Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Résumé

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

Résumé

Méthylation de l’ADN est une modification épigénétique stable et héréditaire dans le génome de mammifères et est impliquée dans la régulation de l’expression des gènes pour contrôler les fonctions cellulaires. Le renversement de la méthylation de l’ADN, ou la déméthylation de l’ADN, est véhiculé par la famille de protéine de translocation (TET) de dix-onze de dioxygénases. Bien qu’il a été largement rapporté qu’aberrante de méthylation de l’ADN et de déméthylation sont associés à des anomalies du développement et cancer, comment ces changements épigénétiques contribuent directement à l’altération ultérieure dans la progression expression ou d’une maladie génétique reste floue, en grande partie en raison du manque d’outils fiables pour ajouter ou supprimer les modifications de l’ADN dans le génome à une résolution spatiale et temporelle définie adéquatement. Pour surmonter cet obstacle, nous avons conçu une enzyme split-TET2 pour permettre le contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et retouche ultérieure des États épigénétiques dans les cellules de mammifères en ajoutant simplement des produits chimiques. Nous décrivons ici les méthodes pour introduire un outil de retouche épigénome chimique-inductible (cidre), basé sur une enzyme machiné split-TET2, dans les cellules de mammifères et de quantifier la production inductible chimique de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) avec immunomarquage, cytométrie en flux ou un dosage de dot-blot. Cet outil de retouche épigénome chimique-inducible trouverez large utilisation en interrogeant les systèmes cellulaires sans modifier le code génétique, ainsi que dans la détection des relations epigenotype−phenotype dans les systèmes biologiques différents.

Introduction

Méthylation de l’ADN, pour la plupart fait référence à l’ajout d’un groupe de méthyle à la position du carbone 5 de cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC), est catalysée par l’ADN méthyl-transférase (DNMTs). 5MC agit comme une marque épigénétique majeure dans le génome de mammifères qui signale souvent pour répression transcriptionnelle, inactivation du chromosome x et transposon silencieux¹. Le renversement de la méthylation de l’ADN est médié par la famille de protéine de translocation (TET) dix-elven. Enzymes de TET appartiennent au fer (II) et 2-oxoglutarate dioxygénases dépendants qui catalysent l’oxydation successifs de 5mC 5-hydroxy....

Protocole

1. Culture, Transfection de plasmide et Induction chimique des cellules

1. Culture d’une lignée de cellules adhérentes (p. ex., l’embryonnaire rein humain cellules HEK293T) au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), additionnée de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
2. Transfecter les cellules avec le plasmide de cidre.
   1. Au moins 18 heures avant la transfection, semences 0,3 x 10⁶ cellules à 2,5 mL de DMEM approprié par bien dans une plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour atteindre 60 à 80 % confl....

Résultats

Conversion chimique de 5mC-à-5hmC inductible peut être validée par immunohistochimie au niveau de single-cell, analyse en cytométrie en flux sur les populations de cellules transfectées de (mCherry-positif) ou une épreuve plus quantitative de buvardage tel qu’illustré à la Figure 1. Le domaine catalytique de la TET2, ou TET2CD, ont été utilisés tout au long de l’étude comme témoin positif. Voir les références 18-20 pour plus amples renseignements sur la carto.......

Discussion

Ici, nous avons illustré l’utilisation d’une enzyme machiné split-TET2 pour obtenir un contrôle temporel des hydroxymethylation de l’ADN. Après la découverte de la famille TET de 5-methycytosine dioxygénase, de nombreuses études ont été réalisées à déchiffrer la fonction biologique des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC^{1,2,3, 4,5,}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lipofectamine 2000 Réactif de transfection	Thermo Fisher Scientific	11668027
Rapamycine	Sigma-Aldrich	37094
Paraformaldéhyde, solution à 16 %	VWR	100503-916
Triton X-100	Amresco	0694-1L
Acide chlorhydrique	Amresco	0369-500ML
Albumine, Bovin	Amresco	0332-100G
Tween 20	Amresco	0777-1L
Anticorps 5-Hydroxyméthylcytosine (5-hmC) (pAb)	Motif actif	39769
Chèvre anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
4,6-Diamidino-2-phénylindolde (DAPI)	Biotium	40043
SVAC1E SHEL LAB Four sous vide économique, 0,6 pi³ (17 L)	SHEL LAB	SVAC1E
UltraPure SSC, 20X	Thermo Fisher Scientific	15557036
Bio-Dot Apparatus	BIO-RAD	1706545
Anticorps anti-5-méthylcytosine (5mC), clone 33D3	Millipore	MABE146
Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps	liée à HRP	7076S
IgG anti-lapin,	Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps liée à la	7074S
West-Q Pico Dura ECL Solution	Gendepot	W3653-100

IgG anti-souris, HRP