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Article de méthode

Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/56836

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30 novembre 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (HSPCs) chez le poisson zèbre embryonnaire. HSPCs de poisson-zèbre dissocié sont plaqués en méthylcellulose facteurs favorables, DIFFERENCIATION en sang mature. Cela permet la détection du sang des défauts et permet aux médicaments de dépistage doit être réalisée facilement.

Résumé

L’hématopoïèse est un processus cellulaire essentiel dans lequel des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) se différencient en la multitude de lignées cellulaires qui composent le sang mature. Isolement et identification de ces HSPCs est difficile parce qu’ils sont définis ex post facto; ils ne peuvent être définis qu’après leur différenciation en lignées cellulaires spécifiques. Dans les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Développent ex uterodes embryons de poisson-zèbre et par fécondation après 48 h (hpf) ont généré définitif HSPCs. tests afin d’évaluer la différenciation HSPC et capacités de prolifération ont été développées, utilisant la transplantation et suivantes reconstitution du système hématopoïétique en plus de la visualisation des lignées transgéniques spécialisées avec la microscopie confocale. Cependant, ces essais sont coût prohibitif, techniquement difficile et chronophage pour de nombreux laboratoires. Développement d’un modèle in vitro pour évaluer HSPCs serait rentable, plus rapide, et présentes moins de difficultés par rapport à précédemment décrit les méthodes, permettant aux laboratoires d’évaluer rapidement des écrans mutagenèse et de drogues qui affectent la biologie HSPC. Cette analyse roman in vitro pour évaluer HSPCs est réalisée par les embryons de poissons zèbres entier de placage dissociée et ajout des facteurs exogènes qui favorisent seulement la CSPH différentiation et la prolifération. Embryons sont dissociés en cellules individuelles et plaqués avec HSPC conciliants facteurs stimulants de colonie qui les amènent à générer des unités formant colonies (UFC) qui proviennent d’une cellule unique ancêtre. Ces tests devraient permettre un examen plus attentif des voies moléculaires responsables de la prolifération, la différenciation et la réglementation, ce qui permettra aux chercheurs de comprendre les fondements de l’hématopoïèse vertébré et son dérèglement HSPC au cours de la maladie.

Introduction

L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu'à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la majorité des cellules sanguines qui sont post-mitotiques et être recyclé tous les jours. CSH génère des cellules sanguines matures en premier différenciant en sous-ensembles de cellules progénitrices restreinte ; commune cellules souches lymphoïdes (SPDP)1, qui finit par produire des cellules T et B NK et commune progéniteurs myéloïdes (CMPs)2 qui génèrent les granulocytes, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes. Ces cellules souches se sont engagés à générer des lignées cellulaires spécifiques et davantage se différencient en plus progéniteurs développemental restreints tels que les progéniteurs érythroïdes myéloïde (députés) qui génèrent des érythrocytes et des plaquettes ou des granulocytes progéniteurs de macrophages (BPF) qui génèrent des basophiles, éosinophiles, neutrophiles et les macrophages2. Identifier et isoler ces cellules souches permettent l’identification d’importants mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation hématopoïétique et de nombreuses maladies hématopoïétiques telles que la leucémie se posent lorsque ces cellules progénitrices ne pas correctement faire la différence.

Dans les dernières décennies, le système de modèle de poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un outil de recherche d’études hématopoïétiques embryonnaires et adultes. Poisson zèbre se prêtent à des analyses génétiques et sont les espèces de vertébrés modèle phylogénétiquement plus bas qui ont une vascularisation similaire et le système hématopoïétique aux humains. Développent des embryons de poisson-zèbre ex utero, et dans les 48 heures après la fécondation (hpf) générer HSPCs3,4,5,6,7,8. Poisson zèbre sont également très fécondes, les femelles portant sur 100 oeufs dans une seule couvée, permettant la réplication expérimentale et de vastes échantillons. Des embryons de poisson-zèbre sont optiquement transparentes, permettant une visualisation microscopique du système hématopoïétique. Plusieurs lignées transgéniques fluorescentes de poisson-zèbre marquage autorenouveler comme runx1: EGFP poisson9, cd41: EGFP pêcher10, et kdrl :mCherry ; CMJN: GFP3 double-positifs animaux, permettent pour la visualisation en temps réel de HSC émergence et l’expansion in vivo3,4,7,8, 9. Génération rapide temps et développement ex utero du poisson-zèbre a mené à son utilisation en mutagénèse études11,12,13,14,15 et drogues le dépistage de16,17,18,19,20 pour les composés qui sont thérapeutiques prometteuses pour troubles du sang humain. Dans l’ensemble, conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignées transgéniques et l’heure de régénération rapide a fait le poisson-zèbre, un modèle peu coûteux, rapide, flexible et idéal pour les études hématopoïétiques.

Nombreuses méthodes d’isolement et CSH ont été développés dans des systèmes hématopoïétiques chez les mammifères. Les enquêteurs peuvent utiliser une combinaison de récepteurs membranaires à Marc autorenouveler21,22,23,24, en plus d’exploiter la capacité des CSH à efflux colorant25,26. Après qu’ils sont étiquetés, cellule activée par fluorescence triant (FACS) permet leur séparation physique. Ce qui prouve qu’une cellule est un HSC nécessite irradier un animal hôte pour détruire HSPCs endogènes, repiquage autorenouveler putatif et en observant les reconstitution à long terme, lignée multiples de tous matures des types de cellules sanguines. Ces tests fonctionnent bien chez la souris, comme il y a de nombreux anticorps de surface cellulaire contre les cellules hématopoïétiques et souches de souris consanguines qui facilitent le système immunitaire correspondant à la transplantation. Cependant, quelques poissons zèbres hématopoïétiques anticorps de surface cellulaire ont été généré27, empêchant l’identification et l’isolement des CSH. La façon la plus courante pour marquer et isoler le poisson-zèbre CSH est avec des animaux transgéniques, selon lequel une séquence promotrice de la spécificité cellulaire est le moteur expression de la protéine fluorescente. Études ont visualisé et énuméré les CSH dans la paroi ventrale de l’aorte dorsale au microscope utilisant cette technique3,4,8,9. Autres laboratoires ont généré des souches clonales du poisson-zèbre28,29 et ont effectué des greffes réussies dans animaux appariés MHC30. Toutefois, ces techniques sont inabordable pour de nombreux laboratoires, sont techniquement difficiles et demandent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, les laboratoires ont généré plusieurs essais in vitro pour tester la présence, le taux de prolifération et la capacité de différenciation des HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Ces tests montrent la prolifération et la différenciation des HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, le sauvetage des hématopoïétiques défauts36et une méthode efficace pour découvrir et tester les cytokines33,34,35. Ils ont également été utilisés pour identifier les gènes responsables de la CSPH biologie31,32. Dans cette étude, nous prenons ces tests un peu plus loin, ce qui permet le dosage des HSPCs dans un embryon de poisson zèbre. Ces tests peuvent également être utilisées pour quantifier le nombre de HSPCs chez les animaux mutants et animaux traités avec des médicaments hématopoïétiques sans interruption. Essentiellement, ces tests sont rapides, présentes quelques difficultés techniques et des moyens peu coûteux pour quantifier les numéros HSPC, examiner leur prolifération et enquêter sur les blocs dans la différenciation.

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Protocole

Le Conseil consultatif institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) à la California State University, Chico, approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous.

1. eau de Javel 48 hpf embryons de poisson-zèbre

  1. Avec 15 cm x 15 (w) cm (l) x contenants de plastique de 7 cm (h) créer des stations de lavage 3 : 1) avec 1 mL d’eau de Javel 5 % dans 1000 mL de milieu d’embryon (E3 ; voir tableau 1), 2) avec E3 stérile et 3) E3 stérile. Veiller à ce que chaque conteneur possède 500 mL de solution de submerger les embryons dans.
    Remarque : Pour chaque condition testée, au moins 10 embryons seront nécessaires. Cette procédure de lavage peut accueillir jusqu'à 200 embryons.
  2. Avec une pipette de transfert, placez les embryons dans une passoire à thé et plonger les oeufs dans la station de lavage #1 pour 5 min. Retirez la passoire à thé (avec des embryons à l’intérieur) et placez dans la station de lavage #2 pendant 5 min ; Répétez pour station de lavage #3 pour un final 5 min.
  3. Après le dernier lavage, rinçage des embryons de passoire à thé en tournant à l’envers sur une boîte de Petri propre de 10 cm et rincer doucement les embryons au large de la passoire à thé avec E3 stérile et une pipette de transfert.

2. Dechorionate embryons

  1. Avec une pipette de transfert, enlever et jeter autant E3 que possible de la boîte de Pétri et ajouter 500 μl de dechorionation protéase (10 mg/mL) aux embryons. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Tapotez doucement le côté de la boîte de Pétri pour supprimer complètement les chorions.
  2. Avec une pipette sérologique, ajouter 20 mL d’E3 stérile pour diluer la protéase. Permettre aux embryons de s’installer et supprimer l’E3 avec une pipette de transfert. Répétez cette étape de lavage 3 fois pour éliminer toute trace de la protéase de dechorionation.

3. préparation des échantillons de l’embryon

  1. À l’aide d’une pipette P1000, placez 10 embryons dans un tube de microcentrifuge unique stérile de 1,5 mL.
  2. Retirer l’E3 avec une pipette et jeter.
    ATTENTION : Pipetter avec soin car les embryons peuvent facilement être déplacées et rejetées au cours des étapes de lavage suivant.

4. préparation des embryons de Dissociation

  1. Transférer des échantillons de hotte à flux laminaire et laver les embryons en ajoutant 1 mL stérile E3. Permettre aux embryons se déposent au fond du tube et éliminer le surnageant avec une pipette P1000. Répéter pour un total de 3 lavages.
  2. Après le dernier lavage, enlever E3 et jeter. Ajouter 1 mL de 10 mM le dithiothréitol (DTT) en E3 pour enlever la couche de mucus (et spores, levure ou les bactéries qui peuvent être piégés dedans) qui entoure le poisson-zèbre embryonnaire. Poser des tubes de microcentrifuge horizontalement et incuber à température ambiante sous hotte à flux laminaire pour 25 min.

5. embryon Dissociation

  1. Laver l’échantillon 3 fois avec 1 mL de SPD stérile (avec Ca2 + , Mg2 +). Après le dernier lavage Ajouter 500 μl de SPD (avec Ca2 + , Mg2 +) et ajouter 5 μl de protéase de dissociation de 5 mg/mL (26 U/mL).
    ATTENTION : Cette enzyme a besoin de Ca2 + et Mg2 +, donc vous assurer que le SPD contienne ces ions.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un agitateur orbital horizontal à 180 tr/min à 60 min. des échantillons de Place dans la hotte à flux laminaire et triturer les embryons avec un P1000 jusqu'à ce que les échantillons sont complètement dissociées.
    ATTENTION : Vérifier périodiquement pour déterminer quand ils deviennent dissociés des embryons. La solution de l’embryon doit avoir une quantité de tissu présent ; il ne devrait pas être complètement homogène. Il est possible de digérer excessive, qui détruira les HSPCs (voir la Figure 1).

6. préparation des embryons dissociés

  1. Embryons de pipette le 10 dissocié sur le réservoir supérieur d’un polystyrène de 5 mL rond tube inférieur avec un bouchon de crépine de cellule 35 μm.
  2. Avec une pipette, rincer le tube de Petri avec PBS stérile (sans et Ca2 + Mg2 +) et la solution de transfert de 5 mL tube en polystyrène contenant filtré les cellules de l’étape 6.1. Répétez jusqu'à ce que 4 mL de liquide est présent dans le tube de 5 mL en polystyrène.
    NOTE : PBS, SPD ou autres solutions tampon isotoniques peuvent être utilisées à ce stade, tant qu’ils ne contiennent pas de Ca2 + ou Mg2 +
  3. Centrifuger les tubes à 4 ° C et 300 x g pendant 5 min granuler l’échantillon homogénéisé cellulaire. Avec une pipette, retirer et jeter le surnageant du tube fond rond. Prenez soin de ne pas perturber les cellules granulés au fond du tube. Remettre en suspension les cellules dans 100 μl de PBS.

7. préparation de méthylcellulose

  1. Générer la solution stock de méthylcellulose complète (tableau 1) 1 x et ajouter 2,5 mL de tubes stériles fond rond 14 mL mL 3 seringues et aiguilles de 16 G. Utiliser un tube pour chaque condition testée.
  2. Ajouter des cytokines, petites molécules ou autres agents pour être étudiés dans chaque échantillon.
    1. De différenciation myéloïde, ajouter 1 % carpe sérum et 0,3 mg/mL zebrafish recombinants des colonies de granulocytes stimulant facteur (GC & SF)34 au milieu de la méthylcellulose. Voir Svoboda et al. 37 pour la description complète sur la façon de générer des cytokines de sérum et recombinant carpe.
    2. Pour la différenciation érythroïde, ajouter 1 % carpe sérum et 0,1 mg/mL zebrafish recombinant érythropoïétine (Epo)38 au milieu de la méthylcellulose.
    3. Pour examiner les progéniteurs multilignées, ajouter Epo et GC & SF.
      ATTENTION : Cytokines et additifs doivent total pas plus de 10 % du volume total, comme le milieu ne seront pas suffisamment visqueux pour discerner les colonies individuelles.

8. Ajout d’embryons dissociés de méthylcellulose

  1. À l’aide d’une pipette, ajouter 100 μL des dissociation 10 embryons à la surface de la méthylcellulose préparé avec du sérum de cytokines et carp recombinant. Bouchon couvercle et vortex doucement pour bien homogénéiser échantillon. Chaque tube doit maintenant contenir les tissus dissociés des 10 embryons.
  2. À l’aide de seringues de 3 mL et G 16 aiguilles, aliquote 1 mL d’échantillon dans les 2 boîtes de Pétri séparé de 35 mm. S’assurer que l’échantillon est entièrement dispersée tout au long de la boîte de Pétri. Répétez pour chaque échantillon.
  3. Placer les plats de Pétri de 35 mm avec des cellules dans méthylcellulose dans une boîte de Pétri de 15 cm. À chaque plat de 15 cm, ajouter une plaque de Petri 35 mm avec 5 mL d’eau stérile pour humidifier les échantillons. Incuber à 32 ° C et 5 % de CO2 pendant 7 à 10 jours.

9. visualisation des unités (UFC) formant des colonies HSPC dérivés

  1. Après incubation de 7 jours, placer les échantillons sur un microscope inversé à X 40-100 pour la visualisation et l’énumération. À ce stade, les colonies individuelles peuvent être isolés avec une pipette et soumis à l’analyse de coloration ou de gène.

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Résultats

Pour évaluer les numéros HSPC chez le poisson zèbre embryonnaire, 48 embryons hpf ont été digérés, plaqués en méthylcellulose présentant des facteurs de croissance hématopoïétiques conciliants exogènes et incubés pendant 7 jours (Figure 1A). Après 7 jours, unités formant colonies (UFC) ont été énumérés (Figure 1B) et représentation (Figure 1C). En co...

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Discussion

Le système de modèle de poisson-zèbre est devenu un modèle efficient, efficace et peu coûteux pour étudier l’hématopoïèse vertébré primitif et définitive. Génération de tests qui sont rapides, peu coûteux et présenter quelques difficultés techniques peut être utilisée pour les essais de petites molécules, analysant les embryons mutants et élucider les voies moléculaires importantes pour la biologie HSPC. In vitro un placage de HSPCs de poisson-zèbre adulte est une méthode efficace pour étudier la mutagenèse, cyt...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Financé par le National Institutes of Health (NIH : K01-DK087814-01 a 1 à D.L.S.), Program de la California State University pour l’éducation et de recherche en biotechnologie (CSUPERB : contrôle moléculaire de la Niche hématopoïétiques vertébrés à D.L.S.) et du Bureau des études supérieures au California State University Chico (à A.C.B.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % d’albumine sérique bovine dans les technologies MDMStemCell d’Iscove9300
DPBS (10x) avec Calcium2+ et Magnésium2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  ; DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV
  ; Ham’s F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
Pénicilline/streptomycine (5000 U/mL
et 5000 mg/mL) avec L-Glutamine (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
Sulfate de gentamycine 10 mL (50 mg/mL)Corning Mediatech30-005-CR
Tube MCF 1,5 mLFisherBrand05-408-129
Aiguille d’injection 3 mL 23gx1 avec Luer lockBD Safety Glide305905
5 mL Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépineCorning Falcon 352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Tube à fond rond en polystyrèneCorning Falcon352057
10 mm polystyrène easygrip Boîte de PétriCorning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001protéase de dissociation
Pronase RocheSigma-Aldrich11459643001protéase de déchorionation
15 cm Boîte de PétriCorning Falcon351058
ABCentre international de ressources pour le poisson zèbre (ZIRC)ZL1souche de poisson-zèbre utilisée
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563

Références

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