Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D

Résumé

Usines de transcriptionnelles virales sont des structures discrètes qui sont enrichis de RNA polymérase cellulaire II pour augmenter la transcription de gènes viraux durant la réactivation. Ici, on décrit une méthode pour localiser les sites de la retranscription activement chromatine virale dans un espace 3D nucléaire par une combinaison de l’hybridation d’immunofluorescence souillant et in situ de RNA.

Résumé

Il est bien connu que la régulation spatiale et temporelle des gènes est partie intégrante de régir l’expression des gènes appropriés. En conséquence, il est précieux pour comprendre où et quand la transcription se déroule au sein de l’espace nucléaire et visualiser la relation entre épisomes infectés au sein du noyau de la cellule même. Ici, les immunofluorescence (IFA) et les poissons-RNA ont été combinedto identifier activement transcrire épisomes herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV). Par coloration antigène nucléaire associé à latence KSHV (LANA), il est possible de localiser où épisomes virales existent dans le noyau. En outre, grâce à la conception des sondes de RNA-FISH pour cibler la région intron d’un gène viral, qui s’exprime uniquement pendant l’infection productive, naissant ARN transcrits peuvent être trouvées. Grâce à cette combinaison de sondes moléculaires, il est possible de visualiser l’Assemblée des usines de grande transcription virale et analyser la réglementation spatiale de l’expression génique virale au cours de la réactivation de KSHV. En incluant la coloration d’anticorps anti-ARN polymérase II, on peut également visualiser l’association entre l’agrégation de l’ARN polymérase II (RNAPII) et la transcription de KSHV durant la réactivation.

Introduction

Il est devenu de plus en plus évident que l’organisation spatio-temporelle du noyau joue un rôle important dans la modulation de l’expression des gènes finement réglé chez les eucaryotes. La plupart des gènes spécifiques des tissus sont réparties sur plusieurs chromosomes et doivent être réglementés de manière synchrone afin de répondre à des stimuli spécifiques dans une manière coordonnée¹. Cellules construisent moyeux de chromatine active (ACH) comme un moyen de rassembler des gènes et leurs composants cis-réglementation nucléaires spécifiques de l’espace¹.

Il a également été démontré par diverses études que bien que le noyau semble très denses et visqueux, molécules biologiquement actives peuvent traverser le noyau assez rapidement par l’intermédiaire de diffusion². Conséquemment à cette propriété éphémère, la plupart des protéines liant l’ADN « sautent » du site de liaison à binding site, sentant leur chemin autour de l’espace nucléaire, qui permet pour un noyau hautement adaptatif et polyvalent².

Malgré ce comportement dynamique des biomolécules dans le noyau nucléaire organes sans membranes tels que (mais non limité à) le nucléole, corps de Cajal et corps nucléaires de leucémie promyélocytaire (PML-n.-b.) existent toujours. C’est par le biais de divers mécanismes tels que des répétitions d’ADN en tandem (nucléole), ARNr (nucléole) et des protéines de structure comme coilin (corps de Cajal) ou PML de protéines (PML-n.-b.) qui détiennent ces constructions ensemble^3,,^4,5 . Ces structures et autres congrégations comme usines de transcription servent d’échafaudages qui non seulement d’augmenter la concentration locale des composants requis, mais aussi pour la composition des protéines et des acides nucléiques dans eux pour finalement créer un site central pour les fonctions cellulaires efficace⁶.

Visualisation quand et où les structures nucléaires formulaire fournit une foule de renseignements aux chercheurs qui étudient l’épigénétique. Du point de vue de la virologie, la réactivation du virus infectés de façon latente, comme KSHV, modifie considérablement le paysage du noyau et la distribution des enzymes nucléaires de passer de la transcription principalement de gènes cellulaires à des gènes viraux, en fin de compte à produire des progénitures virales entièrement fonctionnel^7,8. Comment KSHV ne manipule pas les mécanismes d’expression de gène cellulaire pour faciliter l’expression des gènes viraux ? Ces informations pourraient également faire la lumière sur les mécanismes de régulation génique cellulaire temporelle.

Comme tous les autres herpèsvirus, KSHV a deux cycles de vie appelés latence et réplication lytique. KSHV réside principalement dans la phase de latence, dans laquelle la plupart de ses gènes viraux expression est réduit au silence, sauf latence associés gènes^9,10. Pendant le temps de latence que KSHV produit latence associé à un antigène nucléaire (LANA), qui lie les génomes viraux constitutivement longes chromatine virale avec le chromosome humain¹¹. En raison de la relation intime de LANA avec le génome viral, il est possible d’utiliser les CDI et DAPI pour souiller et de localiser où les épisomes virales sont rapportaient à la chromatine de l’hôte.

Pour étudier la réactivation de KSHV au niveau des épisomes unique et la liaison avec les autres épisomes virales dans une cellule infectée, une stratégie visant à localiser transcribing activement la chromatine virale in situ a été établie. En conséquence, LANA et RNAPII IFA avec intron RNA-poisson ont été combinées, en générant des sondes de RNA-poisson qui se lient à la région de l’intron (sonde exacte on trouvera des séquences du laboratoire Izumiya plus récente publication⁸) de KSHV K-Rta-la protéine virale clé qui est essentiel et suffisant pour KSHV réactivation-il a été possible d’identifier les cas où la transcription prenait réellement lieu^{8,11,12,13,14,15} . Cette technique de RNA-poissons d’intron permet aux chercheurs de visualiser où les ARNm est étant transcrite immédiatement avant d’être épissé et exporté vers le cytoplasme^16,17.

KSHV peut être réactivée par divers stimuli chimiques, y compris des esters de phorbol comme 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) et inhibiteurs d’histone déacétylase tels que le butyrate de sodium, en outre de KSHV peuvent être induites de réactiver par la surexpression de la le facteur de transcription virale, K-Rta¹⁹. Les chercheurs ont augmenté avec succès l’efficacité de la réactivation de KSHV en synchronisant les cycles de la cellule avant induction de réactivation¹⁸. Ainsi, pour ces études particulières, les cellules ont été synchronisées à l’aide d’un bloc double thymidine (protocole décrit ci-dessous) et incubé avec TPA et doxycycline (Dox) pendant une courte période. Doxycyline a été utilisé parce que la lignée cellulaire utilisée dans ces expériences a une cassette de K-Rta doxycycline-inductible, qui a été clonée à partir d’ADNc et n’inclut pas la région de l’intron de K-Rta. Bien qu’il soit possible de réactiver à l’aide de KSHV induit seulement l’expression de K-Rta, il a été prouvé par d’autres chercheurs qu’en raison de divers facteurs biochimiques différentes expression K-Rta seule se révèle pour être une réactivation faibles stimuli²⁰. En combinant tout cela et en limitant les incubations de drogue pour un court laps de temps, une réactivation de KSHV robuste mais pas trop artificielle a été réalisée pour l’imagerie.

Après marquage LANA, RNAPII, K-Rta introns et ADN comme décrit dans cet article, imagerie de fluorescence 3D a été réalisée à l’aide de microscope widefield déconvolution. Après le traitement avec le logiciel d’imagerie, la répartition spatiale des épisomes virales actives peut être correctement évaluée. En utilisant cette technique, les questions centrales concernant le caractère fondamental de la formation de nœuds de chromatine active et d’autres structures nucléaires peuvent être étudiées. Avoir des épisomes virales identiques dans une seule cellule qui traite les mêmes éléments réglementaires peut-être représenter un outil de recherche unique pour approfondir la compréhension des mécanismes de régulation génique spatio-temporelle.

Une limitation de plusieurs spécimens de cellule fixés à différents moments afin de caractériser un processus intrinsèquement dynamique moléculaire d’imagerie est que des changements subtils ou à petite échelle dans la distribution de fluorescence sont détectées ou jugées insignifiantes. C’est vrai, sauf dans les rares cas, chaque cellule observée affiche le même changement subtil. Ainsi, la relation complète spatio-temporelle de transcription virale active et autres structures nucléaires ne peut être critique évaluée à l’aide de l’imagerie fixe. Pour relever ces défis techniques, la meilleure approche consiste à des cellules vivantes images qui ont marqué les épisomes virales et de suivre l’emplacement des principaux enzymes cellulaires au fil du temps.

Protocole

ATTENTION : Lignées cellulaires utilisées dans cette procédure contiennent des virus infectieux, soyez prudent et ne procéder à l’installation de BSL de niveau 2 ou supérieur.

1. préparation et entretien des cellules

1. La culture de cellules TREx-K-RTA BCBL-1 (ou un autre KSHV infectés de lignées cellulaires PEL) dans RPMI1640 additionné 15 % sérum fœtal (SVF) et la solution à 1 % la pénicilline streptomycine glutamine.
2. La croissance de cellules à 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO₂), en veillant à croître continuellement et de diviser des cellules par un ratio de 1:4 tous les 2-4 jours.
3. Surveiller les cultures de cellules avec un microscope optique tous les jours pour confirmer la croissance cellulaire bonne et morphologie, par ailleurs, qu'il est recommandé de redémarrer la culture de cellules ou d’ajuster les conditions de culture cellulaire en conséquence.

2. thymidine synchronisation et Induction lytique

1. Dans une boîte de Pétri de 10 cm, cellules TREx-K-Rta BCBL-1 plaque en milieux (1 x 10⁶ cellules/2 mL de médias) fraîchement préparés
2. Ajouter thymidine 200 mM (concentration finale : 2 mM) pour le plat, mélanger et laisser incuber à 18 h.
3. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. laver les cellules avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à nouveau et remettre en suspension les cellules en milieux fraîchement préparés. Répéter pour un total de 3 lavages. Resuspendre dans milieux fraîchement préparés.
4. Laissez les cellules jusqu'à la sortie phase S pendant 8 h.
5. Ajouter la thymidine (concentration finale : 2 mM), mélanger et laisser incuber pendant 16 h.
6. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. laver les cellules avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à nouveau et remettre en suspension les cellules en milieux fraîchement préparés. Répéter pour un total de 3 lavages. Resuspendre dans milieux fraîchement préparés.
7. Pour induire la réactivation virale, ajouter 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentration finale 20 ng/mL) et la doxycycline (DOX, concentration finale 100 ng/mL) à la culture cellulaire, mélanger et incuber pendant 4 h. Pour les lignées cellulaires sans une cassette inductible K-Rta, stimuler la réactivation à l’aide de la TPA (concentration finale 20 ng/mL et sodium butyrate (1 mM)).
8. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. laver les cellules avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à nouveau et remettre en suspension des cellules dans les milieux de culture complet. Répéter pour un total de 3 lavages. Remettre en suspension dans des milieux de culture complet.
9. Laissez les cellules à se développer pendant 24 h.

3. fixation et Permeabilization

Remarque : Avant de commencer, assurez-vous que fixation solution (3,7 % de formaldéhyde dans du PBS traitée DEPC), diéthyl pyrocarbonate traités tampon phosphate salin (DEPC-PBS), glycine DEPC PBS (concentration finale de glycine : 100 mM) et solution (50 % de la permeabilizating l’acétone, le méthanol à 50 %) sont préparés. En règle générale, chaque diapositive exigera au moins 0,5 millions de cellules, multiplier si nécessaire et comprennent des cellules supplémentaires pour le dos haut, surtout si les cellules ne sont pas en bonne santés.

1. Prélever des cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
2. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 200 x g. laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS de DEPC stérile. Resuspendre dans 1,2 mL de PBS de DEPC.
3. Placer le nombre approprié de lamelles couvre-objet (déterminé par le montage expérimental) dans le fond d’une plaque de 6 puits.
4. Pipeter 200 µL de la cellule, mélange de DEPC PBS sur chaque lamelle, veiller à ce que les cellules au moins 0,5 millions sont sur chaque diapositive. Permettre les cellules à se contenter de 2 min et aspirer l’excès DEPC PBS, laissant seulement une mince couche de cellules. Il est normal que les cellules à supprimer dans ce processus.
   ATTENTION : PFA est toxique, portez une protection appropriée.
5. Ajouter 1 mL de solution (3,7 % de formaldéhyde dans du PBS DEPC) à chaque lamelle couvre-objet de fixation avec précaution. Laissez les cellules à fixer pendant 10 min.
6. Laver 3 fois avec du PBS DEPC lamelles couvre-objet.
7. Ajouter avec précaution 1 mL de glycine DEPC PBS (concentration finale de glycine : 100 mM) à chaque lamelle couvre-objet. Laissez les cellules étancher pendant 5 min.
8. Ajouter 1,5 mL de PBS de DEPC et deux endroits sur un agitateur pendant 5 min ou agiter fermement mais doucement à la main pendant 1 min. aspirer l’excès PBS DEPC. Veillez à ne pas perturber les cellules. Répétez cette étape pour un total de 3 lavages.
9. Ajouter 1 mL de solution (l’acétone 50 %, 50 % de méthanol) à chaque lamelle de perméabiliser avec précaution. Laissez les cellules pour permeabilize pendant 15 min.
   Remarque : À ce stade, les lamelles peuvent être stockés dans un congélateur à-20 ° C pour pas plus d’une semaine. Éviter le gel ou réduire au minimum le temps passé dans le congélateur comme qualité d’image peut se dégrader rapidement. S’assurer que lorsque dans le congélateur que les cellules restent humides et couvertes en méthanol/acétone, tout en assurant qu’ils réhydrater correctement avec DEPC PBS après l’enlèvement du congélateur.
10. Ajouter 1,5 mL de PBS de DEPC et deux endroits sur un agitateur pendant 5 min ou secouer fermement mais doucement à la main pendant 1 min. aspirer l’excès PBS DEPC, veillez à ne pas perturber les cellules. Répétez cette étape pour un total de 3 lavages.

4. IFA et RNA-poisson

NOTE : En ce qui concerne les ARN poisson sonde d’étiquetage et de préparation : pour le K-Rta intron 959 paires de bases, 31 différentes sondes ont été générés qui étaient 20 paires de bases, contenant un GC contenus d’environ 50 %. Des solutions de travail et actions des sondes ont été aliquotées dans 100 µM et concentrations de 2,5 µM, respectivement.

1. Lames de microscope d’étiquette des informations expérimentales nécessaires ou une sorte de label distinguable.
2. Recouvrir le fond d’un récipient en plastique refermable avec un essuie-tout humide.
3. Préparer la solution d’anticorps primaire (1,5 µL d’anticorps de LANA, 0,75 µL d’anticorps de l’ARN Pol II, 3 µL de baker levure ARNt, PBS de DEPC jusqu'à 30 µL) et multiplier la recette pour chaque lamelle présente. Place 30 µL de solution d’anticorps primaire sur chaque lame de microscope étiquetée.
   1. Titrer l’anticorps primaire d’intérêt tout d’abord et utilisez la quantité optimale. Veillez à utiliser des IgG purifié, comme le sérum (liquide d’ascite) peut contenir beaucoup de RNase.
4. Placez le couvre-objet (face à la solution de cellules) sur les lames de microscope étiquetée et déplacer les diapositives dans le récipient avec la serviette de papier humide. Veillez à ne pas introduire des bulles. Couvrir l’extérieur du récipient avec une pellicule plastique. Déplacer le récipient dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h la valeur.
5. Préparer un poisson de tampon de lavage (2 x saline citrate de sodium buffer (SSC) (finale), 10 % formamide, 90 % DEPC dH₂O).
6. Préparer 2 x tampon d’hybridation (4 x SSC, 20 % sulfate de dextran).
7. Préparer l’anticorps secondaire et le tampon de sonde FISH intron (20 µL de 2 x tampon d’hybridation (finale 1 x tampon de Hyb), 4 µL de levure de boulanger ARNt (derniers 10 %), 4 µL de formamide (derniers 10 %), sonde de l’intron K-Rta (finale 125 nM), 0,8 µg d’anticorps secondaire, DEPC dH₂ O jusqu'à 40 µL). Multiplier la recette pour chaque diapositive nécessaire.
8. Après incubation, laver les cellules 3 fois avec du PBS CPDE dans une plaque 6 puits de 5 min chacun.
9. Laver avec du tampon de lavage du poisson 3 fois pendant 5 min chacun. Gardez lamelle à tampon de poisson-lavage jusqu'à la fin mélange de préparation ensuite sonde anticorps et intron (étape 4.7).
10. Lames de verre propre utilisés pour l’incubation de l’anticorps primaire pour l’hybridation.
11. Place 40 µL de l’anticorps secondaire et la sonde d’intron de poisson contenant une solution sur chaque lame de verre.
12. Placer les lamelles couvre-objet avec les cellules sur les lames avec le côté de la cellule vers le bas sur le dessus de la mémoire tampon, prenez garde à introduire des bulles.
13. Placer les lames dans un récipient en plastique avec une serviette de papier humide sur le fond. Entourez le récipient en plastique dans la première pellicule plastique, puis de papier d’aluminium.
14. Incuber le conteneur avec les diapositives à 37 ° C pendant 16 à 24 heures.
15. Après incubation, soigneusement glisser la lamelle du bord de la lame de verre et remettre dans 6 assiettes bien vers le haut et laver les cellules avec tampon de poisson-lavage 3 fois dans une plaque 6 puits de 5 min chacun.
16. Laver les cellules 2 fois avec 2 x SSC.
17. Ajouter DAPI (1:1, 000) dans les 2 x SSC et laisser pour reposer pendant 5 min à température ambiante.
18. Laver les cellules 2 fois avec 2 x SSC.
19. Nettoyez les lames de verre utilisées pour l’hybridation et ajouter 10 µL de solution sur les lames de verre de montage.
20. Placer les lamelles couvre-objet à l’envers sur la solution de montage. Veillez à ne pas introduire des bulles.
21. Avec un tissu de laboratoire, retirez doucement la solution de montage excès, en veillant à ne pas écraser les cellules.
22. À l’aide de vernis à ongles, appliquer une couche suffisante sur le pourtour les lamelles et laissez pour sécher.
23. Procéder pour effectuer la microscopie de fluorescence.

5. la microscopie en Fluorescence 3D

NOTE : Tandis que les protocoles varie selon le type de système de microscopie par fluorescence utilisé, les étapes suivantes contribuera à assurer l’acquisition des données d’image optimale pour l’analyse quantitative.

1. Prétraitez les échantillons fixes et montez en anti-fondu médias pour retarder le photoblanchiment de fluorescence en imagerie.
2. Utilisez un objectif de haute qualité (par exemple une 60 X 1,42 N.A-immersion dans l’huile lentille), qui peut capturer une cellule entière (ou noyau de la cellule) dans le champ de vision.
3. Définissez les paramètres d’exposition (p. ex., puissance d’excitation, durée d’exposition) pour chaque canal de couleur de fluorescence, à l’aide d’échantillons positifs et négatif de contrôle. Acquisition d’images de fluorescence.
   Remarque : Des échantillons de contrôle positif qui contiennent seule étiquette fluorescente devraient également servir pour déterminer le niveau des « interférences » entre les couches de couleur. Pour les échantillons d’imagerie cellulaire fixe puissance d’excitation de fluorescence peut être réduite (avec un peu plus longs temps d’exposition) pour minimiser le photoblanchiment.
4. Une fois que le protocole d’imagerie a été établi, conserver les mêmes paramètres d’exposition cohérent pour tous les échantillons dans une étude — afin que les données d’image peuvent être analysées et comparées avec précision.
5. Effectuer le traitement de l’image après l’acquisition et de reconstruction 3D. Identifier les transcriptions de K-Rta par signal RNA-poisson (rouge), les molécules de LANA par immunofluorescence (vert) et la chromatine nucléaire (le cas échéant) colorées au DAPI (bleu).
   NOTE : Régions du noyau cellulaire, où K-Rta et LANA sont conjointement en cluster, semblent donc être associé à la réplication complexe et usines de transcription virale.

Résultats

Un protocole légèrement abrégé a été réalisé où les cellules BCBL-1 ont été utilisées et seulement LANA et RNA K-Rta ont été colorées (Figure 1). Cette expérience nous permet d’examiner où sont activement transcrire épisomes virales et l’hétérogénéité de la réponse à des stimuli de réactivation de KSHV dans une population de cellules. Dans la cellule indiquée par la flèche sur la Figure 1, la fluorescence de K-Rta distincte dans ...

Discussion

Il y a certains aspects du protocole pouvant être modifiés pour tenir compte des circonstances inhabituelles. Le choix de tampons de fixation et permeabilization peut également être modifié. Pour les tampons de fixation, paraformaldéhyde est aussi efficace et l’éthanol peut être utilisé pour la perméabilisation.

Trempe le formaldéhyde avec glycine que PBS est recommandée car elle empêche le formaldéhyde de la désactivation de l’anticorps en absence d’albumine sérique bovine (BSA), mais si les ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI medium 1650 GlutaMAX	Gibco de Life Technologies	61870-036	Doit être chauffé à 37 ° ; C
Sérum fœtal bovin	Omega Scientific Inc.	FB-11
Stylo Strep Glutamine (100x)	Gibco by Life Technologies	10378-016
Thymidine  ;	Sigma Aldrich	T9250
Dulbecco' s Solution tamponnée	Gibco par Life Technologies	14190-144
TPA	Sigma Aldrich	P1585
Butyrate de sodium  ;	Sigma Aldrich	B5887
Solution de formaldéhyde  ;	Sigma Aldrich	252549	Corrosif, toxique, dangereux pour la santé
Pyrocarbonate de diéthyle	Sigma Aldrich	D-5758	Toxicité aiguë  ;
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Acétone	Sigma Aldrich	179124	Méthanol inflammable et toxique
Fisher	Chemical  ;	67-56-1	Inflammable, toxique, dangereux pour la santé
Anticorps monoclonal de rat contre KSHV/HHV-8 ORF73	Advanced Biotechnologies	13-210-100
Anti-ARN polymérase II Clone d’anticorps CTD4H8	EMD Milipore	05-623
Acide ribonucléique, transfert du boulanger s levure (S. cerevisiae)  ;	Sigma Aldrich	9014-25-9
Tampon salin de citrate de sodium 20x (SSC)	Thermo Fisher Scientific  ;
formamide  ;	Sigma Aldrich	295876
Omnipur Dextran Sulfate, solution à 50 %	EMD Milipore	1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-phénylindole, dichlorhydrate)	Thermo Fisher Scientific  ;	D1306
slowFade Gold réactif anti-effacement	Life Technologies	S36936
Micro verre de protection 22x22	Matsunami	C022221
VoloCITY		Logiciel d’imagerie 3D Microscope
DeltaVision Lames de microscope Superfrost/Plus	Fisher Scientific	12-550-15