Article de méthode

Création d’un modèle géométrique structurellement réaliste par éléments finis d’un Cardiomyocyte pour étudier le rôle de l’Architecture cellulaire en biologie des systèmes Cardiomyocyte

DOI :

10.3791/56817

⸱

18 avril 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour créer un modèle par éléments finis spatialement détaillée de l’architecture intracellulaire des cardiomyocytes de microscopie électronique et d’images de microscopie confocale. La puissance de ce modèle dans l’espace détaillé est démontrée à l’aide d’études de cas en signalisation calcique et la bioénergétique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avec l’avènement des trois dimensions (3D) technologies d’imagerie telles que la tomographie électronique, serial-îlot balayage, microscopie confocale, microscopie électronique et la communauté scientifique a accès sans précédent aux grands ensembles de données au micromètre sous résolution qui caractérisent le remodelage architectural qui accompagne les changements dans la fonction cardiomyocyte sain ou malade. Cependant, ces ensembles de données ont été sous-utilisées pour enquêter sur le rôle de l’architecture cellulaire se transformant en fonction du cardiomyocyte. Ce protocole vise à décrire comment créer un modèle par éléments finis précis d’un cardiomyocyte à l’aide de la microscopie électronique à haute résolution et des images de microscopie confocale. Un modèle détaillé et précis de l’architecture cellulaire a un potentiel important d’offrir de nouvelles perspectives sur la biologie du cardiomyocyte, plus que peuvent recueillir des expériences seuls. La puissance de cette méthode réside dans sa capacité à fusionner des informations provenant des deux modalités d’imagerie disparates de l’ultrastructure du cardiomyocyte pour développer un modèle unifié et détaillé de la cardiomyocyte. Ce protocole décrit les étapes pour intégrer la tomographie électronique et des images de microscopie confocale de cardiomyocytes mâles adultes de rat Wistar (nom d’une race spécifique de rat albinos) d’élaborer un modèle de moitié-sarcomère par éléments finis de la cardiomyocyte. La procédure génère un modèle éléments finis 3D qui contient une description précise, haute résolution (sur l’ordre de ~ 35 nm) de la distribution des mitochondries, des myofibrilles et des grappes de récepteurs de la ryanodine qui libèrent du calcium nécessaire pour cardiomyocyte contraction du réseau réticulaire sarcoplasmique (SR) dans le myofibrillaire et le compartiment cytosolique. Le modèle généré ici comme une illustration n’intègre pas les détails de l’architecture de tubules transverses ou le réseau réticulaire sarcoplasmique et est donc un modèle minimal de la cardiomyocyte. Néanmoins, le modèle peut déjà s’appliquer dans les enquêtes basées sur des simulations dans le rôle de structure cellulaire en bioénergétique de signalisation et mitochondrial calcium, qui est illustrée et discutées à l’aide de deux études de cas qui se présentent après la Protocole détaillé.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Couplage excitation-contraction (ECC) dans le coeur se réfère à l’important et complexe de couplage entre l’excitation électrique de la membrane du cardiomyocyte et la contraction mécanique ultérieure de la cellule au cours de chaque battement cardiaque. Des modèles mathématiques ont joué un rôle clé dans le développement d’une compréhension quantitative des processus biochimiques liées entre elles qui régulent le potentiel d’action1, calcium cytosolique,2,3de bioénergétique, de signalisation et suivantes génération de la force contractile. Ces modèles ont prédit avec succès les changements de la fréquence cardiaque quand on ou plusieurs de ces processus biochimiques subissent des altérations4,5. L’ultrastructure très organisés de la cardiomyocyte reconnue plus en plus à jouer un rôle essentiel dans la fonction contractile normale de la cellule et le coeur entier. En effet, les modifications de la morphologie et l’Organisation des composantes de l’ultrastructure cardiaque surviennent parallèlement aux changements biochimiques de pathologies telles que l’hypertrophie6, insuffisance cardiaque7et8de la cardiomyopathie diabétique. Si ces changements structurels sont mineures, adaptatives ou pathologiques des réponses à l’évolution des conditions biochimiques est encore largement inconnue9. L’accouplement intrinsèquement étroit entre forme et fonction en biologie signifie que des études expérimentales ne peuvent fournir des idées plus profondes que les corrélations entre remodelage structural et fonction cardiomyocyte. Une nouvelle génération de modèles mathématiques qui peuvent incorporer l’ensemble structurel des composants subcellulaires, ainsi que les processus biochimiques bien étudiés, sont nécessaires pour développer une compréhension globale et quantitative de la relation entre la structure, la biochimie et la force contractile dans les cardiomyocytes. Ce protocole décrit les méthodes qui peuvent être utilisées pour produire des modèles d’éléments finis structurellement précis des cardiomyocytes qui peut être utilisés pour de telles enquêtes.

La dernière décennie a connu des avancées significatives en microscopie 3D10, confocale11et Super-résolution microscopie12 qui donnent un aperçu sans précédent, à haute résolution de l’Assemblée-l’échelle du nanomètre et micro-échelle de la composants subcellulaires du cardiomyocyte. Récemment, ces ensembles de données ont été utilisés pour générer des modèles de calcul du cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. Ces modèles utilisent une méthode de simulation technique bien établie, appelée la méthode des éléments finis17, pour créer des éléments finis computational mailles sur lequel les processus biochimiques et les cardiomyocytes des contractions peuvent être simulées. Cependant, ces modèles sont limités par la résolution et les détails qu’une méthode de microscopie peut fournir dans un ensemble de données image. Par exemple, la microscopie électronique peut générer nanomètre-niveau de détail de la structure cellulaire, mais il est difficile d’identifier des protéines spécifiques au sein de l’image qui serait nécessaire pour créer un modèle. En revanche, la microscopie optique Super-résolution peut fournir des images à fort contraste avec des résolutions sur l’ordre de 50 nm de seulement un choisir quelques moléculaire les composants de la cellule. Seulement en intégrant des informations complémentaires de ces modalités d’imagerie peut on Explorer avec réalisme la sensibilité de la fonction de changements dans la structure. Microscopie corrélative photonique et électronique n’est toujours pas une procédure de routine et il souffrirait toujours la limitation que seulement un nombre limité de composants puisse être teinté dans la vue de l’immunofluorescence et en corrélation avec la vue au microscope électronique.

Ce protocole présente une nouvelle approche de18 qui utilise des méthodes statistiques19 pour analyser et par le calcul fusible microscopie photonique informations sur la distribution spatiale des canaux ioniques avec des microscopes sur autre cardiaque composants de l’ultrastructure, tels que les mitochondries et les myofibrilles. Ceci produit un modèle éléments finis qui peut être utilisé avec les modèles biophysiques des processus biochimiques d’étudier le rôle d’organisation subcellulaire cardiomyocyte sur les processus biochimiques qui régulent la contraction cardiomyocyte. Par exemple, ce protocole pourrait être utilisé pour créer des modèles de bonne santé et les myocytes cardiaques diabétique par streptozotocine pour étudier les effets du remodelage structural sur la fonction des cellules cardiaques qui est observée chez l’animal diabétique modèles8. Un autre avantage de la nature statistique de la méthode présentée est également illustré dans le protocole : la méthode peut générer plusieurs instances des géométries d’éléments finis qui imitent les variations observées expérimentalement dans la structure cellulaire.

Comme un aperçu, les étapes du protocole comprennent : (i) préparation du tissu cardiaque pour la microscopie électronique générer des images 3D avec suffisamment de résolution et de contraste ; (ii) la reconstruction et la segmentation des piles 3D image de microscopie électronique de données à l’aide d’une reconstruction 3D de la microscopie et analyse d’images logiciel appelé IMOD20; (iii) l’utilisation d’iso2mesh21 pour générer un maillage éléments finis en utilisant les données segmentées comme entrée ; (iv) en utilisant les codes et un nouvel algorithme pour cartographier la distribution des canaux ioniques sur le maillage éléments finis.

Le principe de l’approche de chaque étape est décrite dans le protocole, et les résultats représentatifs sont fournis dans les figures qui l’accompagne. Une vue d’ensemble est exposé précisant comment les modèles spatialement détaillés générés peuvent servir à étudier les dynamiques spatiales de calcium durant ECC, ainsi que bioénergétique mitochondriale. Certaines des limites actuelles du protocole sont discutés, ainsi que les nouveautés qui sont en cours pour y remédier et de favoriser une compréhension quantitative du rôle de la structure cellulaire de biologie des systèmes cardiaque. Comment ces méthodes puissent être généralisés pour créer des modèles d’éléments finis d’autres types de cellules sont également abordé.

Les utilisateurs du présent protocole peuvent ignorer étape 1 et la partie de la reconstruction de l’étape 2 s’ils ont accès à une pile d’image au microscope électronique préexistants. Les utilisateurs qui ont l’intention d’acquérir leurs données en collaboration avec les plus expérimentés électrons microscopistes voudra discuter et comparer la fixation et les méthodes de coloration à l’étape 1 avec l’expert afin de déterminer un protocole optimal pour l’acquisition.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université d’Auckland Animal Ethics Committee et la University of California San Diego Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme, où le protocole de tissus a été développé à l’origine.

1. préparation expérimentale

  1. Préparer les solutions de 0,15 M et 0,3 M sodium cacodylate tampons à pH 7,4 selon le tableau 1.
  2. Préparer le fixateur de glutaraldéhyde (glutaraldéhyde à 2,5 %, 2 % de paraformaldéhyde (PFA) + 0,2 % l’acide tannique dans le tampon de cacodylate de sodium de 0,15 M à pH 7,4) à l’aide de composants énumérés au tableau 1.
    1. Dissoudre 2 g de poudre PFA dans 20 mL d’eau distillée à 60 ° C sur une plaque de cuisson en remuant constamment.
    2. Ajouter la solution de NaOH 1 M jusqu'à ce que la solution est claire.
    3. Attendez que la température de la solution est inférieure à 40 ° C, puis ajouter 10 mL de glutaraldéhyde et 20 mL de cacodylate de sodium 0,3 M.
    4. Ajouter 0,2 g d’acide tannique et dissoudre dans la solution.
    5. Ajouter 50 mL de cacodylate de sodium 0.15 M.
    6. Stocker les trois ou quatre flacons de scintillation de 20 mL de fixateur au réfrigérateur à 4 ° C, ou sur la glace si utilisé le jour même.
  3. Préparer une solution de Tyrode avec 20 mM 2, 3-butanedione monoxime (BDM), selon la recette dans le tableau 1.
  4. Construire un appareil de Langendorff à l’intérieur d’une hotte.
    1. Fixez deux tubes de seringue en plastique de 100 mL à deux cornue différents stands, environ 70 cm de hauteur de la base de support.
    2. Connecter les tubes de la seringue en plastique et un tube de raccord à l’aide de 3 mm-diamètre intérieur tuyau et un robinet à trois voies tel qu’illustré à la Figure 1.
    3. Insérer une canule 3 mm de diamètre extérieur vers le bas du connecteur du tuyau, où le cœur sera lié pour la fixation de la perfusion.
  5. Remplir les tubes de seringue avec solution Tyrode et fixateur à 37 ° C.
    1. Enlever les bulles d’air dans le tuyau en passant les solutions de la seringue à travers eux.

2. acquérir des données de microscopie électronique de l’Ultrastructure du Cardiomyocyte

  1. Préparer l’animal à l’excision et la fixation chimique du cœur.
    Remarque : Ce protocole détaille les étapes pour traiter les adultes mâles Wistar (nom d’une race spécifique de rat albinos) rat tissu cardiaque. Le protocole peut-être nécessiter des modifications lorsque le tissu cardiaque est provenant d’autres espèces.
    1. Anesthésier l’animal en traitant le rat (200-250 g de poids corporel), 0,5 ml d’héparine 250 de U/mL par injection intrapéritonéale. Attendez pendant 10 min, puis traiter le rat avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (210 mg/kg de poids corporel).
    2. Confirmer un degré approprié de l’anesthésie en testant le réflexe de pincée d’orteil.
    3. Euthanasier l’animal par dislocation cervicale.
    4. Récolte le coeur utilisant dissection des procédures similaires d’articles déjà publiés de JoVE22,23, puis placer dans une solution saline glacée.
    5. Isoler l’aorte ascendante et de canuler. Veiller à ce que l’extrémité de la canule se trouve juste au-dessus de la valve semi-lunaire, où les artères coronaires se bifurquent. Nouer un fil serré autour de l’aorte ascendante.
    6. Raccorder la canule à l’appareil de Langendorff gravitaire fonctionné à environ 70 cm au-dessus de la base du système (Figure 1).
    7. Tournez le robinet d’arrêt sur le système de Langendorff pour perfuse le cœur avec une solution de Tyrode, y compris 20 mM BDM (un inhibiteur de la myosine) pendant 2-3 min.
    8. Tourner le robinet pour commencer la perfusion avec fixateur de paraformaldéhyde à 2 %, glutaraldéhyde à 2,5 % et 0,2 % l’acide tannique dans cacodylate de sodium 0.15 M à 37 ° C pendant 10 min. En cas de succès, le cœur sera tourner brun pâle et devenir raide et caoutchouteux.
    9. À l’aide d’une lame de rasoir, disséquer des blocs de tissus de la paroi ventriculaire gauche de libre (latérale) et obtenir des tissus bloque environ 1 mm3 en taille.
    10. Conserver les échantillons en flacons scintillation refroidis préalablement 20 mL de la même fixateur sur la glace pendant 2 h. conserver les échantillons autant que possible dans les flacons et faire en sorte que les échantillons soient immergés dans la solution.
      ATTENTION : Il est important de conserver les échantillons froid qu’après l’étape de déshydratation 100 % ci-dessous.
  2. Autre fixation et coloration des échantillons pour la microscopie électronique.
    1. Verser 100 mL de tampon de cacodylate de sodium de 0,15 M dans une carafe en verre et refroidir sur glace.
    2. Préparer des volumes égaux de 4 % le tétroxyde d’osmium et 0,3 M cacodylate de sodium, suivi par l’addition de 0,08 g de ferrocyanure de potassium pour faire une solution de tache de métaux lourds contenant de ferrocyanure de potassium 2 % à 2 % le tétroxyde d’osmium et 0,15 M cacodylate de sodium. Refroidir la solution sur la glace.
    3. Pipeter le fixateur dehors et remplacez-le par assez tampon de cacodylate de sodium 0.15 M froid de submerger les échantillons dans les flacons. Placer les flacons sur la glace pendant 5 min.
    4. Répétez l’étape 2.2.3 quatre fois plus avec 0,15 M cacodylate de sodium pour éliminer les excès fixateur.
      ATTENTION : Ne pas utiliser des pipettes en verre car minuscules éclats peuvent pénétrer dans l’échantillon et peuvent ruiner les couteaux diamant pendant la découpe de bloc de tissu. Il est important de refroidir préalablement toutes les solutions sur la glace avant de les ajouter à l’échantillon. Il est également important que l’échantillon reste couverte par la solution de tous les temps (très brèves périodes de couverture partielle, pas plus de quelques secondes peuvent être brièvement tolérées lors d’échanges de solution). Lorsque le lavage ou le remplacement de solutions, ajoutez la nouvelle solution rapidement après avoir enlevé la solution précédente. Garder les flacons scintillation sur glace entre les lavages. Notez que cette étape n’est pas temps sensible, les blocs de tissu peuvent être lavées en un peu Pluss, si nécessaire.
    5. Remplacez tampon de cacodylate de sodium solution tache glacee heavy metal et stocker sur glace du jour au lendemain. S’assurer que le ferrocyanure est bien mélangé en agitant le flacon à la main ; la solution devrait noircissent.
      ATTENTION : Les travaux dans la hotte lorsque vous effectuez cette étape car l’osmium est toxique.
    6. Diluer la solution stock acétate (UA) uranyle aqueux à 4 % (tableau 1) à 2 % en utilisant des volumes égaux de stock solution UA et de l’eau bidistillée et refroidir sur glace.
    7. Remplacer le métal lourd tache avec glace refroidi par le tampon de cacodylate de sodium 0.15 M et laisser l’échantillon à incuber pendant 5 min sur la glace.
    8. Répétez l’étape 2.2.7 encore quatre fois sur la glace à rincer toute solution de tache d’excès de métaux lourds.
    9. Rincer les échantillons quatre fois, avec une période d’attente de 2 min entre les deux dans l’eau purifiée (bidistillée suffit).
    10. Remplacer l’eau purifiée avec glacee 2 % d’UC et de laisser l’échantillon incuber pendant 60 à 120 minutes sur la glace.
    11. Refroidir 5 flacons scintillation de 20 mL d’éthanol (assez pour submerger les échantillons) sur la glace qui sera utilisé lors de l’étape de déshydratation. Les six flacons ont des pourcentages croissants d’éthanol dans l’eau distillée : 20 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 %.
    12. Versez l’acétone pure dans un autre flacon de 20 mL à scintillation et laisser refroidir sur glace ainsi que les flacons d’éthanol.
    13. Rincer les échantillons dans de l’eau purifiée quatre fois avec les périodes d’attente de 2 min sur glace à laver UA excès.
  3. Déshydrater les échantillons dans de l’éthanol.
    1. Déshydrater en série de l’éthanol froid en remplaçant successivement les solution dans le flacon d’échantillon comme suit, sur la glace : 20 % d’éthanol pendant 10 min ; éthanol à 50 % pendant 10 min ; éthanol à 70 % pendant 10 min ; éthanol à 90 % pendant 10 min ; puis deux fois en éthanol 100 % pendant 10 min.
    2. Échantillon à la température ambiante de transition en remplaçant la finale 100 % d’éthanol avec de l’acétone pur refroidi et placez le flacon d’échantillon sur un banc de laboratoire à température ambiante pendant 10 min.
    3. Effectuer un lavage plus de 10 min dans l’acétone pure à la température de la pièce pour éliminer la condensation qui est observable dans les flacons. Pendant l’incubation, composent les solutions acétone/résine.
    4. Remplacez l’acétone pure dans les flacons avec 50/50 pur l’acétone et résine époxy (avec les proportions des composants en résine époxy comme indiqué par le fabricant). Utiliser tous les composants provenant du même lot. Laisser les flacons à échantillon rempli de résine pendant la nuit sur un rotor.
  4. Incorporer des échantillons en résine.
    1. Remplacer la résine de 50/50 avec de la résine de 75 % (25 % d’acétone) et incuber pendant 3 h, suivie d’autres incubation/infiltration en résine 100 % pendant 4 heures à température ambiante.
    2. Remplacez la résine 100 % avec une résine 100 % frais et laisser les flacons d’échantillon du jour au lendemain pour une pénétration plus profonde de la résine dans les échantillons de tissus.
    3. Prélever des échantillons sur les flacons et les placer dans des contenants qui soient favorables à four et ont un fond plat ; aluminium ou Lampwork tasses de cuisson peut être utilisé à cette fin, par exemple.
    4. Verser doucement (pour éviter le déplacement des échantillons) frais de résine sur les échantillons (donc l’enrobage d’échantillons en résine) et polymériser la résine et les échantillons dans une étuve à 60 ° C pendant 48 h.
  5. Réorienter les blocs de résine aux cellules des images en coupe transversale.
    1. Obtenir 1 µm test épais sections partir des blocs de résine avec un ultramicrotome avec un couteau de verre pour évaluer cellule orientation24.
    2. Tacher les sections épaisses test pendant 20 s avec 1 % de toluène bleu et 1 % de borax.
    3. Examiner l’orientation cellule musculaire sous un microscope à champ lumineux.
    4. Basé sur l’orientation déduite à partir des images des sections colorées test, réorienter longitudinalement ou obliquement orienté (semblable à la Figure 2 a) blocs pour s’assurer que les cellules sont exposées à la lame de verre pour qu’ils seront découpés en coupe transversale (en résine semblable à la Figure 2 b).
  6. Sections de tissu image en utilisant la tomographie électronique.
    1. Obtenir des sections minces semi (~ 300 nm) du tissu réorienté blocs à l’aide d’un diamant couteau et transférer les sections sur les grilles cuivre25.
    2. Tacher les coupes épaisses avec 2 % d’UC et Sato plomb25.
    3. Appliquer des particules colloïdales d’or sur les deux côtés des sections25.
    4. Obtenir des ensembles de single ou double-axe d’inclinaison série des images projetées de-70 ° à + 70 °25.
  7. IMOD20 permet de reconstituer la pile d’image 3D (une série d’images 2D qui fournissent les informations 3D d’une section de tomographie d’un seul électron) de la cellule. Cette pile reconstruite va être segmentée dans l’étape suivante.

3. le segment myofibrilles et régions des mitochondries dans le Dataset d’Image 3D EM

  1. Exécutez le programme IMOD « 3dmod ».
  2. Au sein de l’interface utilisateur graphique de 3dmod, entrez l’adresse de la « .rec » ou « .mrc » fichier qui contient la 3D reconstruit image dataset de la cellule (générée à l’étape 2.7) dans la case d’entrée « ou les fichiers d’Image : », puis appuyez sur « OK ».
  3. Sous le menu « Fichier », sélectionnez le nouveau modèle, puis enregistrez le fichier avec un nom approprié à l’aide du modèle en tant que « enregistrer »... le menu sous « Fichier ».
    Remarque : Un objet dans l’IMOD peut contenir une collection d’éléments segmentés qui composent le « objet ». Par défaut, un nouveau modèle contient un objet avec l’id « #1 ».
  4. Sous le menu « Spécial », sélectionnez « Outils de dessin ». Ceci ouvrira une nouvelle barre d’outils similaire à celle illustrée à la Figure 3 a.
    Remarque : Il existe plusieurs outils qui peuvent servir à créer des contours autour des limites des différents organites. Plus d’aide sur les moyens d’utiliser ces outils se trouvent dans la documentation de20 IMOD.
  5. Choisissez l’option « Sculpter » dans le menu « Outils de dessin » et déplacez la souris sur la fenêtre d’image ; un contour circulaire centré sur le pointeur de la souris s’affiche.
  6. Maintenez le bouton central de la souris sur une mitochondrie (régions plus foncées des fichiers image, comme en témoigne les démarcations avec des lignes de contour verts dans la Figure 3 a), faites glisser le périmètre du contour cercle dans la forme de sa frontière.
  7. Une fois que le contournement de la limite de la mitochondrie est terminée, relâcher le bouton du milieu et répétez les étapes 3.6 pour chaque mitochondrie dans les données. Chaque contour sera automatiquement reconnu par IMOD comme un nouveau contour dans le même objet.
  8. Sous le « Edit | Objet « menu, sélectionnez « Nouveau » pour créer un nouvel objet. Ceci automatiquement incrémenter le nombre total d’objets par l’un et attribue ce numéro vers le nouvel objet.
  9. Répétez les étapes 3.6 et 3.7 de segmenter et de sauver des contours myofibrillaire.
  10. Répétez l’étape 3.8, suivi par étape 3.6, permet de segmenter la limite de la cellule aussi bien.
  11. Enregistrez le fichier de modèle dans le menu « Fichier ».
  12. Exécutez les commandes suivantes dans une fenêtre de ligne de commande pour convertir chaque objet groupant dans un masque binaire, comme illustré dans la Figure 4A-C.
    1. Extrait un objet spécifique à partir du modèle « imodextract objet modelfile outputmodelfile » où « l’objet » est le numéro de l’objet à extraire.
    2. Créer un masque pour cet objet : imodmop-masque 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Convertissez le fichier en une pile de tif : mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. créer un maillage éléments finis des composants segmentés

  1. Iso2mesh est un programme MATLAB librement disponible pour convertir les piles d’image TIFF en maillages éléments finis tétraédrique volumétrique. Télécharger et ajouter iso2mesh au chemin de MATLAB de iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Télécharger les codes sources et données pour simuler des grappes de RyR sur le maillage de la github site Web https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Lancez l’application CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figure 5).
  4. Charger les masques de composant différents organites dans MATLAB en utilisant les trois boutons sur le côté supérieur gauche de l’interface graphique.
  5. Créer une autre pile d’image binaire qui délimite les écarts entre les myofibrilles et mitochondries comme illustré à la Figure 6 a.
    1. Ouvrez ImageJ.
    2. En utilisant le fichier | Ouvrez la boîte de dialogue, charger les piles de tiff de myofibrilles et mitochondries dans le programme.
    3. Lancer le plugin d’ajout image en sélectionnant « processus | Calculatrice Plus ».
    4. Sélectionnez la pile d’image myofibrillaire i1, les mitochondries pile comme i2 l’image, puis choisissent l’opérateur « Ajouter ». Cliquez sur « OK ».
    5. Après une nouvelle pile d’image qui représente le résultat de 4.5.4 apparaît, sélectionnez « Edit | Inverser » pour produire une pile d’image similaire à la Figure 6 a.
  6. Chargez le fichier contenant la pile d’image binaire des écarts entre les myofibrilles et les mitochondries en appuyant sur le bouton « RyRGapsFile » sur le programme CardiacCellMeshGenerator.
  7. Appuyez sur « Générer le maillage » sur le GUI. Cela va déclencher la v2m iso2mesh de commande avec l’option « cgalmesh » pour générer un maillage tétraédrique semblable à la Figure 4E. Trois fichiers sera émis à la fin de cette étape : un fichier .ele, un fichier .face et un fichier .node qui contiendra la liste des nœuds qui constituent les éléments, les nœuds qui composent les visages et les coordonnées des nœuds , respectivement.

5. mathématiquement, mappez la variation spatiale de la densité des canaux ioniques d’intérêt sur le maillage éléments finis.

  1. Générer les intrants nécessaires pour le simulateur de RyR en appuyant sur le bouton intitulé entrées générer RyR-simulateur sur le GUI.
    Remarque : Le bouton déclenchera une fonction generateRyRsimulatorInputs.m, qui utilise les informations suivantes à l’étape 4 pour générer les entrées :
    (1) outDir : l’emplacement pour les fichiers de sortie qui sont nécessaires pour la simulation de cluster RyR.
    (2) imres : la résolution en pixels dans les trois directions des piles d’image.
    (3) myofibril_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 4 b.
    (4) sarcolemma_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 4 a.
    (5) ryrgaps_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 5 a.
    1. Après l’exécution de cette fonction, vérifier que les fichiers suivants ont été créés dans le répertoire spécifié dans le chemin d’accès outDir :
    • d_axial_micron.txt, qui représente la distance axiale entre le poste du z-disque et le reste des pixels dans la pile de l’image.
    • d_radial_micron.txt, qui représente la distance euclidienne (à l’exception de la composante axiale) de chaque pixel dans l’ensemble des emplacements possibles de cluster RyR aux pixels sur le plan z-disque.
    • W_micron.txt, qui représente la liste des coordonnées spatiales de tous les postes disponibles pour RyR clusters soient présents.
    • Les 3 autres fichiers dans le dossier portent le suffixe « _pixel » plutôt que « _micron » pour indiquer que les valeurs dans ces fichiers ont été écrit sous forme de coordonnées pixel.
  2. Simuler des distributions de cluster RyR dans la pile d’image binaire des myofibrilles.
    1. Appuyez sur le bouton portant la mention « Open RyR-simulateur en R » pour lancer le programme de R.
    2. Dans le R-gui, sélectionnez « fichier | Open » et recherchez le fichier « paramètres. R » dans le package de RyR-Simulator (RyR-simulateur/source/paramètres. R).
    3. Également ouvrir le fichier ryr-simulateur-parallèle. R (situé à Adieu bazou-simulateur/source/ryr-simulateur-parallèle. R). environnements comme Rstudio (https://www.rstudio.com) ou une simple interface de ligne de commande peut être utilisée, par exemple à l’aide de la commande R64 dans une fenêtre shell ou commande.
    4. Modifiez les paramètres dans les paramètres. R fichier comme indiqué ci-dessous :
      1. L’adresse du dossier qui contient les fichiers répertoriés dans 5.1.2 pour une pile d’image confocale acquises expérimentalement des grappes de RyR et myofibrilles la valeur Path2.
        Remarque : La github référentiel dossier entrée-fichiers/maître-cellule / contient déjà des fichiers qui ont été générés pour une pile d’images recueillies précédemment.
      2. La valeur Path4 une adresse de dossier où sont stockés les fichiers qui ont été générés à l’étape 5.1.2.
      3. Configuration Path3 point sur un dossier où l’utilisateur veut les emplacements de cluster RyR simulés pour être sauvé.
      4. Valeur N le nombre de clusters RyR simulé dans le modèle (typiquement de l’ordre de 200 à 300).
      5. La valeur etol, une tolérance fixant, pour la différence entre la distribution spatiale mesurée expérimentalement de RyR grappes et la distribution spatiale du modèle simulé des grappes de RyR.
      6. La valeur numIter pour limiter le nombre de tentatives que le simulateur de RyR devrait prendre pour trouver un modèle de cluster RyR simulé qui satisfait la valeur etol.
        Remarque : Les valeurs pour etol et numIter ont été définies à des valeurs dans les paramètres. Fichier de R.
      7. Définissez numPatterns sur le nombre de différents modèles de cluster RyR qui l’utilisateur souhaite simuler (en règle générale, il est utile que simulant 99 modèles de confiance statistique).
      8. La valeur numCores pour permettre l’utilisation de plusieurs threads d’UC (carottes) pour traitement avec R pour simuler les modèles de point de parallèle plus rapide.
    5. Vérifiez que les paquets suivants sont installés à l’aide de l’installateur de package gui dans r : neige, doSNOW, doparallel, foreach, itérateurs et rgl.
    6. Exécuter le simulateur en entrant la commande suivante dans la fenêtre de commande R : source (' chemin de ryr-simulateur-parallèle. R', chdir = TRUE)
      Remarque : La sortie du programme Adieu bazou-Simulator est une liste de fichiers .txt (un fichier numPatterns sera généré) qui contiennent des listes de coordonnées à N lignes et 3 colonnes, qui représentent les x et y coordonnées z n simulant RyR grappes.
  3. Carte points comme la densité spatiale sur un modèle de calcul à l’aide de la CardiacCellMeshGenerator.
    1. En cliquant sur le bouton portant la mention « Select RyR points fichier », choisissez un fichier de texte simulé pour RyR cluster distribution de ceux qui ont été sorties par le simulateur de RyR.
    2. Exécutez « RyR densité Mapper » sur l’interface graphique en MATLAB. Il mappe les emplacements spatiaux des clusters RyR simulées dans le fichier .txt à l’étape 5.3.1 sur le maillage éléments finis qui a été généré à l’étape de 4,8 à l’aide d’une méthode appelée un noyau sphérique intensité estimateur méthode26.
      Remarque : La sortie de cette étape est un fichier portant l’extension .txt qui contient une liste de valeurs pour la densité numérique du canal ionique par unité de volume sphérique à chacun des nœuds du maillage de calcul.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figure 2 à la Figure 7 fournit des résultats représentatifs de plusieurs étapes clés dans le présent protocole : (i) visualisation et réorientation des blocs de tissus pour des vues transversales microscopie électronique ; (ii) générant une pile d’image de microscopie 3D ; (iii) segmentation subcellulaire ultrastructure des organites d’intérêt ; (iv) la génération d’un maillage éléments finis à l’aide d’iso2mesh ; (v) simulant un...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole ci-dessus donne un aperçu des étapes clés pour générer un modèle géométrique de nouveaux éléments finis de l’ultrastructure du cardiomyocyte. La méthode permet aux modalités de calcul de fusion des différents microscopes (ni, en principe, autres données) à développer un modèle de calcul plus complète du cardiomyocyte dynamique qui inclut des détails de l’architecture cellulaire spatiale. Il n’y a actuellement aucun autre protocole disponible pour créer un tel modèle d’un cardiomyocyte.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Royal Society de New Zealand Marsden vite commencer Grant 11-LABNT-184, la subvention de recherche de programme de Science frontières humaines RGP0027/2013 et l’australien recherche Conseil découverte projet Grant DP170101358.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Materials
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich746398
Chlorure de calciumSigma-AldrichC8106
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichM2393
Bicarbonatede sodium Sigma-AldrichS5761
Chlorurede potassiumSigma-AldrichP5405
DextroseSigma-AldrichD9434
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS8045
ProbénécideSigma-AldrichP8761
2,3-Butanedione MonximeSigma-AldrichB0753
25 % Glutaraldéhyde EM Grade (flacon de 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Acide tanniqueSigma-Aldrich403040-500G100g
Cacodylate de sodiumSigma-AldrichC0250
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichP4593
Tétroxyde d’osmiumSigma-Aldrich75632-10ML4 % dans l’eau, flacon de 5 ml (ou flacon de 10 ml également disponible)
Acétate d’uranyleEM Sciences22400Bouteille de 25g
Ferrocyanure de potassiumMerck Millipore104973
Bleu de toluèneSigma-AldrichT3260
BoraxSigma-AldrichS9640également appelé borate de sodium
ÉthanolSigma-Aldrich792780Dilué à différents pourcentages avec eau pure
AcétoneEM SciencesRT10017
Kit résineEM Sciences14040ACM Durcupan fonctionne bien
Acide chlorhydriqueSigma-AldrichH98921Solution normale
Équipement
UltramicrotomeLeicaEM UC7
Électron de transmission microscopeThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Support d’autoclaveProscitechT752
TubeBioStrategy75831-346pour appareil de perfusion de langendorff, un diamètre de 3 mm est recommandé mais pas indispensable
Robinets d’arrêtSDRQP13813pour tube de langendorff ; le produit n’est qu’un exemple, l’utilisateur peut sélectionner n’importe quel
pinces de support d’autoclaveProscitechT715
Seringues en plastiqueSDRQPC1108pour solutions sur appareil de Langendorff
Suture en soie de canulation, 7-0TeleFlex15B051000pour attacher le cœur sur l’appareil de langedorff
CanuleFabriqué à partir d’une aiguille en acier de 3 mm de diamètre extérieur Tapis de
boîte de Pétri en caoutchoucProscitechH068à utiliser comme planche à découper lors de la dissection à cœur fixe
Lames de rasoirProscitechL056pour couper le cœur fixe en petits blocs pour le traitement EM
Bouteilles en verreBioStrategy89000-236pour stocker des solutions pendant la fixation et le traitement des tissus pour
les béchersBioStrategy213-0477pour stocker des solutions temporairement et pendant la perfusion
Flacons à scintillationBioStrategy548-2170pour échantillons de tissus pendant le traitement EM
Kit de dissectionProscitechT161pour la dissection animale
Filtres à seringueProscitechWS3-02225Spour la purification de l’acétate d’uranyle
pâtisserie en aluminium/feuille d’argentDe n’importe quel magasin de produits de boulangerie
Couteau Dupont DiamondLa version à102680-780produit les meilleures sections.
Or colloïdalBBI SolutionsEM. GC1515 nm Grilles de maille EM en or colloïdal
ProscitechGCU150une variété de tailles peuvent être testées : GCU150h, GCU200h par exemple
Élimination du plastique PippettesProscitechLCH20le meilleur pour utiliser des jetables en plastique, en particulier lors du travail avec de la résine
Logiciel
SerialEMUniversité de Boulderacquisition de tomographie
MATLAB, MathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD,l’Université de Boulderl’alignement et la segmentation d’images
, iso2meshdisponible à http://iso2mesh.sourceforge.net
Fidji ou un logiciel de traitement d’images similaireImageJFiji est Just Image Jdisponible à https://fiji.sc pour la manipulation d’images binaires piles
RyR-Simulator codes/donnéesCellSMB groupedisponible à https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorLe groupeest livré avec RyR-Simulator sous le dossier « gui-version"
R-statistics softwareR-projectTélécharger depuis https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstaller via
le programme R rglR-projetinstaller via le programme R
doparallèleR-projetinstaller via le programme R
pour chaqueprojetinstaller via le programme R
doSNOWR-projetinstaller via
R itérateursprojetvia le programme R
de qualité EM EM Moules à angle de 35 degrés BioStrategy , CellSMB R de programme R installer le R

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417(2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908(2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Finite Element ModelCardiomyocyte ArchitectureElectron TomographyConfocal MicroscopyCellular ArchitectureCalcium SignalingMitochondrial BioenergeticsRyR Cluster SimulationImage SegmentationMesh Generation

Articles connexes