Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

Résumé

Nous présentons ici une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (HSPCs) chez le poisson zèbre embryonnaire. HSPCs de poisson-zèbre dissocié sont plaqués en méthylcellulose facteurs favorables, DIFFERENCIATION en sang mature. Cela permet la détection du sang des défauts et permet aux médicaments de dépistage doit être réalisée facilement.

Résumé

L’hématopoïèse est un processus cellulaire essentiel dans lequel des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) se différencient en la multitude de lignées cellulaires qui composent le sang mature. Isolement et identification de ces HSPCs est difficile parce qu’ils sont définis ex post facto; ils ne peuvent être définis qu’après leur différenciation en lignées cellulaires spécifiques. Dans les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Développent ex uterodes embryons de poisson-zèbre et par fécondation après 48 h (hpf) ont généré définitif HSPCs. tests afin d’évaluer la différenciation HSPC et capacités de prolifération ont été développées, utilisant la transplantation et suivantes reconstitution du système hématopoïétique en plus de la visualisation des lignées transgéniques spécialisées avec la microscopie confocale. Cependant, ces essais sont coût prohibitif, techniquement difficile et chronophage pour de nombreux laboratoires. Développement d’un modèle in vitro pour évaluer HSPCs serait rentable, plus rapide, et présentes moins de difficultés par rapport à précédemment décrit les méthodes, permettant aux laboratoires d’évaluer rapidement des écrans mutagenèse et de drogues qui affectent la biologie HSPC. Cette analyse roman in vitro pour évaluer HSPCs est réalisée par les embryons de poissons zèbres entier de placage dissociée et ajout des facteurs exogènes qui favorisent seulement la CSPH différentiation et la prolifération. Embryons sont dissociés en cellules individuelles et plaqués avec HSPC conciliants facteurs stimulants de colonie qui les amènent à générer des unités formant colonies (UFC) qui proviennent d’une cellule unique ancêtre. Ces tests devraient permettre un examen plus attentif des voies moléculaires responsables de la prolifération, la différenciation et la réglementation, ce qui permettra aux chercheurs de comprendre les fondements de l’hématopoïèse vertébré et son dérèglement HSPC au cours de la maladie.

Introduction

L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu'à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la ....

Protocole

Le Conseil consultatif institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) à la California State University, Chico, approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous.

1. eau de Javel 48 hpf embryons de poisson-zèbre

1. Avec 15 cm x 15 (w) cm (l) x contenants de plastique de 7 cm (h) créer des stations de lavage 3 : 1) avec 1 mL d’eau de Javel 5 % dans 1000 mL de milieu d’embryon (E3 ; voir tableau 1), 2) avec E3 stérile et 3) E3 stérile. Veiller à ce que chaque conteneur possède 500 mL de solution de submerger les embryons dans.
   Remarque : Pour chaque condition testée, au moins 10 embryons seront nécessaires. Ce....

Résultats

Pour évaluer les numéros HSPC chez le poisson zèbre embryonnaire, 48 embryons hpf ont été digérés, plaqués en méthylcellulose présentant des facteurs de croissance hématopoïétiques conciliants exogènes et incubés pendant 7 jours (Figure 1A). Après 7 jours, unités formant colonies (UFC) ont été énumérés (Figure 1B) et représentation (Figure 1C). En co.......

Discussion

Le système de modèle de poisson-zèbre est devenu un modèle efficient, efficace et peu coûteux pour étudier l’hématopoïèse vertébré primitif et définitive. Génération de tests qui sont rapides, peu coûteux et présenter quelques difficultés techniques peut être utilisée pour les essais de petites molécules, analysant les embryons mutants et élucider les voies moléculaires importantes pour la biologie HSPC. In vitro un placage de HSPCs de poisson-zèbre adulte est une méthode efficace pour étudier la mutagenèse, cyt.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % d’albumine sérique bovine dans les technologies MDM	StemCell d’Iscove	9300
DPBS (10x) avec Calcium2+ et Magnésium2+	Life Technologies	14080-055
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
; DMEM 500 mL	Corning CellGrow	10-017-CV
; Ham’s F12 500 mL	Corning CellGrow	10-080-CV
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HEPES 100 mL (1 M)	Gibco life technologies	15-630-080
Pénicilline/streptomycine (5000 U/mL et 5000 mg/mL) avec L-Glutamine (200 mM)	Corning Mediatech	30-009-CI
Sulfate de gentamycine 10 mL (50 mg/mL)	Corning Mediatech	30-005-CR
Tube MCF 1,5 mL	FisherBrand	05-408-129
Aiguille d’injection 3 mL 23gx1 avec Luer lock	BD Safety Glide	305905
5 mL Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine	Corning Falcon 352235
Methocel MC	Sigma-Aldrich	64630
14 mL Tube à fond rond en polystyrène	Corning Falcon	352057
10 mm polystyrène easygrip Boîte de Pétri	Corning Falcon	351008
Librease TM	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	protéase de dissociation
Pronase Roche	Sigma-Aldrich	11459643001	protéase de déchorionation
15 cm Boîte de Pétri	Corning Falcon	351058
AB	Centre international de ressources pour le poisson zèbre (ZIRC)	ZL1	souche de poisson-zèbre utilisée
Dithiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	646563