Article de méthode

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

DOI :

10.3791/56850

⸱

12 février 2018

 ,  ,  ,  , 
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Dans cet article

Résumé

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Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-qPCR est l’une des méthodes plus courantes pour évaluer des miARN cible individuelle. Les niveaux de miARN sont généralement mesurés par rapport à un échantillon de référence. Cette approche est appropriée pour l’examen des changements physiologiques dans le taux d’expression de gènes cibles. Cependant, quantification absolue en utilisant mieux l’analyse statistique est préférable pour une évaluation complète des niveaux d’expression de gène. Quantification absolue est toujours pas d’usage courant. Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de plasma miRNA, utilisant la RT-qPCR avec ou sans pré amplification.

Un volume fixe (200 µL) de plasma EDTA a été préparé à partir le sang prélevé à la veine fémorale commune des singes cynomolgus consciente (n = 50). L’ARN total a été extrait en utilisant le système disponible dans le commerce. Plasma miARN ont été quantifiés par sonde RT-qPCR analyses qui contient la sonde et amorces PCR miRNA spécifique marche avant/marche arrière. Des courbes standard pour la quantification absolue ont été générés utilisant des oligonucléotides de RNA synthétiques disponibles dans le commerce. Un cel-miR-238 synthétique a été utilisé comme un contrôle externe pour la normalisation et l’évaluation. Les miARN qui présentaient de quantification des valeurs de cycle (Cq) au-dessus de 35 ont été pré amplifié avant l’étape de qPCR.

Parmi les 8 miARN examinés, miR-122, miR-133 a et miR-192 étaient détectables sans pré-amplification, tandis que miR-1 et miR-206 miR-499 a requis pré-amplification à cause de leur taux d’expression faible. MiR-208 a et 208 miR-b n’étaient pas détectables même après préamplification. Efficacité de traitement d’échantillon a été évaluée par les valeurs de Cq de la cel-miR-238 enrichis. Dans cette méthode de dosage, variation de la technique a été estimée à moins de 3 fois et la limite de quantification (PPQM) était 102 copie/µL, pour la plupart des miARN examinés.

Ce protocole prévoit une meilleure estimation de la quantité de plasma miARN et permet l’évaluation de la qualité des données correspondantes de différentes études. Compte tenu que du faible nombre des miARN dans les fluides corporels, préamplification est utile pour améliorer la détection du mal exprimé miARN.

Introduction

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Un nombre croissant d’études ont été découverte de microARN (miARN) comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des cancers, ou surveiller et détecter d’autres maladies dans les études cliniques et non cliniques1,2,3 . Quantitative en temps réel de transcription inverse PCR (RT-qPCR) est l’une des méthodes plus courantes utilisées pour évaluer les miARN cible individuelle, parce que cette technique est plus sensible que « microarray »4 et séquençage de RNA basant plates-formes5. En général, l’expression miRNA est mesur....

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Protocole

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Toutes les expériences ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. préparation de l’échantillon

  1. Prélever le sang (au moins 0,5 mL) de la veine fémorale commune des macaques de Buffon dans les tubes EDTA contenant 2K.
    NOTE : Citrate et l’héparine ne sont pas acceptables car ces anticoagulants inhibent les PCR14,15.
  2. Placer les échantillons prélevés immédiatement sur la glace et processus pour l’isolement de plasma dans les 2 heures suivant le prélèvement.
  3. Centrifuger les échantillons à 10 000 x....

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Résultats

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Workflow de miRNA analyse par RT-qPCR et qualité assessment
La figure 1 illustre le flux de travail de miRNA analyse d’échantillons de sang à l’aide de qPCR10. La qualité des expériences peut être vérifiée en incluant cel-miR-238 comme un contrôle externe. Cela révélera variations techniques d’extraction de l’ARN et traite de la RT-qPCR ultérieur. Dans cette étude, la moyenne ± écart type des valeurs calcul.......

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Discussion

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Notre évaluation globale a fourni une analyse statistique plus rigoureuse de l’étendue de la gamme dynamique, qui indique clairement que l’ampleur de la variation entre les échantillons individuels était extrêmement différent parmi les miARN testé. Bien que ces variations peuvent être attribuables à leurs petites quantités dans les fluides corporels, il convient de noter que ces données reflètent non seulement des variations biologiques, mais aussi des variantes techniques. La plupart de la variation de la technique peut.......

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Déclarations de divulgation

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L’auteur n’a aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

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Cette recherche n’a pas reçu une subvention spécifique de bailleurs de fonds dans les secteurs publics, de commerciale ou à but non lucratif.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube BD Microtainer (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974Pour le prélèvement sanguin
Tubes PCR Eppendorf, 0,2 mLEppendorf
Eppendorf Safe-Lock 0030120086Eppendorf
Safe-Locknbsp ; 2,0 mLEppendorf0030120094
Oligonucléotide synthétiqueSystème d’HokkaidoScience-MiARN individuel (0,2 &mu ; mol,grade HPLC)
Tampon Tris-EDTA  ; (pH 8,0)Nippon Gene314-90021TE
buffer Buffer RPEQIAGEN-Contenudans le mini kit miRNeasy  ;
Tampon RWTQIAGEN-Contenudans le mini kit miRNeasy  ;
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Eau sans nucléases  ;QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contenudans le mini kit miRNeasy  ;
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  ;QIAGEN219600ID :MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptateursTAIGEN Bioscience CorporationS0120Pour l’extraction d’ARN
VacEZor 36 Système completTAIGEN Bioscience CorporationM3610Pour l’extraction d’ARN
7900HT Système de PCR rapide en temps réelThermo Fisher Scientific Inc.4351405rapide à bloc GeneAmp à 96 puits
9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Plaque de réactionThermo Fisher Scientific Inc.
Film adhésif optique MicroAmpThermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.
Dosages de microARN TaqMan (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 000248
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 002245
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 002246
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 002222
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 000491
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 000510
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 000511
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 002290
Dosages de microARN TaqMan (has-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID du test : 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription		Kit Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp Master Mix (2&fois ;)Thermo Fisher Scientific Inc.
Chloroforme  ;Wako Pure Chemicals035-02616
Éthanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456
Microtubes à essai 0030124359 1,5 mL Microtubes à essai système de PCR 43469074311971444455743665974391128

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers ....

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Mots-clés

Quantification des micro ARN plasmatiquesProtocole de RT qPCROligonucl otides d ARN synth tiquestape de pr amplificationG n ration de la courbe standardNormalisation par contr le externeLimite inf rieure de quantificationvaluation de la variation technique

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