecter le métabolisme cellulaire et découvrir le dysfonctionnement mitochondrial ont permis aux scientifiques de comprendre le rôle de la fonction mitochondriale(c.-à-d., niveaux de STAT3 mitochondrial, lactate, pyruvate, rapport lactate-pyruvate, coenzyme Q10, fuite de protons mitochondrials, bioénergétique, biogenèse, et dynamique) dans des domain....

Protocol

Toutes les expériences et les protocoles d’expérience ont été réalisés conformément aux lignes directrices et règlements pertinents et approuvés par le Comité d’éthique local de l’Université médicale de Nanjing.

1. Ultrastructure mitochondriale par TEM

1. Collecte des cellules HepG2
   1. Seed HepG2 cellules dans des plats de 100 mm. Conserver à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans le tube de 1,5 mLEP.
   3. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min à température ambiante (RT). Jetez le supernatant.
   4. Recueillir 4-6 x 10⁵ cellules HepG2.

Results

Les cristae mitochondries des cellules hepG2 exposées au β-HCH ont été nettement endommagées. Les mitochondries dispersées ont été légèrement étendues, de forme irrégulière, et la crête mitochondriale a disparu avec l’architecture mitochondriale relativement anormale (figure 1).

L’intensité moyenne de fluorescence vert mitochondrial, qui représente les mitochondries, a diminué dans les cellules hepG.......

Discussion

L’utilisation d’une variété de méthodes expérimentales qui ont été couvertes par le phénotype au mécanisme est essentielle au succès du protocole de détection. Dans cette étude, les cellules d’HepG2 ont été cultivées dans DMEM avec la pénicilline et la streptomycine et le sérum bovin foetal de 10%. Lorsque les cellules ont atteint 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h. Nous avons d’abord utilisé TEM qui a montré les changements ultrastructuraux dans l’hépatocyte causés par le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope électronique à transmission  ;	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Imagerie haute résolution à contraste élevé, Observation et imagerie à faible dose, Observation à basse température, Performances analytiques exceptionnelles, Automatisation pour plus de commodité et de performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green est une sonde fluorescente verte mitochondriale qui peut être utilisée pour la coloration fluorescente spécifique aux mitochondries de cellules vivantes.
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	700B	La conception est compacte, stable, le chemin de la lumière est le plus court, une précision de lumière élevée, une technologie créative et une technologie de balayage sophistiquée pour produire une image d’échantillon en 3 dimensions parfaite.
Beyotime		S0027	Le kit de dosage ATP amélioré peut être utilisé pour détecter les niveaux d’ATP (adénosine 5'-triphosphate) dans les solutions, cellules ou tissus courants. Les cellules et les échantillons de tissus peuvent être divisés pour terminer la préparation de l’échantillon, sensibilité de détection jusqu’à 0,1 nmol / L, la chimiluminescence peut être maintenue pendant 30 minutes.
Luminomètre	Berthold	Centro LB 960	Le luminomètre est un détecteur de chimiluminescence, l’échantillon de test lui-même peut être léger, n’a pas besoin de stimuler. Le luminomètre est l’instrument qui détecte la chimiluminescence.
		kit de dosage des protéines BCA est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour détecter les concentrations de protéines.
Lecteur multimode	TECAN	InfiniteM200	lecteur multimode peut être utilisé pour détecter la consentement des protéines.