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Article de méthode

Évaluation des thérapies de cellules souches dans un modèle de blessure Tendon patellaire bilatérale chez le rat

10.7K vues

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DOI :

10.3791/56810

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30 mars 2018

 ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit la préparation et l’évaluation des sphéroïdes matrice dérivées de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical avec un modèle de défaut du tendon patellaire bilatérale chez un rat. Ce modèle a été associé à une morbidité acceptable et a été trouvé pour détecter les différences entre les tendons non traités et traités et entre les deux traitements testé.

Résumé

Médecine régénérative fournit des solutions de rechange aux conditions qui remettent en question les traitements traditionnels. La prévalence et la morbidité de tendinopathie diverses espèces, combinées avec les propriétés curatives limitées de ce tissu, ont incité la recherche de thérapies cellulaires et propulse le développement de modèles expérimentaux d’étudier leur efficacité. Cordon ombilical matrice mésenchymateuses cellules souches dérivées (Université Complutense de Madrid-SMC) sont candidats attrayants parce qu’ils sont abondants, facile à recueillir, contourner les préoccupations éthiques et le risque de formation de tératome, pourtant plus ressemblent beaucoup à des cellules souches embryonnaires primitives que adultes dérivés de tissus significatifs MSCs. intérêt vise le chitosan comme une stratégie pour améliorer les propriétés de MSCs, par le biais de la formation sphéroïde. Ce papier détails techniques pour isoler l’UCM-MSCs, préparer des sphéroïdes sur film de chitosan et analyser l’effet de formation sphéroïde sur l’expression du marqueur de surface. En conséquence, création d’un modèle de blessure tendon patellaire bilatérale chez le rat est décrite pour l’implantation de in vivo des sphéroïdes UCM-MSC formé sur le film de chitosan. Aucune complication n’a été observée dans l’étude en ce qui concerne la morbidité, soulignons hausse des effets, ou une infection des tissus. Le score fonctionnel des rats exploités à 7 jours est inférieur à celle des rats normaux, mais revenue à la normale dans les 28 jours après la chirurgie. Les scores histologiques des tissus de guérison ont confirmé la présence d’un caillot dans les défauts traités ont évalué à 7 jours, absence de réaction à corps étranger et progresse de guérison à 28 jours. Ce modèle de défaut du tendon patellaire bilatéral contrôle la variation inter-individuelle via la création d’un contrôle interne dans chaque rat, a été associé à une morbidité acceptable et a permis la détection des différences entre les tendons non traitées et les traitements.

Introduction

Blessure au tendon est l’une des causes plus fréquentes de l’atrophie importante douleur et muscle l’ensemble de l’espèce1. En médecine vétérinaire, lésions de tendons et ligaments sont d’un intérêt particulier chez les chevaux, que 82 % de toutes les blessures chez les chevaux de course implique le système musculo-squelettique, et 46 % de ceux qui affectent les tendons et les ligaments2,3. Formation de tissu cicatriciel affecte les propriétés biomécaniques des tendons cicatrisés et explique le pronostic surveillé pour retour à usage sportif après des blessures de tendon fléchisseur ; nouvelle blessure survient dans les deux ans en jusqu'à 67 % des chevaux traitées conservativement4. Médecine régénérative fournit des solutions de rechange à une condition qui défie les traitements traditionnels. Thérapie de cellules souches autologues a produit quelques résultats encourageants5,6 , mais est limitée par la morbidité associée à la collection de tissus, retard dans l’administration en raison de la transformation/reprogrammation de cellules et l’influence de la État de santé du patient (tels que l’âge) sur les propriétés des souches de cellules7,8. Ces limitations plaident en faveur d’enquêter sur les cellules souches allogéniques comme alternative standard. Cellules foetales dérivées de ses annexes sont candidats attrayants car ils contourner les préoccupations éthiques et le risque de formation de tératome associée à des cellules souches embryonnaires. Parmi les annexes fœtales, cordon ombilical de matrice (UCM), aussi nommée la gelée de Wharton, est abondante et facile à percevoir.

Quelle que soit la source des cellules, améliorer stemness est essentielle pour établir une banque de cellules pour la médecine régénérative allogénique. D’un point de vue fonctionnel, stemness peut être défini comme le potentiel de différenciation autorenouvellement et lignées multiples9. Preuve de stemness s’appuie sur la prolifération et la différenciation des essais, ainsi que de l’expression des gènes marqueurs Oct4, Sox2 et Nanog9. Une stratégie visant à améliorer la stemness repose sur l’utilisation des biomatériaux pour servir de Sub remplisseurs et transporteurs améliorant la prolifération et la différenciation de l’UCM-MSCs. Cette approche élimine les préoccupations au sujet de la manipulation des facteurs transcriptionnels de reprogrammer des cellules adultes en cellules pluripotentes induites. Parmi les biomatériaux considérés comme potentiellement porteurs de cellules souches, chitosan lance un appel pour sa biocompatibilité et dégradabilité10. Cette aminopolysaccharide naturelle est formée par désacétylation alcaline de chitine, le polysaccharide naturel deuxième plus abondant, obtenue principalement comme un sous-produit de crustacés10. Nous avons précédemment étudié les interactions entre MSCs et échafaudages de chitosan et observé la formation de sphéroïdes11,12,13,14,15, 16. nous avons également rapporté sur la supériorité de chondrogenèse le chitosan matrices12,13,14,15,16,17, 18. Plus récemment, deux études indépendantes décrit sphéroïdes formation par le tissu adipeux et le tissu placentaire dérivé MSCs cultivés sur un chitosan film19,20. Cette formation des sphéroïdes a non seulement amélioré stemness, mais également amélioré le maintien des cellules souches après in vivo implantation20.

La prévalence et la morbidité de tendinopathie diverses espèces ont incité le développement de modèles expérimentaux d’étudier la physiopathologie des tendinopathies et de tester de nouveaux traitements tels que des injections de cellules souches. Chez les chevaux, induite par la collagénase tendinite est un modèle commun de démontrer l’efficacité de l’utilisation de MSCs dans la réparation de tendon21. La pertinence de cette approche est limitée, comme les injections provoquent des changements inflammatoires aigus, alors que les tendinopathies cliniques résultent habituellement de chronique surmenage22,23. En outre, induction chimique de maladie du tendon entraîne une réponse de guérison et ne réplique pas le processus de guérison visuels présent dans les cas cliniques22,23. L’excision d’un segment du tendon fléchisseur digital superficiel a été décrit comme un modèle chirurgical de la tendinite en chevaux24. Plus récemment, une approche mini-invasive a été utilisée pour restreindre les dommages traumatiques de la partie centrale du tendon fléchisseur digital superficiel25. Les modèles chirurgicaux ne pas simuler le mécanisme de fatigue qui peut conduire à une maladie naturelle de tendon et tendent à manque de reproductibilité dans l’étendue des dommages créé25. Quel que soit le modèle, la morbidité et le coût associé aux modèles équines du tendon maladies sont des limitations supplémentaires, qui justifient d’un intérêt pour les modèles de rongeurs dans un premier temps pour in vivo l’évaluation de nouveaux traitements.

L’un des principaux avantages des modèles expérimentaux chez les rongeurs consiste le coût et la capacité de contrôler la variabilité interindividuelle. Les rongeurs peuvent être normalisées en ce qui concerne les divers facteurs physiologiques en raison de leur taux de croissance rapide et relativement courtes durées de vie, limiter les sources de variation et donc réduire le nombre d’animaux requis pour détecter les différences. Stratégies d’induire des maladies tendon chez les rongeurs sont sont appuyés sur l’induction chimique, mais aussi sur la création chirurgicale du tendon partielle défauts21. Les modèles chirurgicaux peuvent simuler des tendinopathies naturels mieux que les modèles chimiques, mais peuvent entraîner une morbidité plus élevée et une défaillance catastrophique du tendon endommagé. À cet égard, des rats semblent meilleurs candidats que les souris pour ces modèles, car leur taille permet la création des plus grands défauts, facilitant ainsi l’évaluation de la guérison des tissus. Rats Sprague-Dawley ont été utilisés dans des études expérimentales de tendinopathies en quatre groupes principaux tendons : coiffe des rotateurs, fléchisseurs, Achille et tendons rotuliens26. Parmi ceux-ci, les modèles impliquant le tendon rotulien sont particulièrement attrayants en raison de la grande taille de ce tendon et la facilité d’y accéder à27. Le tendon rotulien s’attache le muscle quadriceps de la tubérosité tibiale. Au sein de cet appareil extenseur, la rotule est un OS sésamoïde qui dirige l’action du quadriceps et délimite l’étendue proximale du tendon rotulien. La présence des ancrages osseux à l’étendue proximale et distale du tendon rotulien facilite les tests biomécaniques. Modèles impliquant le tendon rotulien en général dépendent des défauts chirurgicales unilatérales, avec un tendon intact controlatéral, agissant comme un contrôle28,29. Le modèle de défaut de tendon rotulien plus courant consiste à exciser la partie centrale (1 mm de largeur) du tendon rotulien de l’apex distale de la rotule à l’insertion de la tubérosité tibiale, tandis que le tendon rotulien controlatéral est laissé intact. Mesures des résultats ont inclus l’histologie, les essais non destructifs de biomécanique ou tests biomécaniques à l’insuffisance, échographie, imagerie de fluorescence ex vivo , observation brute et tests fonctionnels28,30 ,,31. Les modèles unilatérales ne permettent pas de comparaison entre un traitement proposé et gestion conservatrice d’une blessure similaire dans le même animal. De même, la comparaison entre plusieurs traitements nécessite animaux distincts. Un modèle bilatéral éliminerait les variations entre individus et réduire le nombre d’animaux requis pour une étude de32. Cependant, les lésions bilatérales peuvent augmenter la morbidité et boiterie bilatérale susceptibles d’entraver évaluation de traitement. Quelques études rapportent brièvement l’utilisation des défauts de tendon patellaire bilatérale chez les rats mais se concentrer sur les effets des traitements plutôt que gestion périopératoire et la morbidité de la modèle33,,34.

Objectif à long terme de cette étude est d’élaborer une stratégie pour améliorer la survie stemness et in vivo de l’UCM-MSCs destinés à une transplantation allogénique. Pour atteindre cet objectif, nous avons récemment rapporté stemness améliorée de l’UCM-MSCs par formation de sphéroïdes sur film de chitosan et d’incubation sous environnement hypoxique35. Ces propriétés in vitro ont été associées à améliorée propriétés biomécaniques des défauts de tendon rotulien traités avec conditionné UCM-MSCs. se fondant sur ces résultats, le modèle de défaut du tendon patellaire bilatéral rat semble approprié pour tester les candidats traitements pour tendon blessures36. Le but de l’étude a signalé ici est de fournir des protocoles détaillés pour l’isolement et la caractérisation de l’UCM-MSCs, préparation d’un système de livraison biologique des cellules souches, de création et de traitement des défauts de tendon patellaire bilatérale et post-operative récupération et évaluation des tissus de guérison dans les défauts.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Western University of Health Sciences.

1. isolement et Expansion de MSCs de matrice équine du cordon ombilical

  1. Obtenir le placenta d’une jument adulte (enceinte) après avoir observé le poulinage et isoler aseptiquement le cordon ombilical du placenta. Gardez le cordon ombilical dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) à 4 ° C pendant le transfert jusqu’au traitement.
  2. Lavez le cordon ombilical deux fois avec la température de la pièce PBS avec 1 % P/S dans un tube de 50 mL. Section du cordon ombilical en fragments de 2 pouces de long sur 150 mm plaque et le lavage à température ambiante PBS avec 1 % P/S dans un tube de 50 mL deux ou trois fois, jusqu'à ce que la plupart du sang est rincé.
  3. Couper le cordon ombilical longitudinalement pour exposer les navires. Supprimer les navires, y compris les 2 artères et une veine un pédoncule allantoïdien dans le cordon avec des ciseaux et pinces. Matrice de cordon ombilical (gelée de Wharton), c'est-à-dire les vaisseaux avoisinants de la matrice gélatineuse, sur une plaque de 150 mm en grattant avec un scalpel, de recueillir et émincer la gelée en beaux morceaux.
  4. Gelée de Wharton place de fragments de cordon ombilical de 2 – 3 (environ 12 à 15 g) dans un tube de 50 mL à 15 mL de solution de type IA de collagénase de 0,1 % (p/v) dans du PBS. Incuber à 37 ° C sous agitation douce pendant 3-4 h jusqu'à dissolution.
  5. Centrifuger les tissus digérés à 300 g pendant 15 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les tissus digérés dans 15 mL de température ambiante PBS avec 1 % P/S, la composition de pipetage, centrifuger à 150 g pendant 5 min et aspirer le surnageant (lavage). Répétez à laver deux fois plus.
  6. Remettre lavée cellules dans 15 mL de température ambiante PBS avec 1 % P/S, mélanger en pipettant également, par la souche avec bonde de cellule 100 µm, centrifuger à 150 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  7. Préparer le milieu de culture (CM) en mélangeant du glucose bas Dulbecco milieu Eagle modifiée (LG-DMEM) avec sérum fœtal (SVF) et 1 % P/S. stériliser le milieu en filtrant.
  8. Remettre en suspension les cellules tendues dans 10 mL de CM préalablement chauffé à 37 ° C, mélanger en pipettant également, transvaser dans une fiole de culture de tissu 25 cm2 et incuber à 5 % de CO2 à 90 % d’humidité et de 37,0 ° C. Changement CM tous les 3 jours jusqu'à ce que la culture atteint le confluent de 70 à 80 %, lorsque la culture va être repiquée.
  9. Pour le passage de la culture, aspirer CM de fiole, laver deux fois avec 5 mL de PBS de la température ambiante et détacher avec 3 mL de 0,25 % acide de trypsine/tétraacétique (EDTA) à 37 ° C pendant 5 min.
  10. Neutraliser la trypsine/EDTA avec 6 mL de CM préchauffée à 37,0 ° C, mélanger en pipettant également, transvaser dans un tube de 15 mL, centrifuger à 150 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension des cellules individuelles dans 1 mL de CM, composition de pipetage. Compter les cellules viables utilisant le bleu trypan et hémocytomètre. Ensemencer de nouveau dans une fiole de culture de tissu 25 cm2 à 5 000 cellules/cm2et incuber à 5 % de CO2 à 90 % d’humidité et de 37,0 ° C.

2. préparation des sphéroïdes UCM-environnement MSCS cultivés sur le Chitosan Films

  1. Pour préparer 100 mL de solution de chitosan de 1 % (p/v), ajouter 1 g de chitosan en 99 mL d’eau distillée (dH2O) et bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  2. Ajouter 670 µL d’acide acétique glacial et continuer de mélanger jusqu'à ce que le chitosan se dissout et devient visqueux. Cela prend habituellement 3 à 4 h.
  3. Ajouter 500 µL de solution de chitosane dans chaque puits de la plaque de culture de tissu de 12 puits, et agiter la plaque pour répartir la solution de chitosan et couvrent l’ensemble de la surface inférieure.
  4. Sécher la plaque de solution enduite de chitosan sous flux laminaire sans une couverture pendant la nuit pendant 24 h. Une fois sec, film mince sera formé et adhère à la plaque.
  5. Neutraliser le chitosan film en ajoutant 1 mL de solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 0,5 N dans chaque puits et incuber pendant 2 h à température ambiante. Aspirer le NaOH dans chaque puits et laver chaque bien avec 1 mL de dH2O trois fois. Laver chaque bien avec 1 mL d’éthanol (EtOH) à 70 % une fois.
  6. Pour stériliser le chitosan film, ajouter 1 mL de 70 % EtOH dans chaque puits et incuber pendant la nuit à flux laminaire. Aspirez EtOH restante de chaque puits dans le jour suivant. Laver chaque bien avec 1 mL de PBS stérile trois fois. Stériliser le chitosan film avec la lumière ultraviolette sous flux laminaire du jour au lendemain sans couvercle.
  7. Pour sphéroïdes de forme de l’UCM-MSCs, semences élargi subcultures cellules dans chaque puits à 5 000 cellules/cm2et incuber à 5 % de CO2 à 90 % d’humidité et de 37,0 ° C.
    Remarque : Les cellules peuvent être incubées sous hypoxie ou normoxie, selon l’intérêt de l’enquêteur.

3. l’expression des marqueurs de Surface analysés par cytométrie en flux

  1. Préparation d’une suspension de cellules du même
    1. Plaque standard
      1. Éliminer le milieu de chaque puits et laver deux fois avec température ambiante PBS.
      2. Détacher les cellules avec 500 µL de réactif dissociation cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 12 puits pendant 5 à 10 min à température ambiante.
      3. Après incubation, ajouter 1 ml de tampon (PBS contenant 0,5 % de BSA) de coloration dans chaque puits et mélanger en pipettant également, pour détacher des cellules.
      4. Transfert en suspension cellulaire en tube conique de 15 mL et centrifuger à 150 x g pendant 5 min.
    2. Plaque de chitosan
      1. Recueillir tous les sphéroïdes par aspiration moyenne à l’aide d’une pipette avec une pointe de 1 000 µL. Caloporteur recueilli dans un tube conique de 15 mL. Après avoir recueilli moyen, laver bien en ajoutant 1 mL de PBS et PBS lavées de transfert dans le même tube conique de 15 mL.
      2. Centrifuger les sphéroïdes à 150 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
      3. Ajouter 500 µL de réactif dissociation cellulaire (par exemple, accutase) et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. La composition de pipetage en utilisant un embout de 1 mL jusqu'à ce que les sphéroïdes dissocient et ne sont plus visibles.
      4. Ajouter 1 mL de tampon de coloration dans la suspension monocellulaire et centrifuger à 150 x g pendant 5 min.
  2. Laver les cellules
    1. Éliminer le surnageant du tube conique et remettre en suspension les cellules dans 3 mL de froid coloration tampon. Garder les cellules sur la glace tout au long de l’expérience de cette étape.
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min (lavage).
    3. Laver deux fois.
  3. Coloration des cellules
    1. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
    2. Compter les cellules viables utilisant un bleu trypan et hémocytomètre. Cellules de 1 x 106 remettre en suspension dans 50 µL de blocage de la mémoire tampon (PBS contenant 10 % cheval du sérum) et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
    3. Ajouter 10 µL fluorescéine isothiocyanate (FITC) conjugué anticorps (CD44, CD90, CD105, CD34, (majeur d’histocompatibilité complexe CMH) de classe II ou isotype contrôle pour chaque anticorps) et 40 µL de tampon de coloration, puis incuber protégée de la lumière pendant 1 h sur la glace.
    4. Ajouter 3 mL de froid coloration tampon et mélanger, centrifuger à 300 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant (lavage).
    5. Répéter deux fois plus de lavage.
    6. Resuspendre le culot dans 0,5 mL de tampon de coloration
    7. Ajouter 5 µL de 7-AAD (colorant de viabilité) et incuber pendant 30 minutes sur la glace
    8. Analyser des échantillons de cellules colorées par cytomètre en flux. Exclure les débris de leurs petits SSC et FSC et identifier des cellules viables à plus faible absorption des 7-AAD. Tracer des LV1 et LV2 sur les axes y et x, respectivement. Isotype contrôle permet de créer une porte au-dessus de la ligne diagonale. Mesurer le pourcentage de cellules colorées positivement dans la région. Compter au moins 20 000 événements/échantillon (supplémentaire Figure 1).
    9. Mesurer le pourcentage de cellules colorées avec les anticorps par déclenchement des cellules viables et auto-fluorescence et soustrayez le pourcentage de cellules colorées au contrôle de l’isotype.

4. bilatéraux Tendon rotulien défaut modèle chez le Rat

  1. Sélectionnez les rats Sprague-Dawley (adultes mâles, 4-5 mois, poids corporel 350 et 375 g). Notez la taille relativement importante des rats utilisés pour ce modèle.
  2. Une anesthésie et d’appliquer du lubrifiant oeil artificiel le rat avec le sévoflurane de 8 % en oxygène de 100 % 2 L/min livré par masque, jusqu'à disparition du réflexe de pincement des pieds dans la chambre de l’induction.
  3. Administrer une injection intramusculaire de Meloxicam (1 mg/kg) comme l’analgésie préventive.
  4. Placez le rat entre deux bouteilles d’eau 0,5 L rempli d’eau chaude et recouvert d’un linge pour maintenir la température du corps et la position, tout en évitant les blessures de la peau. Ruban adhésif à chaque extrémité de la table. Pour réduire le risque d’hypothermie, couvrir le corps avec des bulles d’air (Figure 1).
  5. Maintenir l’anesthésie avec un flux continu de sévoflurane 5 % 1 L 100 % oxygène mélange via l’extrémité conique, avec l’animal sur décubitus dorsal sur coussin chauffant l’eau.
  6. Pour éviter le traumatisme de la peau, découpent pas les sites chirurgicaux. Au cours de ces deux étouffe, appliquez la crème hair remover. Utiliser une spatule pour enlever la crème et les cheveux.
  7. Frotter le site chirurgical avec gommage de digluconate de chlorhexidine et rincer avec de l’éthanol à 70 % 3 fois.
  8. Inciser la peau avec une lame de bistouri #15 stérile dans le sens proximal à distal, sur l’aspect crâniomédian de l’articulation fémoro. Démarrez l’incision d’environ 1 cm en amont au niveau de la rotule et étendez-le distal de la tubérosité tibiale d’environ 5 mm.
  9. Tenir compte de la peau pour exposer le tendon rotulien en libérant le tissu sous-cutané sous-jacent avec une lame de bistouri #15.
  10. À l’aide de la lame de bistouri #15, exciser le tiers central de chaque tendon rotulien (1 mm) sous l’angle distal de la rotule de la tubérosité tibiale.
    1. Aligner un fil de Kirschner 0.99 mm de diamètre contre le tendon comme modèle d’uniformiser la taille du défaut dans chaque branche (Figure 2).
    2. Faire 2 incisions de pleine épaisseur de chaque côté du fil Kirschner avec une lame de bistouri #15 pour isoler la partie centrale du tendon (Figure 3). Résection la section centrale dans la partie proximale et distale avec des ciseaux fins Iris (Figure 4).
    3. Avant de fermer le carénage de l’articulation fémoro, insérer le caillot (suspension de cellules mixtes et ACP) pour les groupes de traitement approprié, tel que décrit dans 5.5. Fermer l’aponévrose avec un motif croisé et la peau avec un modèle intradermique à l’aide de sutures de 910 de polyglactin de 5-0 (Figure 5).
  11. Répétez l’opération sur le genou controlatéral.
    Remarque : Un seul défaut est assigné au hasard à un traitement (cellules souches conditionné sur le chitosan ou cultivés sur des plaques standards). Le défaut controlatéral est laissé vide, pour servir de contrôle interne.
  12. Après la chirurgie, administrer 4 comprimés d’enrofloxacine (2 mg/comprimé, par voie orale, une fois par jour) et un comprimé de meloxicam (2 mg/comprimé, par voie orale, une fois par jour) pendant 7 jours. Ces doses ont été recommandés par un vétérinaire animaux de laboratoire et approuvées dans le protocole IACUC.

5. livraison de MSCs dans le défaut de Tendon rotulien

  1. Anesthésier un rat en bonne santé qui n’est pas utilisé pour la création de défaut tendon rotulien avec 8 % sévoflurane en oxygène de 100 % 2 L/min livré par masque, jusqu'à disparition du réflexe de pincement des pieds dans la chambre de l’induction.
  2. Collecter 5 mL de sang par ponction cardiaque du rat Sprague-Dawley anesthésié (adultes mâles, 4-5 mois, poids 350 et 375 g), dans une seringue de 5 mL avec une aiguille de 20 G, contenant 1 mL d’acide-citrate-dextrose (5:1 v/v).
  3. Euthanasier le rat après ponction cardiaque et la collecte de sang, par l’injection d’intracardial de pentobarbital (100 mg/kg), tandis que sous la même anesthésie.
  4. Centrifuger l’échantillon à 350 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférer le liquide surnageant et stocker les aliquotes (120 µL) à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  5. Immédiatement avant l’implantation in vivo , fondre l’aliquote ci-dessus et mélanger 20 µL avec 0,5 x 106 MSCs (de 1,9 ou 3.1.2.1) détachés des plaques standard à l’aide de la trypsine/EDTA ou recueillir des plaques de chitosan par le rinçage (avec PBS/médium).
  6. Ajouter 6 µL de 10 % de chlorure de calcium (CaCl2) pour le reste 100 µL de plasma décongelé dans un puits de la plaque à 96 puits pour activer le plasma et induisent la formation d’un caillot (activé plasma conditionné : ACP).
  7. Mélanger la suspension cellulaire (20 µL) et ACP (100 µL) pour former un caillot (Figure 6). Placez le caillot dans le défaut de tendon rotulien créé avant de fermer le carénage de l’articulation fémoro (voir étape 4.10.3).

6. résultat fonctionnel

  1. Surveiller les rats deux fois par jour pour des signes de douleur, basée sur le rat grimace échelle (RGS)37,38 et le gonflement sur les sites d’implantation.
    NOTE : Un système de notation (0-6) a été développé pour évaluer la fonction ambulatoire basée sur 3 activités, y compris debout chronométré membre postérieur avec les pattes avant prise en charge (0-3), chronométré debout sans l’aide des membres postérieurs (0-2) et la capacité de monter une cage en plastique mur (0 – 1) () 17 cm Le tableau 1).
  2. Évaluer des rats pour les deux activités de patte debout le matin et le soir de chaque instant pour calculer un score moyen.
  3. Évaluer des rats pour la capacité de monter avec succès une paroi de cage en plastique de 17 cm avec les deux membres postérieurs au sommet.

7. brut apparence et histopathologie du Tendon rotulien

  1. Euthanasier des rats à 7 jours (à évaluer l’inflammation) ou 28 jours (à évaluer une guérison) après traitement par injection intracardial de pentobarbital (100 mg/kg) sous anesthésie avec 8 % sévoflurane et 2 L 100 % d’oxygène par masque.
  2. Récolter des unités de la tubérosité du tibia-rotule-tendon par scalpel et ciseaux après l’euthanasie. Enlever les tissus mous et des ligaments autour de l’articulation fémoro, à l’exception du tendon rotulien.
  3. Examinez chaque spécimen pour l’aspect brut et épaississement du tendon (Figure 7).
  4. Orienter le spécimen en plaçant un nœud de chirurgien de Polydioxanone 5.0 sur l’aspect latéral et proximale du tendon. Fixer chaque échantillon en solution à 10 % de formol tamponné neutre et obtenir des coupes transversales (5 µm) de la partie médiane de chaque tendon.
  5. Tacher les sections à l’aide de l’hématoxyline et éosine et Trichrome de Masson coloration suite de protocoles standard.
  6. Examinez la section pour détecter la présence d’un hématome dans le vice, ainsi que des changements pathologiques telles que l’inflammation.
  7. Évaluer le score histologique des sections en utilisant le système de notation publié antérieurement, basé sur la qualité du collagène, degré d’angiogenèse et cartilage formation (tableau 2)39.

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Résultats

Dans la présente étude, les résultats sont présentés comme moyenne ± écart-type (écart-type). Les cellules ont été isolés dans les cordons ombilicaux de 6 juments et pourcentage des lignées de cellules isolées exprimant chaque marqueur de surface cellulaire sous conditionnement standard ou chitosan ont été comparés avec un test de Friedman, comme une analyse de variance non-paramétrique avec répété mesures. Pour la création de modèles de défaut de tendon, 8 rats ont été utilisés pour l’év...

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Discussion

Cellules équines ont été choisis pour ce projet, parce que finalement, nous avons l’intention de tester des approches de candidat dans la gestion des tendinopathies naturel chez le cheval. En effet, les blessures de tendon chez les chevaux sont attrayants comme modèles naturels de tendinopathie chez l’homme en raison de la similitude biologique entre l’équine flexor digital superficiel et le tendon d’Achille dans les humains41. Les marqueurs de surface cellulaires CD44, CD90 CD105, CD34 et CMH II ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimerait Su, Ph.d., pour son analyse statistique des données. Les auteurs remercient également m. McClure, D.M.V., Ph.d, DACLAM, pour ses conseils sur l’anesthésie et les protocoles de gestion de la douleur utilisées dans l’étude. Ce projet a été soutenu par des subventions de la Western University of Health Sciences Bureau du Vice Président de recherche (12678v) et Fonds USDA article 1433 (2090).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PBS 10xHycloneSH30258.01Consommable
Collagénase type IAWorthingtonLS004197Consommable
DMEM faible teneur en glucoseHycloneSH30021. FSConsommable
Sérum fœtal bovinHycloneSH30910.03Consommable
Pénicilline/Streptomycine 100xHycloneSV30010Consommable
Trypsine 0.25 %HycloneSH30042.01Consommable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consommable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consommable
Diméthyl SulfoxydeSigmaD2650Consommable
ChitosanSigmaC3646Consommable
Hydroxyde de sodiumSigmaS8045Consommable
Sérum bovin AlbumineHycloneSH30574.01Consommable
Tube en polystyrène à fond rondCorning149591AConsommable
Souris anti-cheval CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsommable
Souris anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsommable
souris anti-cheval MHC-II (FITC)AbDserotecMCA1085FConsommable
souris IgG1 (FITC) - Contrôle d’isotypeAbD serotecMCA928FConsommable
Souris monoclonale [SN6] à CD105 (FITC)abcamab11415Consommable
Souris IgG1 (FITC) - Contrôle d’isotypeabcam ab91356Consommable
Souris anti-humaine CD34 (FITC)BDBDB560942Consommable
Souris IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consommable
7-AADBDBDB559925Consommable
BD Accuri C6 Cytomètre en FluxBDEquipement
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consommable
Acide-citrate-dextroseSigmaC3821Consommable
Chlorure de calciumSigmaC5670Consommable
SévofluraneJD Medical60307-320-25Consommable
RatsCharles RiverCode de souche : 400Animal de laboratoire
Kit chirurgical pour ratsAppareil Harvard728942
Équipement Lame chirurgicale #15MEDLINEMDS15115Consommable
Rat MD’s Baytril (2 mg/Comprimé),
Rimadyl (2 mg/Comprimé)		Bio ServF06801Consommable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsommable
Eosin alchol shandonThermo consommable6766007
scientifique Harris HematoxylinThermo scientific143907Consommable

Références

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