Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

Résumé

Un standard Western blotting protocole a été optimisé pour analyser aussi peu que 500 souches hématopoïétiques ou de cellules progénitrices. Optimisation implique attention manipulation de l’échantillon cellulaire, limiter les transferts entre les tubes et lyse directement les cellules de la mémoire tampon de Laemmli témoin.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules rares, avec la moelle osseuse de souris contenant seulement ~ 25 000 phénotypique long terme autorenouveler repopulation. Un protocole Western Blot a été optimisé et adapté à l’analyse d’un petit nombre de CSH (500-15 000 cellules). Autorenouveler phénotypiques ont été purifiés, compté avec précision et lysées directement dans la mémoire tampon de Laemmli témoin. Lysats contenant un nombre égal de cellules ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE), et la tache a été préparée et traitées suite à la série Western blotting protocoles. Utilisant ce protocole, 2 000-5 000 CSH peut être systématiquement analysée, et dans certains cas peuvent être tirées d’aussi peu que 500 cellules, par rapport à des cellules de 20 000 à 40 000 rapportés dans la plupart des publications. Ce protocole devrait être généralement applicable à d’autres cellules hématopoïétiques et permet l’analyse de routine d’un petit nombre de cellules à l’aide de procédures standard de laboratoire.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont autorenouvellement des cellules qui peuvent donner lieu à toutes les lignées de sang. Ils sont relativement rares cellules dans la moelle osseuse, analyses biochimiques de rendu difficile. Approprié pour l’analyse des cellules rares, comme la cytométrie en flux, des approches ont été très utiles pour quantifier les quantités relatives des marqueurs de surface de cellules et de protéines intracellulaires. Cependant, l’analyse des protéines intracellulaires nécessite l’utilisation de procédures de perméabilisation de cellules pour permettre l’accès d’anticorps, et pas tous les épitopes de surface survivent ces procédures^1,2. En outre, les anticorps qui établissent une discrimination entre les produits de différentes protéines isoformes ou de clivage ne sont pas souvent disponibles pour cytométrie en flux, et donc enquêteurs comptent encore sur les transferts Western pour certains types d’analyses.

Analyse par Western blot des lysats cellulaires est une procédure de routine dans la plupart des laboratoires. Cellules peuvent être épurées dans des conditions natives qui préservent les épitopes de molécules de surface de cellules, et par la suite, lysats cellulaires peuvent être préparés et analysés. Cependant, l’analyse des protéines dans des cellules primaires rares populations par Western blot peut exiger euthanasier un grand nombre d’animaux pour obtenir suffisamment de cellules. En faisant de petits ajustements à plusieurs étapes, un protocole épongeant occidental conventionnel a été en mesure de détecter les protéines dans un relativement petit nombre de CSH (500-15 000, selon la protéine d’intérêt). Les réglages comprennent exactement compter les cellules, manipuler avec précaution le culot cellulaire, réduisant les transferts de cellules entre tubes pour minimiser la perte de cellules, et lyse un nombre défini de cellules avec une charge concentrée de la mémoire tampon contenant du protéasome et inhibiteurs de la phosphatase. Plusieurs rapports publiés incluent des Western blots obtenus avec 20 000 ou plusieurs CSS^3,4,5,6,7; Cette procédure très simple permettra de réduire le nombre de cellules et les animaux de laboratoire nécessaires pour produire les données équivalentes d’entre 4 et 40 fois. Le protocole vise à normaliser les résultats sur une base par cellule, plutôt qu’à un contrôle interne. Cela permet de détecter une réduction globale des taux de protéines qui peut être négligée si les données sont normalisées à un contrôle interne. L’importance de la normalisation sur une base par cellule a été décrit pour l’analyse du gène expression données⁸, et le même principe s’applique à la quantification des protéines par Western blot. Ce protocole optimisé devrait être utile pour tous ceux qui ont besoin d’analyser un petit nombre de cellules.

Protocole

Toutes les opérations doivent être exécutées conformément aux directives de soins et de l’utilisation institutionnelle des animaux. La procédure a été développée pour l’analyse de des cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (CSH et HPs), mais peut être adaptée pour l’analyse des autres populations de cellules.

1. écoulement Cytometry isolement d’autorenouveler murin et HPs

1. Récolter les murins de la moelle osseuse des cellules comme décrit dans la littérature⁶.
   Remarque : Dans les données présentées au tableau 1 et Figure 2, la moelle osseuse a été récoltée de souris C57BL/6J.
2. Effectuer l’appauvrissement de la lignée de cellules de moelle osseuse à l’aide d’un kit souris de lignée épuisement, suivant les instructions du fabricant.
3. Incuber les cellules avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface de cellules d’intérêt comme décrit⁷. Dans les expériences illustrés à la Figure 1 et Figure 2, anticorps anti-Sca-1, Kit, Flt3 et marqueurs de la lignée (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 et Ter119 est utilisées.
4. Trier 2 000-20 000 Sca1 de Lin^{– +}Kit⁺ Flt3 cellules^– (CSH) ou Lin^–Sca1^–cellules Kit⁺ (HPs) dans des tubes Eppendorf 1,5 mL contenant 0,1 mL de phosphate buffered saline (PBS) avec 2 % fœtale bovine sérum (FBS).
   Remarque : Pour les données indiquées dans la Figure 1 et Figure 2, cellules étaient triés à l’aide d’un cytomètre de flux avec un gicleur de 70 µM. Le volume de la collection maximale est de 1,4 mL.

2. préparation de l’échantillon

Remarque : Cette étape est critique. Traiter l’échantillon très soigneusement. Lorsque vous retirez le surnageant, faites très attention à ne pas déranger le culot cellulaire.

1. Centrifuger le 1.5 mL tubes contenant des cellules triées dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 g, pendant 5 min. retirer tout sauf environ 100 µL de surnageant de la cellule a granulé très délicatement à l’aide d’une pipette et une pointe de pipette 20 µL. Ne pas déranger le culot.
   1. Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules, et le volume total de l’échantillon trié est inférieur à 0,2 mL, transférer les cellules tout d’abord à tubes PCR de 0,2 mL de liaison faible avant la centrifugation.
   2. Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules et le volume est de plus de 0,2 mL, tourner les cellules vers le bas avec une centrifugeuse à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min et supprimer tout sauf 200 µL du liquide surnageant. Remettre en suspension les cellules granulés dans le restant de 200 µL de surnageant, puis transférer les cellules dans les tubes PCR de 0,2 mL et tourner de nouveau vers le bas. Retirer la pastille, mais tous les 20-30 µL après le deuxième tour et remettre en suspension les cellules.
2. Remettre en suspension les cellules dans la gauche surnageante dans le tube. Si nécessaire, ajouter PBS supplémentaires chez 2 % FBS/PBS (vous pouvez également utiliser 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) / PBS, ou PBS seul) pour obtenir une concentration de 5 x10⁴ à 5 x 10⁵ cellules/mL.
   NOTE : Utiliser la numération des lymphocytes collectés par cytométrie de flux pour estimer le volume utilisé pour suspendre des cellules.
3. 2 à 5 µL de cellules remises en suspension permet de déterminer une concentration de cellules précises à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (suivant les instructions du fabricant) ou un hémocytomètre⁹.
4. Transférer un volume de cellules remises en suspension contenant le nombre de cellules dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Pour l’expérience à la Figure 1, 500, 1 000 ou 2 000 csh ou HPs ont été transférés. Le nombre de cellules dépend de la puissance du signal obtenu par Western blot et est déterminé empiriquement. Effectuer le transfert à l’aide d’un 20 µL ou pointe de pipette 100 µL Eppendorf.
5. Centrifuger les cellules dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min.
6. Pour générer 100 x solutions courantes, dissoudre les inhibiteurs du protéasome et phosphatase dans le DMSO selon les instructions du fabricant.
7. Préparer 2 x Laemmli solution tampon en diluant la 4 x Laemmli solution tampon fourni par le fabricant avec une quantité équivalente d’eau distillée. Ajouter une quantité appropriée de l’encours de 100 x des inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 2 inhibiteurs de x à 2 x Laemmli solution tampon.
   Remarque : La x Laemmli solution tampon 2 peut être faite à l’avance, mais les inhibiteurs du protéasome et phosphatase devraient être ajoutés immédiatement avant d’ajouter le 2 x Laemmli solution tampon (plus inhibiteurs) pour le culot cellulaire pour lyser les cellules, comme décrit dans l’étape suivante.
8. Soigneusement, enlever une partie du liquide surnageant du culot cellulaire et le surnageant restant dans le tube avec le culot cellulaire, ajouter un volume égal de 2 x Laemmli solution tampon plus inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon.
   NOTE : par exemple, si vous passez 2 000 cellules dans un volume total de 20 µL à un tube en étape 2.5, après centrifugation des cellules (étape 2.6), vous devez supprimer 18 µL de surnageant de la pastille et à la 2 µL de liquide surnageant qui est restant ajouter un volume égal (2 µL) de 2 x Laemmli solution tampon pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon.
9. Resuspendre le culot pour générer le lysat dès que possible. À ce stade, les échantillons peuvent être immédiatement PST1 par des gels SDS-PAGE, ou peut être snap figé dans le liquide N₂ et stockée à-80 ° C pour une utilisation future.

3. électrophorèse

1. Faire chauffer les lysats dans un bloc chauffant à 95 ° C ou dans l’eau bouillante pendant 5 min.
2. ELECTROPHORESE 1-40 µL des lysats (contenant de 500 jusqu'à 20 000 équivalents de cellule) par des gels SDS-PAGE à 100V à l’aide de protocoles standard¹⁰.
   Remarque : Le volume du lysat chargé dans le gel est déterminé par le nombre de cellules nécessaires pour générer le signal souhaitable et dépendra de l’abondance de la protéine d’intérêt et la qualité de l’anticorps. Les données à la Figure 1 ont été obtenues avec 500 équivalents de cellule de lysat, 1 000 et 2 000. La largeur du puits sont de l’ordre de 3 mm à 1,5 mm. 1,5 mm dents peuvent être coupée dans un peigne disponible dans le commerce avec des dents plus larges à l’aide de ciseaux.

4. transfert et bloquer

Remarque : Effectuez une suite de protocoles standard¹¹la tache occidentale. Les étapes sont brièvement décrites ici :

1. Pré-traiter une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane avec du méthanol pendant 10 s, puis laver la membrane brièvement avec d’eau distillée.
2. La protéine de transfert du gel SDS-PAGE à la membrane en suivant les instructions dans le manuel fourni par le fabricant de l’appareil de transfert.
3. Après transfert, bloquer la membrane avec 2 mL de 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBST (PBS avec 0,1 % Tween) durant la nuit à 4 ° C à la suite de protocoles standard¹¹.

5. anticorps étiquetage

1. Incuber la membrane avec des anticorps sur un agitateur pendant une nuit à 4 ° C, en utilisant des dilutions d’anticorps recommandées par le vendeur.
   NOTE : Dans la Table des matières, des anticorps, qui nous avons validé pour CSH et HPs et les dilutions d’anticorps correspondants, sont montrées. Effectuer l’étiquetage d’anticorps à l’aide de procédures standard⁸.

6. détection

1. Laver la membrane 3 fois, 5 min pour chaque lavage dans le PBST à température ambiante.
2. Incuber la membrane avec 2 mL de tampon de chimiluminescence améliorée pendant 1 min à température ambiante. Détecter les signaux à l’aide d’un système d’imagerie, les instructions, ou film d’autoradiographie et processeur de film du fabricant.

Résultats

Des résultats représentatifs de 500-2 000 purifiée autorenouveler et HPs sont indiquées dans la Figure 1 et Figure 2. Le signal de β-actine dans la Figure 1 peut être détecté aussi peu que 500 autorenouveler et HPs purifiée à partir de la moelle osseuse de souris. Notez que les lysats de chargement dans les puits de 1,5 mm produit un signal beaucoup plus fort de 500 HPs chargement dans les puits de 3...

Discussion

Western Blot est une technique courante pour détecter les protéines spécifiques et l’activation des voies de signalisation dans les tissus ou cellules. Par l’introduction de petits ajustements à une procédure couramment utilisée, nous avons pu détecter systématiquement 15 différentes protéines (Table des matières) dans 15 000 GPX et dans certains cas en aussi peu que 500 CSH. The Most des étapes cruciales dans le présent protocole sont : 1) exactement compter les cellules 2) minimiser le nombre de transf...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
dodécylsulfate de sodium (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30 % Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Persulfate d’ammonium	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protéiforme 3 peigne	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Système de transfert	Bio-Rad	1704155EDU	transfert
PowerPac HC Alimentation	Bio-Rad	1645052EDU	électrophorèse
Système d’imagerie	Bio-Rad	1708195	détection de signal
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU préparation d’échantillons
10x Tris/Glycine/SDS Tampon d’électrophorèse	Bio-Rad	1610732EDU	Electrophorèse
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU Préparation d’échantillons
RTA Mini PVDF Transfer Kit, pour 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfert
Inhibiteur de protéase Cocktail	Sigma	11697498001	préparation d’échantillon
Inhibiteur de phosphatase Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	Préparation
d’échantillon	EIF4G	2469	Anticorps WB, validé dans 1000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : Fig2
Signalisation cellulaire	p-Rps6	Anticorps 4858	WB, validé dans 1000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : Fig2
actine (HRP conjuguée)	abcam	ab49900	Anticorps WB, validé dans 500 cellules concentration d’anticorps : 1:5000 référence(figure) : Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : Référence 1:1000 (figure) : ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)
Anticorps TSC2	Cell Signaling	4308	WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)
HSP90	Signalisation cellulaire	Anticorps 4877	WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)
Signalisation cellulaire	mTOR	2983	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	Anticorps WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : Référence 1:1000 (figure) : ref5 (FigS1)
Anticorps anti-WB p-AMPKa	Cell Signaling	2535	validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)
anticorps anti-actine	Santa Cruz	sc-47778	WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : 1:3000 référence(figure) : ref5 (Fig4)
Kit de déplétion de lignée (souris)	Miltenyi Biotec	130-090-858	purification de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques
Colonnes LS	Miltenyi Biotec	130-041-305	purification de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques
SCF	PeproTech	250-03	stimulation par phosphorylation
APC-Cy7 c-kit anticorps	ThermoFisher	A15423	tri cellulaire
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	tri
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	tri cellulaire
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	tri cellulaire
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	tri cellulaire
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82
Plaques d’espacement avec 1,0 mm intégré Espaceurs	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	bloquant la membrane
	Atlanta Biologicals	A12450	moyen supplément compteur
cellules	Invitrogen	AMQAF1000	hémocytomètre de comptage de cellules
	ThermoFisher	; S17040	comptage de cellules
flim	Denville Scientific	E3012	détection de
signal processeur de film médical	Konica	SRC-101A	détection de signal
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrat	Therom Scientific	34096	détection de signal
Allegra X-15R Centrifugeuse (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	échantillon préparation
BLUEstain échelle protéique	Gold Biotechnology	P007-500	trieur de cellules d’électrophorèse
	BD	FACSAria II	préparation d’échantillons
Incublock	Denville Scientific	I0510	électrophorèse