Phthalic Acid Ester-liaison ADN aptamère sélection, caractérisation et Application d’un Aptasensor électrochimique

Résumé

Un protocole de sélection de in vitro et la caractérisation de l’acide phtalique spécifique au groupe ester-liaison ADN aptamères est présenté. L’application de l’aptamère sélectionné dans un aptasensor électrochimique est également incluse.

Résumé

Phthalic acid esters (PAEs) areone des grands groupes de polluants organiques persistants. La détection de groupes spécifiques de PAEs est hautement souhaitée en raison de la croissance rapide des congénères. Aptamères ADN ont été appliquées de plus en plus en tant qu’éléments de reconnaissance sur les plates-formes de biocapteur, mais en sélectionnant aptamères pour atteindre les cibles hautement hydrophobes de petites molécules, telles que PAEs, sont rarement rapporté. Cet ouvrage décrit une méthode axée sur le talon conçue pour sélectionner les aptamères ADN spécifiques à un groupe de PAEs. Le groupement aminé fonctionnalisé phtalate de dibutyle (DBP-NH₂) comme la cible de l’ancre a été synthétisée et immobilisée sur les perles de l’agarose époxy-activé, permettant d’afficher le groupe ester phtalique à la surface de la matrice de l’immobilisation, et par conséquent, le choix des liants spécifiques à un groupe. Nous avons déterminé les constantes de dissociation des candidats aptamère par réaction en chaîne de polymérisation quantitative couplée avec séparation magnétique. Les affinités relatives et la sélectivité des aptamères à autres PAEs ont été déterminées par les essais concurrentiels, où les candidats aptamère ont été préalablement délimitées à la DBP-NH₂ attaché billes magnétiques et rejetés dans le surnageant après incubation avec la PAEs testée ou autres substances interférentes potentiels. L’analyse concurrentielle a été appliquée parce qu’il a fourni une comparaison facile affinité entre PAEs qui n’avait aucun groupes fonctionnels pour l’immobilisation de la surface. Enfin, nous avons démontré la fabrication d’un aptasensor électrochimique et utilisé pour détection ultrasensible et sélective de phtalate de 2-éthylhexyle. Ce protocole prévoit des idées pour la découverte d’aptamère d’autres petites molécules hydrophobes.

Introduction

Ainsi que le développement économique rapide, accélération de l’industrialisation et la construction urbaine, pollution de l’environnement est plus sévère que jamais. Les polluants environnementaux typiques comprennent les ions de métaux lourds, toxines, antibiotiques, pesticides, perturbateurs endocriniens et les polluants organiques persistants (POP). En plus des ions métalliques et des toxines, autres polluants sont de petites molécules qui sont souvent constituées d’une variété de congénères. Par exemple, la pop plus toxiques comprennent des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les éthers biphényles polybromés (PBDE), des polychlorodibenzo-p-dioxines (PC....

Protocole

1. Bibliothèque et de conception d’amorce et de synthèse

1. Concevoir la bibliothèque initiale et les amorces.
   Bibliothèque (piscine₀) : 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   Avant l’amorce (FP) : 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   Phosphorylée apprêt inverse (PO₄- RP) : 5'-PO₄- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. Synthétiser la piscine₀, FP et PO₄- RP en utilisant le standard phosphoramidite chimie^18,19,20et purifier tous les ADN par standard chromatographie liquide haute performance....

Résultats

Nous avons conçu et synthétisé le groupement aminé fonctionnalisé de phtalate de dibutyle (DBP-NH₂) comme cible d’ancrage (Figure 1F). Ensuite, nous avons effectué la sélection d’aptamère ADN du PAEs à l’aide de DBP-NH₂ comme la cible de l’ancre et en suivant la méthode axée sur l’immobilisation de cible classique (Figure 2). À chaque tour, un pilote PCR a été réalisée à l’aide de la PAGE dénaturée afin d’op.......

Discussion

Un des avantages exceptionnels d’aptamères sont qu’ils sont identifiés par le biais de la méthode in vitro SELEX, tandis que les anticorps sont générés via in vivo immunoreactions. Par conséquent, aptamères sont sélectionnables avec spécificité de cible souhaitée dans des conditions expérimentales bien conçues, alors que les anticorps se limitent aux conditions physiologiques.

Pour faciliter la séparation des séquences liées des séquences gratuits, SELEX modifié plusieurs ont.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
UV-2550	Protocole Shimadzu, Japon		, section 3.8.2
Thermocycleur d’ADN Engnine, PTC0200	BIO-RAD		section 3.5.1.2 et 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		section 5.3.6 et 6.3
VMP3 Potentiostat multicanal	Bio-Logic Science, Claix, France		section 7.4, 7.8 et 7.11
Sepharose 6B	activé par l’époxyGE Healthcare (Piscataway, NJ, États-Unis)	10220020	billes d’argarose, section 2.3 et 3.3
Dynabeads M-270 billes magnétiques à acide carboxylique	Invitrogen, États-Unis	420420	section 5.2. et 5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara, Dalian, Chine	R028A	polymérase, section 3.5.1.1
PARAFILM Membrane d’étanchéité	Bemis, États-Unis	PM-996	section 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, États-Unis	EN0561	section3.7.1.2.Le tampon de réaction 10 × est fourni avec l’exonucléase &lambda ; par le fournisseur.
Dr. GenTLE Support de précipitation	Takara, Dalian, Chine	9094	section 3.6.2 et 3.8.1
UNIQ-10 PAGE Kit de récupération d’ADN	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	section 4.2
SYBR Gold colorant de gel d’acide nucléique	Invitrogen, États-Unis	1811838	colorant d’acide nucelique, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara, Dalian, Chine	RR820A	mélange de polymérase contenant de la polymérase et des dNTP, section 5.3.5
Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)	Sigma-Aldrich	CAS : 1132-61-2	section 5.2.1
1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) chlorhydrate de carbodiimide (EDC)	Invitrogen, USA	CAS : 25952-53-8	section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)	Sigma-Aldrich	CAS : 1633-78-9	section 7.7
Électrode d’or	Shanghai Chenhua	CHI101	section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS : 51805-45-9	section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	CAS : 651042-82-9	section 7.7
phtalate de diéthylhexyle (DEHP)	Institut national de métrologie, Chine	CAS : 117-81-7	section 7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS : 9005-64-5	polyoxyéthy-lène(20) monolaurate de sorbaitan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS : 9002-93-1	agent tensioactif non ionique
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	10 mM tampon phosphate contenant 1 M de NaCl, pH 7,4

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