Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Article de méthode

Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation

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DOI :

10.3791/56812

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3 janvier 2018

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

Dans cet article

Résumé

Des procédures de fabrication pour ion lanthanide hautement magnétiquement sensibles polymoléculaire assemblées de chélation sont présentés. La réponse magnétique est dictée par la taille de l’Assemblée, qui est adaptée par extrusion à travers des membranes nanopore. Assemblées alignability magnétique et changements structurels induits par la température sont surveillées par des mesures de la biréfringence, une technique gratuite à résonance magnétique nucléaire et de la diffusion des neutrons petit angle.

Résumé

Bicelles sont des assemblages d’accordable disque polymoléculaire formés d’une grande variété de mélanges de lipides. Diverses applications études structurales de protéine de membrane par résonance magnétique nucléaire (RMN) aux développements nanotechnologiques, y compris la formation de gels optiquement actifs et magnétiquement commutables. Ces technologies nécessitent contrôle élevé de la taille de l’Assemblée, la réponse magnétique et la résistance thermique. Mélanges de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et son ion lanthanide (Ln^{3 +}) chélatant conjugué de phospholipides, 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phospho-éthanolamine-diéthylène triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), monter dans des assemblys fortement magnétiquement sensibles telles que le DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) bicelles. Introduction de cholestérol (Chol-OH) et dérivés stéroïdiens dans la bicouche se traduit par un autre jeu d’assemblys offrant des propriétés physico-chimiques uniques. Pour une composition lipidique donnée, l’alignability magnétique est proportionnel à la taille de bicelle. La complexation de Ln^{3 +} se traduit par des réponses magnétiques sans précédent en termes de grandeur et alignement de direction. L’effondrement de thermo réversible des structures disque-comme dans les vésicules en chauffant permet adaptation des dimensions assemblées par extrusion à travers des membranes filtrantes avec la taille des pores définis. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées par refroidissement à 5 ° C, ce qui entraîne l’Assemblée dimensions définies par les précurseurs de la vésicule. Dans les présentes, cette procédure de fabrication est expliquée et l’alignability magnétique des assemblées est quantifié par des mesures de biréfringence sous champ magnétique 5,5 T. Le signal de la biréfringence, provenant de la bicouche phospholipidique, outre permet la surveillance des changements polymoléculaire dans la bicouche. Cette technique simple est complémentaire des expériences RMN qui sont couramment employées pour caractériser bicelles.

Introduction

Bicelles sont des assemblages de type disque polymoléculaire provenant de nombreux mélanges de lipides. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ils sont largement utilisés pour la caractérisation structurale des biomolécules de membrane par spectroscopie RMN. ⁶ ^, ⁷ Toutefois, les efforts récents visent à élargir le champ d’applications possibles. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ le système de bicelle plus étudié est composé d’un mélange de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DMPC), constituant la partie plane de l’Assemblée et 1, 2-dihexanoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DHPC) phospholipides qui couvre le bord. ¹ ^, ² ^, ³ la géométrie moléculaire des phospholipides composer la bicouche dicter l’architecture de la structure polymoléculaire auto-assemblés. ⁴ ^, ⁵ remplacement DHPC avec DMPE-DTPA génère systèmes hautement magnétiquement sensibles et accordables bicelle. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) bicelles associé avec beaucoup plus d’ions paramagnétiques lanthanide (Ln^{3 +}) sur la surface de la bicouche, ayant pour résultat une réponse magnétique accrue. ¹⁰ par ailleurs, en remplaçant les molécules solubles dans l’eau de DHPC avec DMPE-DTPA/Ln^{3 +} permet la formation de bicelles résistant à la dilution. ¹¹

L’alignability magnétique des polymoléculaire planes assemblées est dicté par leur énergie magnétique dans l’ensemble,

figure-introduction-1 (1)

où B est l’intensité du champ magnétique, figure-introduction-2 la n magnétique constant, le nombre d’agrégation et figure-introduction-3 l’anisotropie de la susceptibilité diamagnétique moléculaire des lipides composer la bicouche. Par conséquent, la réponse de DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles aux champs magnétiques est adaptée par leur taille (nombre total n) et le Δχ d’anisotropie moléculaire susceptibilité diamagnétique. Celle-ci est facilement obtenue en changeant la nature de la Ln chélatés^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ présentation cholestérol (Chol-OH) ou autres dérivés de stéroïdes dans la bicouche offre la possibilité de régler aussi bien le nombre total n et le Δχ de la susceptibilité magnétique des assemblées. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ pour une composition lipidique donnée, plus grandes assemblées contiennent plus de lipides pouvant contribuer à l’E-_mag (plus gros agrégat nombre n), résultant en des espèces plus réglable. La taille de DMPC/DHPC bicelles, par exemple, est conventionnellement contrôlée grâce à l’optimisation de la concentration composition de ratio ou total des lipides. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² même si cela est possible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, leur transformation thermo réversible de bicelle aux vésicules par chauffage offres ajouté des options de personnalisation. Les moyens mécaniques tels que l’extrusion à travers des filtres de membrane permet de façonner des vésicules. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées après refroidissement à 5 ° C et leurs dimensions sont dictées par les précurseurs de la vésicule. ¹¹ Herein, nous nous concentrons sur le potentiel des procédures de fabrication mécanique avec DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) sous forme de systèmes de référence. Le processus fonctionne par analogie lorsque vous travaillez avec autres Ln^{3 +} que Tm^{3 +}. Le large éventail des possibilités offertes par ces techniques sont mises en évidence dans la Figure 1 et largement discutées ailleurs. ²³

figure-introduction-4
Figure 1 : aperçu schématique des procédures de fabrication possible. Étudiés par magnétisme réglable Ln^{3 +} chélateur polymoléculaire assemblées sont composées de deux DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5). Le film lipidique sec est hydraté avec une mémoire tampon au phosphate 50 mM à un pH de 7,4 et la concentration de lipides totaux est de 15 mM. Une hydratation efficace du film lipidique nécessite soit gel dégel cycles (FT) ou chauffage et refroidissement des cycles (H & C). H & C cycles sont nécessaires pour régénérer les échantillons après le dernier gel dégel étape, ou pour régénérer les échantillons congelés pendant une période prolongée de temps s’ils doivent être utilisés sans davantage d’extrusion. Ces étapes sont longuement débattus par Isabettini et al. ²³ polymoléculaire au maximum réglable assemblées soient atteints, livrant des architectures assembly différent basés sur la composition des lipides. La taille de bicelle et alignability magnétique est accordable par extrusion (Ext) à travers des filtres de membrane nanopore. L’alignement présenté facteurs A_f ont été calculées de 2D petit angle neutron scattering (San) modèles d’un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) échantillon extrudé à travers soit 800, 400, 200 ou 100 nm pores. SANS mesures sont un moyen complémentaire de quantifier l’alignement de bicelle qui ne sera pas couvert plus en détail ci-après. ¹¹ ^, ¹⁶ A la_f varie entre -1 (diffusion de neutrons parallèle ou perpendiculaire alignement de le bicelles à l’égard de la direction du champ magnétique) et 0 pour la diffusion isotrope.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La structure de bicelles a été étudiée par un large éventail de techniques de caractérisation. ¹³ l’alignement de bicelles exposés à un champ magnétique a été quantifiée à l’aide de la spectroscopie RMN ou expériences de diffusion (San) de neutrons petit angle. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ Toutefois, le déplacement et l’élargissement des pics NMR qui se produisent en présence de Ln^{3 +} sont la méthode de sérieuses limites. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ bien que SANS expériences ne souffrent pas de cette limitation, alternative et des techniques plus accessibles sont souhaitables pour la quantification systématique de l’alignement magnétique induit des assemblys dans la solution. Les mesures de biréfringence sont une alternative viable et relativement simple. Par analogie à des expériences RMN, mesures de biréfringence révèlent des renseignements précieux sur les réarrangements de lipides et de phases lipidiques qui se produisent dans la bicouche. En outre, les transformations géométriques qui se produisent dans l’assembly polymoléculaire avec l’évolution des conditions environnementales comme la température sont contrôlées. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ de biréfringence induite par magnétisme a été utilisé pour étudier les différents types de systèmes de phospholipides. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ mesures de biréfringence basées sur la technique de modulation de phase dans un champ magnétique est une méthode viable pour détecter l’orientation de bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la possibilité d’enquêter sur les bicelles avec la biréfringence dans des champs magnétiques élevés jusqu'à 35 T a aussi été démontrée par Laura M. et al. ¹³

Lorsque la lumière polarisée entre dans un matériau anisotrope, il va être réfracté dans une vague ordinaire et extraordinaire. ¹¹ les deux ondes ont des vitesses différentes et sont décalés en phase par un retard δ. Le degré de retard δ est mesuré et converti en un signal de biréfringence figure-introduction-5 pour quantifier le degré d’anisotropie dans la matière à l’aide

figure-introduction-6 (2)

où λ est la longueur d’onde du laser et d est l’épaisseur de l’échantillon. Les phospholipides sont optiquement anisotropes et leur axe optique coïncide avec leurs haches longtemps moléculaires, parallèles à la queue d’hydrocarbure. ¹¹ ^, ¹² aucun retard n’est mesuré si les phospholipides sont orientées au hasard dans la solution. Un retard est mesuré lorsque les phospholipides sont alignés parallèlement les uns aux autres. La biréfringence magnétique induite figure-introduction-7 peut avoir un signe positif ou négatif selon l’orientation des molécules dans le champ magnétique ; Voir la Figure 2. Phospholipides alignés parallèlement à l’axe des abscisses donnera lieu à un négatif figure-introduction-8 , même si ces alignés le long de l’axe z positif figure-introduction-9 . Aucun biréfringence n’est observée lorsque l’axe optique coïncide avec la direction de propagation de lumière comme le phospholipide s’aligne parallèlement à l’axe y.

figure-introduction-10
Figure 2 : Alignement des phospholipides et signe correspondant de la biréfringence magnétique induite figure-introduction-11 . Le signe des figure-introduction-12 dépend de l’orientation des phospholipides dans le champ magnétique. Les lignes pointillées indiquent l’axe optique de la molécule. La lumière est polarisée à 45° et se propage dans la direction y. Le champ magnétique B est dans la direction z. Ce chiffre a été modifié par M. Laura. ¹¹ s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans le cas d’une suspension colloïdale isotrope de bicelles, l’orientation induite par l’arrangement des phospholipides dans la bicouche sera perdue, remise à zéro de l’arriération δ. Le bicelles doit également aligner afin d’orienter les phospholipides optiquement actifs dans leurs bicouches, provoquant un retard δ de la lumière polarisée. En conséquence, la biréfringence est un outil sensible pour quantifier l’alignability magnétique des assemblées polymoléculaire. Bicelles alignés perpendiculairement au champ magnétique permettra d’obtenir un positif figure-introduction-13 , tandis que ceux alignés parallèlement donnera un négatif figure-introduction-14 . Le signe dépend de l’alignement de l’installation et peut être vérifié auprès d’un échantillon de référence.

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Protocole

1. procédure fabrication de DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) et DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) polymoléculaire assemblées

Préparations préliminaires
1. Laver toute la verrerie en rinçant une fois avec de l’éthanol stabilisé chloroforme (> 99 % chloroforme) et sécher à l’air comprimé.
2. Produire 2 solutions mères distinctes de 10 mg/mL de DMPC et DMPE-DTPA dans le chloroforme éthanol-stabilisé (> chloroforme de 99 %), une solution 10 mM de Chol-OH dans du chloroforme éthanol-stabilisé (> chloroforme de 99 %) et une solution de TmCl₃ à 10 mM méthanol.
3. Préparer un tampon de phosphate 50 mM à un pH de 7.4 en mélangeant 0,121 g de sodium dihydrate de phosphate monopotassique et 0,599 g de di-sodium anhydre hydrogénophosphate dans 100 mL d’ultrapure H₂O.
Préparation du film lipidique sec
1. Peser les quantités nécessaires d’amphiphiles (DMPC DMPE-DTPA et éventuellement Chol-OH) et Ln^{3 +} stocks solutions en clin d’oeil-tasses en verre séparée 3 mL avec une seringue de verre de 2,5 mL.
  1. Pour un volume d’échantillon de 3 mL de DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (rapport molaire 4:1:1, concentration de lipides totaux de 15 mM), peser en 3,6435 g de la solution mère de DMPC, 1,4731 g de la solution mère de DMPE-DTPA et 0,7126 g de la solution mère de TmCl₃ .
  2. Pour un volume d’échantillon de 3 mL de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5, concentration de lipides totaux de 15 mM), pèsent en 2,9148 g de la solution mère de DMPC, 1,4731 g de la solution mère de DMPE-DTPA, 1,0749 g de solution mère de Chol-OH et 0,7126 g de la solution₃ TmCl.
    ATTENTION : Chloroforme / méthanol sont toxiques et volatils à la température ambiante. Travailler sous une hotte aspirante et rapidement aller de l’avant avec les mesures de masse.
2. Transférer le contenu des coupes-clin d’oeil à un 25 mL ballon à fond rond. Rincer chaque snap-tasse dans le ballon à fond rond avec environ 2,5 mL du solvant correspondant.
3. Éliminer le solvant sous vide dans un évaporateur rotatif à 40 ° C. Réglez la pression initiale à 30 000 Pa jusqu'à ce que la majeure partie du solvant est supprimé. Réduire la pression à 100 Pa et sécher l’échantillon en vertu de la rotation pour un minimum de 2 h. obtiennent un film uniforme sec lipidiques sur les parois de verre du flacon.
4. Placez le film lipidique sec pendant une minute sous un flux régulier d’argon pour éviter l’oxydation des lipides dans l’air et conserver l’échantillon dans le congélateur avant de réhydratation.
Hydratation du film lipidique sec
1. Ajouter les 3 mL de tampon phosphate au ballon pour atteindre une concentration de lipides totaux de 15 mM.
2. Effectuer un cycle de gel-dégel (FT) en plongeant la fiole sous rotation dans l’azote liquide jusqu'à ce qu’il est complètement gelé (les butées d’azote liquide bouillant), puis chauffer jusqu'à 60 ° C en arrière en plaçant l’échantillon pendant 5 min dans un bain d’eau, agitant en permanence et du ballon le processus de fusion de l’aide. Appliquer 30 s de vortex avant chaque cycle de congélation lorsque l’échantillon est liquide à l’aide de l’hydratation du film lipidique.
  Remarque : Aucun film lipidique ne doit être visible sur les murs de la fiole après le deuxième gel dégel cycle.
3. 1.3.2 le répète cinq fois au total. Refermer le flacon avec un bouchon pour éviter l’évaporation inutile du tampon phosphate lorsque l’échantillon est chaud. Le protocole peut être suspendu lorsque l’échantillon est congelé.
4. Procéder à deux de chauffage et de refroidissement (H & C) cycles pour stabiliser l’échantillon qui sort de la dernière étape de congélation, ou garder congelé pendant deux mois. Chauffer l’échantillon à 40 ou 60 ° C pour DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5), respectivement, avant refroidissement à 5 ° C à 1 ° C/min. maintenir l’échantillon 5 min au maximum et minimum températures du cycle.
5. Maintenant, soit déterminer le signal de la biréfringence de l’échantillon dans un champ magnétique externe (étape 2) ou encore extraire l’échantillon afin d’adapter les dimensions de bicelle et magnétique alignability (étape 1.4).
  Remarque : DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) échantillons sont composées principalement de bicelles avec un diamètre moyen hydrodynamique D_H de 70 nm telle que révélée par une distribution numéro obtenu à partir des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) à 5 ° C. Ces échantillons contiennent aussi de grandes assemblées de polymoléculaire avec une moyenne D_H de 500 nm, telle que révélée par une répartition de l’intensité. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) échantillons sont hautement polydispersés en taille avec des distributions d’intensité typique révélant une moyenne D_H de 700 nm, tandis que les distributions numéros révèlent une population dominée par petites bicelles dans la gamme de taille de 200 nm. Les distributions de taille plus détaillées et cryo images de microscopie électronique de transmission de ces échantillons ont été rapportés par Isabettini et al. ²³
Extrusion des assemblées polymoléculaire.
1. Assembler l’extrudeuse tel qu’illustré à la Figure 3. Utiliser des gants et pincettes avec protection des tubes de silice pour la manutention. Mouiller le filtre en papier (5) avec quelques gouttes de tampon pour permettre un positionnement optimal de la membrane filtrante (6). Assurez-vous que le papier n’a aucun pli après avoir placé le joint torique (7) sur le dessus.
  Remarque : Le processus d’extrusion a été testé sur membranes filtrantes (6) avec un diamètre de pore de 800, 400, 200 et 100 nm ; Voir la Figure 7.
2. Mettre au bain-marie à 40 ° C pendant DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) échantillons ou 60 ° C pour les échantillons de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) afin de garantir la formation de vésicules extrudable.
3. Connecter l’extrudeuse à une bouteille d’azote sous pression à l’aide d’un tube de PVC haute pression (> 4 MPa) équipés d’adaptateurs serto et extraire le matériau liquid à travers la membrane. 1 MPa de pression est habituellement exigé pour l’extrusion à travers des filtres de membrane (6) de diamètre de pore de 200 nm et ci-dessus. 1,5 à 2,5 MPa sont tenus pour les plus petites membranes filtrantes (6) avec un diamètre de pore de 100 nm.
  Remarque : Changer le filtre à membrane si anormalement hautes pressions (> 2,5 MPa) sont nécessaires pour extraire l’échantillon (c’est le premier signe de colmatage).
4. Ouvrez le couvercle (10) et insérez l’échantillon à l’aide d’une pipette de verre de 2 mL. Ensuite, fermez le couvercle (10) et ouvrir la soupape de pression (12) tout en tenant le tube de sortie de l’échantillon (2). Fermer la valve de pression (12) à la fin du cycle de l’extrusion, évent et continuer avec le prochain cycle.
  Remarque : Ne pas laisser l’échantillon en contact trop longtemps avec le navire chemisé chaud (8) pour éviter la perte excessive d’échantillon par évaporation.

30-60 s est assez de temps pour un échantillon de 3 mL de s’équilibrer dans l’extrudeuse avant d’ouvrir la valve de pression (12).

Passez à 10 cycles d’extrusion pour une dimension de pores membranaires donné tel qu’illustré à la Figure 3. La plupart des systèmes bicelle est extrudée 10 fois à travers des membranes de diamètre de pore de 200 et un autre 10 fois à travers des membranes de diamètre de pore de 100 nm, garantir la comparabilité de l’échantillon.

Maintenant, déterminez le signal de la biréfringence de l’échantillon dans un champ magnétique externe (étape 2).

figure-protocol-1
Figure 3 : extrudeuse de laboratoire utilisé pour les préparations de bicelle et vésicule. L’extrudeuse est Assemblée à partir du bas vers le haut : Mont (1), (2) échantillon collectant l’espace avec un tube de sortie en plastique de 2,4 mm (diamètre intérieur) et joint torique (3) et (4) grandes et petites mailles stabilisante, (5) filtre en papier, filtres à membranes (6), joint torique (7) (8) chemisé pour bateau, (9. ) haut de la page couverture avec connexion d’entrée et de pression, soupape de pression (12) (10) de la couverture, vis papillon (11). Une esquisse de l’extrudeuse assemblé est illustrée de la droite côté. L’azote gazeux (N₂) est alimenté par un réservoir sous pression et le navire chemisé (9) est connecté à un bain d’eau pour contrôler la température. L’échantillon est soumis à 10 cycles d’extrusion pour n’importe quel diamètre de pore de filtre de membrane donnée (trajectoire en bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. mesures biréfringence de DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) et DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) polymoléculaire assemblées.

Construire et raccorder l’installation de biréfringence telle que présentée dans la Figure 4 et alimenter les éléments électroniques respectifs. Ne placez pas le PEM, l’échantillon et le second polariseur dans le chemin d’accès de laser à ce stade. Éviter la détection de la lumière de laser dos diffusée en recouvrant les surfaces réfléchissantes, par exemple en aluminium supports de miroir, avec papier noir.
Régler les miroirs afin de maximiser l’intensité du laser dans le détecteur, qui est représenté par l’intensité du courant continu provenant du filtre passe-bas dans la Figure 4 b.
ATTENTION : Porter une protection oculaire appropriée lorsque vous ajustez les miroirs et de consulter avec un instructeur de sécurité laser si la manipulation des lasers pour la première fois.
Tournez le premier polariseur linéaire croisé (maintenu perpendiculaire au faisceau laser incident) afin de maximiser le .

figure-protocol-4
Figure 4 : représentation schématique de l’installation de la biréfringence et les connexions pour les signaux optiques. A) un électro-aimant supraconducteur fournit un champ de magnétique 5,5 T. La lumière émise par une diode laser 635 nm est polarisée par deux polariseurs croisés. Un modulateur de photoélasticité PEM-90 fonctionne à 50 KHz avec une amplitude₀ de rad 2,405 et placé entre les deux polariseurs. L’exemple se trouve dans l’aimant entre le PEM et le second polariseur. Miroirs non polarisant guider la lumière à travers les différents éléments et est finalement détectée par un photodétecteur. La première et la deuxième harmonique figure-protocol-5 et figure-protocol-6 du signal AC sont surveillés, permettant le calcul du signal biréfringence donnant des informations sur l’alignability magnétique de la Ln^{3 +} polymoléculaire assemblées de chélation. La cupule de l’échantillon est connectée à un bain d’eau externe pour contrôle de la température (en bleu). La température de l’échantillon est contrôlée avec une sonde de température (rouge). B) le signal du détecteur photo est alimenté en deuxième filtre passe-bas ordre Sallen-Key (24 alimentation V AC) avec une fréquence de coupure de 360 Hz à travers un câble braded d’alimentation ±12 VDC (3). Le filtre passe-bas extrait la composante DC figure-protocol-7 et il fournit à l’interface PC (4) par un câble BNC 50 en Ω. Le signal du détecteur photo est livré aux deux verrous amplificateurs (qui extrait la première et la deuxième harmonique figure-protocol-8 et figure-protocol-9 ) par un câble Ω BNC 50 (1) & (2). Les intensités harmoniques sont détectées par un sensible à la phase de détection. Par conséquent, le signal PEM est utilisé comme signal de référence pour les amplificateurs de lock-in (1f-sortie de la PEM dans le premier amplificateur à verrouillage et 2f-sorties dans la seconde, avec BNC 50 Ω câbles raccordés). Les signaux de sortie sont envoyées à l’unité d’interface PC par des câbles BNC 50 Ω. Unités d’acquisition analogique cFP-AI-110 et cFP-CB-1 numériser le signal qui est transmis à l’ordinateur via un câble RS 232 pour la surveillance. La sonde de température de type K est également reliée à l’unité d’interface PC où les unités d’acquisition analogique cFP-CB-3 et cFP-TC-120 numériser le signal avant de transférer à l’ordinateur via un câble RS 232 pour la surveillance. C) photo de l’installation schéma présentée dans B. principaux éléments sont identifiés avec les numéros de 1 à 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Placez le deuxième polariseur linéaire croisé perpendiculaire au faisceau laser incident, tel qu’illustré dans la Figure 4 a. Réduire au minimum la en définissant le deuxième polariseur à un angle de 90° par rapport à la première.
Place le modulateur de photoélasticité (PEM) à 0° entre les deux polariseurs linéaires croisées et perpendiculaire au faisceau laser incident tel qu’illustré dans la Figure 4 a. Ajuster le PEM à une fréquence de 50 kHz et d’amplitude A0 à 2,405 rad comme illustré à la Figure 5 a. Ce qui rend le composant DC indépendant de biréfringence et stimule le .
Remarque : L’axe optique de la PEM peut être à l’écoute de quelques degrés pour maintenir une constante dans l’air avant de mesurer n’importe quel échantillon.
Attendre 1 h après avoir allumé le laser et les équipements électroniques pour stabiliser le signal.

Le signal est stable une fois que l’auto-abandon progressif de l’amplificateur de lock-in reste constante.

Placer l’échantillon dans une cuvette de quartz à température contrôlée avec une longueur de chemin d’accès de 10 mm et connectez-le à un bain d’eau externe initialement fixé à 5 ° C.

Placez un thermocouple de type épais K de 0,5 mm (sonde de température) directement dans l’échantillon pour surveiller la température de l’échantillon. Vérifier que la sonde n’interfère pas avec la lumière laser en plaçant un livre blanc dans le chemin de laser (après la cupule) et à la recherche d’ombre causée par la sonde.
Remarque : Il y a une différence de 2-3 ° C entre l’enregistrement de la température de l’eau du bain et de la température de l’échantillon.

Placer la cuve dans l’alésage de l’aimant, comme illustré à la Figure 4 a. La lumière laser se propage horizontalement à travers l’échantillon, est déviée par les miroirs non polarisant et détectée par un photodétecteur.
Remarque : Le laser est dirigé vers le bas, par le biais de l’échantillon et de sauvegarder le même chemin pour tenir compte des effets de Faraday (c'est-à-dire la rotation de l’avion de polarisation de la lumière causée par le champ magnétique lorsque descendant est annulée lors de son retour dans le sens inverse).

Appliquer un flux constant d’air comprimé à température ambiante et 10000 Pa sur la cuvette pour éviter la condensation d’eau sur les parois cellulaires, ce qui réduirait l’intensité du signal et augmenter le bruit. Ceci est particulièrement important lors de la mesure à 5 ° C.

Détecter la première et la deuxième harmonique figure-protocol-13

du signal AC avec deux amplificateurs de lock-in. Auto les amplificateurs de verrouillage de phase en appuyant sur la touche (2) illustré à la Figure 5 b et ajuster la sensibilité comme le montre la Figure 5 b (1). Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de quatre barres rouges sur les amplificateurs comme illustré à la Figure 5 b (3) pour éviter la surcharge du signal. Notez la sensibilité indépendant pour deux amplificateurs de blocage dans le programme Tesla_Magnet_Const_V092 comme illustré dans la Figure 5 (8). Le programme est fourni à titre d’information complémentaire.

Rampe du champ magnétique jusqu'à 5,5 T en fournissant le courant à l’aimant à travers le programme Tesla_Magnet_Const_V092 , comme illustré à la Figure 5 (5).

Obtenir la biréfringence figure-protocol-15

utilisant l’équation 2, où le retard est calculé avec
figure-protocol-16

(3)
où

sont des fonctions de Bessel de première espèce, avec figure-protocol-19

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, ³⁴ tracer le retard dans le programme Tesla_Magnet_Const_V092, comme illustré à la Figure 5 (4).
NOTE : Le retard prévu par le programme ne doit pas être utilisé pour calculer le signal de la biréfringence, si les deux amplificateurs de blocage ne fonctionnent pas à la même sensibilité (Voir l’étape 2.12). Les intensités harmoniques connectées figure-protocol-21

doivent être multipliées par la sensibilité des amplificateurs de blocage pour obtenir les bonnes dimensions. En outre, le signal de biréfringence mesuré dans un champ magnétique doit être normalisé en soustrayant le signal de biréfringence moyen obtenu à 0 T.

Surveiller le signal de biréfringence de l’échantillon à une constante ou changement de température (1 ° C/min) de régulation de la température de l’eau du bain reliée à la cuvette, illustrée à la Figure 4.

Connecter les données expérimentales en remplissant la description expérimentale dans la Figure 5 (8), en fournissant un nom de fichier (9) et en appuyant sur le bouton « START log » (10).

figure-protocol-23
Figure 5 : Illustrations des paramètres indépendants et des captures d’écran du programme. A) paramètres de PEM : un retard 2,405 rad, longueur d’onde de 635 nm, fréquence 50 Hz. White cercles indiquent quels paramètres à activer (USR = retard définies par l’utilisateur, LOC = mode d’opération local). B) Lock-in réglages de l’amplificateur. La sensibilité (1) doit être sélectionné avant chaque mesure conformément à l’étape 2.11. Il faudrait pas plus de quatre barres rouges sur l’écran (3) pour éviter une surcharge du signal. Une surcharge se produit lorsque le voyant (1) rouge s’allume, la mesure impossible. Appuyez sur la touche de phase d’auto (2) avant chaque mesure. C) captures d’écran du programme Tesla_Magnet_Const_V092 à titre de renseignement complémentaire. Le programme permet le contrôle du champ magnétique et l’enregistrement de toutes les sorties de la signalisation en fonction du temps. L’intensité du champ magnétique et la température de l’échantillon sont restituées en (1). La première et la deuxième harmonique figure-protocol-24 et figure-protocol-25 du signal AC mesuré par les deux amplificateurs de blocage sont restituées en (2). L’intensité du courant continu figure-protocol-26 est tracée en (3). Le retard est calculé comme indiqué au point 2.13 et tracé dans (4). L’intensité du champ magnétique se trouve dans (5). La mesure directe de la température enregistrée par le thermocouple de Type K est présentée en (6) et les signaux de sortie ( figure-protocol-27 et figure-protocol-28 ) (7). Exemples supplémentaires d’informations peuvent être insérées (8) telles que la sensibilité indépendant des amplificateurs, nom de l’échantillon, etc.. Les données peuvent être exploitées et exportées vers un fichier .txt fourni (9). Démarrer et arrêter la collecte de données avec la touche « START log » (10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Le signal de la biréfringence d’un non extrudé DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) échantillon a été suivie sous champ magnétique 5,5 T pendant un chauffage et de refroidissement cycle de 5 à 40 ° C et à une vitesse de 1 ° C/min (Figure 6). Les résultats de la biréfringence ont confirmé des alignements magnétiques élevés à 5 ° C avec une valeur de 1,5 x de 10^-5, deux fois aussi forte en ce qui concerne les systèmes extrudés sign...

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Discussion

Un compte rendu détaillé de comment biréfringence mesures ont été utilisées en combinaison avec SANS expériences pour évaluer des méthodes pour la génération hautement magnétiquement sensibles Ln^{3 +}chélateurs phospholipides ensembles est en Isabettini et al. ²³ les protocoles de fabrication proposées sont également applicables pour les assemblys composés des phospholipides DPPC et DPPE-DTPA plus longtemps ou pour ceux contenant des dérivés de stéroïdes chimiquement modifiées d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent la Swiss National Science Foundation pour financement SMhardBi (numéro de projet 200021_150088/1). SANS expériences ont été effectuées à la source de neutrons de spallation Suisse SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suisse. Les auteurs remercient chaleureusement le Dr. Joachim Kohlbrecher pour ses conseils avec les expériences SANS. L’installation de mesure de la biréfringence sous des champs magnétiques élevés a été inspirée de la configuration existante au haut champ magnétique laboratoire HFML, Nijmegen, Pays-Bas. Nous remercions Bruno Pfister pour son aide dans le développement de l’électronique de l’installation de la biréfringence, Jan Corsano et Daniel Kiechl pour construire les cadres permettant un alignement fin et facile du laser et Dr. Bernhard Koller pour soutien technique continu.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn--glycéro-3-phospho-éthanolamine-diéthylène triaminepentaacétate d’acide sel d’hexammonium (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99 %
Chlorure de thulium(III)	Sigma-Aldrich	439649	anhydre, poudre, 99,9 % à base d’oligo-métaux
Chlorure de dysprosium(III)	Sigma-Aldrich	325546	anhydre, poudre, 99,9 % d’oligo-métaux à base
chlorure d’ytterbium(III)	Sigma-Aldrich 439614		anhydre, poudre, 99,9 % à base d’oligo-métaux
Chloroforme	Sigma-Aldrich	319988	contient de l’éthanol comme stabilisant, réactif ACS, etc. ; 99.8 %
Méthanol	Sigma-Aldrich	34860	&ge ; 99,9 %
Cholestérol	Amresco	433	Qualité ultra pure
D2O	ARMAR chemicals	1410	99,8 atome % D Eau
ultrapure	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
pH-mètre électronique	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtre à membrane	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm	filtre à membrane VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm	filtre à membrane VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm	filtre VWR	515-2032
Whatmann Papier filtre	VWR	230600
25 ml flacon à fond rond	VWR	201-1352	14/23 NS
Mousqueton en verre de 3 ml	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Seringue en verre de 2,5 ml	Hamilton
Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté	Merk	1.06342	Sel utilisé pour fabriquer un tampon phosphate
di-Phosphate hydrogénésique sodique	Merk	1.06586	Sel utilisé pour fabriquer un tampon phosphate
Azote liquide	Carbagas	-
Azote gazeux sous pression	Carbagas-Bouteille		de 200 bar
Extrudeur de lipides 10 ml	Lipex-Entièrement		équipé d’un thermobaril
Tube en PVC haute pression	GR NETUM-doit		résister à plus de 4 MPa
Adaptateurs Serto Gants	Sertot-Nitrile
	VWR-2
ml pipettes	en verreVWR	612-1702	230 mm de long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Amplificateur Lock-In Dual Phase		SRS SRS SR830
Détecteur de photodiodes	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, silicium, photoconducteur
5,5 T Cryogénique Magnétique	Cryogénique/Oerlikon AG12		bar refroidi par lui. Compresseur RW4000/6000, RGD 5/100 TA tête cryogénique
Filtre passe-bas de second ordre	fait	maison-Alimentation	linéaire 24V DC, second ordre, clé Sallen, fréquence de coupure 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Modulateur photoélastique	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polariseur	Newport	10GT04	25.4mm de diamètre
Cuvette d’échantillons de quartz	Hellma	165-10-40	Cellule à température contrôlée, 0,8 ml, longueur de trajet de 10 mm
Sonde de température	Thermocontrol-Type		K, 0,5 mm de diamètre, Thermocoax
Miroirs non polarisants	Newport	50326-1002	de 25,4 mm
	National Instruments	189284-02	Pour la connexion au port RS-232 à l’avant des contrôleurs FieldPoint compacts
BNC 50 et Omega ; Câbles et connecteurs	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Module d’entrée analogique de tension et de courant à 8 voies pour Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Bloc de connexion intégré pour le câblage d’E/S Compact FieldPoint
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Bloc de connexion isotherme intégré pour le câblage de thermocouples au module cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	Module d’entrée de thermocouple 8 voies pour FieldPoint
compact cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interface Ethernet/série pour NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Alimentation
industrielle alimentation	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Bain-marie	Julabo	FP40-HE	Circulateur réfrigéré/chauffant

de Câbles RS 232

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Assemblages magn tiques extrusion lipidique bicelles dop es au DMPC DMPE DTPA et cholest rol alignement par champ magn tique formation de pr curseurs de v sicules assemblage temp rature contr l e conception d assemblages polymol culaires

Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation