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Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

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DOI :

10.3791/56859

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29 janvier 2018

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1Department of Pathology, Immunology and Experimental Medicine, University of Florida, 2Heller School for Social Policy and Management, Brandeis University, 3Department of Medicine, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Florida, 5Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un passif de protocole aux sections pancréas humain image en trois dimensions (3D) à l’aide en optimisé méthodes de compensation. Ce manuscrit montre ces procédures de compensation optique passive, suivie par plusieurs immunofluorescence souillant pour identifier les éléments clés des réseaux neurones autonomes et sensitifs innervant les îlots humains.

Résumé

À l’aide des méthodes histologiques traditionnelles, chercheurs sont gênés dans leur capacité à l’image entière tissus ou organes en 3D à grande échelle. Coupes histologiques sont généralement limités à < 20 µm dans le formol fixe paraffine section sur lames de verre ou < 500 µm pour les sections fixes flottantes. Par conséquent, des efforts considérables sont nécessaires pour série de coupes et de méthodes de reconstruction d’image à grande échelle pour recréer la 3D pour les échantillons > 500 µm selon les méthodes traditionnelles. En outre, la lumière se disperse de macromolécules dans les tissus, en particulier les lipides, empêche imagerie jusqu'à une profondeur > 150 µm avec des microscopes confocaux plus. Pour réduire le facteur de dispersion et autoriser pour l’imagerie des tissus profonds à l’aide de la microscopie confocale simple, diverses méthodes de compensation optique ont été développés que sont pertinentes pour les échantillons de tissus humains et rongeurs fixées par immersion. Plusieurs méthodes sont liées et utilisent des protéines de réticulation avec acrylamide et tissus clearing avec dodécylsulfate de sodium (SDS). Autres techniques de compensation optique utilisé divers solvants même si chaque modification avait divers avantages et inconvénients. Ici, on décrit une méthode de compensation optique passif optimisé pour l’étude de l’innervation de pancréas humain et plus précisément pour l’interrogation de l’innervation des îlots humains.

Introduction

Jusqu'à une date récente, 3 Dimensions (3D) reconstruction de grands tissus ou organes entiers a été réalisée par laborieuse série coupe, coloration et reconstruction de l’image de plusieurs sections. Ces méthodes ont plusieurs inconvénients, y compris un recours sur un grand nombre de coupes sériées, pénétration tissulaire pauvre avec des anticorps et diffusion de prévention imagerie profonde dans les tissus de la lumière. Pour permettre une plus grande lumière et de la pénétration de l’anticorps, les chercheurs ont élaboré des méthodes chimiques pour conserver les antigènes protéiques lors du retrait de la majorité des lipides de la dispersion de la lumière. Plusieurs les méthodes sont Clear Lipid-Exchanged Acrylamide hybridé rigide d’imagerie tissulaire hYdrogel (clarté), Technique Passive de clarté (PACT) et assisté par Perfusion Agent Release in situ (Sea) (évaluée à 1,2 ,3,4,5,,6). La méthode de clarté repose sur la stabilisation des protéines à l’aide d’un formaldéhyde et acrylamide bis hydrogel suivie par suppression de lipides dans une solution de SDS2par électrophorèse. Cette approche a été plus tard modifiée pour passif de compensation et avancée d’imagerie7. Optimisation conduit à l’élimination de bis et des pourcentages variables de paraformaldéhyde dans la solution d’hydrogel (1-4 %) pour obtenir la stabilisation optimale de l’antigène avec les délais de compensation pour une technique appelée Pacte 8. Premières tentatives pour mettre au point ces techniques de compensation optique impliqué des composés organiques ou d’autres qu’il était difficiles de travailler avec et trempés protéines fluorescentes endogènes chez les modèles murins transgéniques. Ces méthodes supplémentaires comprenaient des écailles, dégagée des Cocktails de cerveau/corps et Computational analysis (cubique), les méthodes interrupteur et Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organes (DISCO), toutes avec divers avantages et inconvénients9, 10,11,12. La méthode originale de clarté a été développée dans le tissu de cerveau de souris de riches en lipides et méthodes de compensation optique avaient peu d’essais dans les tissus humains7,8,11,13,14 .

Méthodes de compensation optique sont idéales pour les nerfs de traçage sur de longues distances comme souris intactes du système nerveux central. Le pancréas est bien innervé par des systèmes nerveux autonomes et sensorielles. Le compartiment endocrine du pancréas, îlots de Langerhans, composent une partie très petite de l’organe entier (1-2 %) et les îlots ont connu une hétérogénéité dans les tailles (50-250 µm), les proportions des cellules endocrines et la densité en particulier dans le diabète (revu en 15 ,,16). Dans l’élaboration d’un protocole, plusieurs méthodes de compensation optique ont été testés pour pancréas humain et une procédure du Pacte a été trouvée excellente conservation morphologique des nerfs et des îlots de fournir le meilleur équilibre de temps pour effacer (~ 2 semaines). La procédure optimisée finale est décrit ici dans le tracé du réseau neuro-insulaire pour à grande échelle (distances de millimètre) et l’imagerie 3D à haute résolution de plusieurs îlots pancréatiques intacts. La technique consiste pour pancréas humain qui suit immédiatement la fixation ou après que stockage ainsi que les échantillons fixés dans du formol tamponné neutre et incorporé dans la cire de paraffine. Les échantillons ne conviennent pas pour l’imagerie par confocale ou microscopie lightsheet.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives fédérales et de University of Florida Institutional Review Board.

ATTENTION : Paraformaldéhyde et acrylamide sont irritants toxiques. Gérer des réactifs dans une hotte de laboratoire avec l’équipement de protection individuelle approprié (blouse, gants, lunettes de protection).

1. déparaffinage des tissus fixés formaldéhyde (si vous travaillez avec les tissus frais, passez à l’étape 2)

  1. Utiliser une lame de rasoir Neuve ou un scalpel pour couper à travers la paraffine perpendiculairement à la surface du tissu. Couper la paraffine au bord du tissu pour finir il desserrant. Utilisez pince ou une spatule pour doucement desserrer et enlever le tissu à déneiger optiquement. Grattez légèrement excédentaire paraffine du tissu à l’aide d’une spatule (Figure 1 a).
  2. Remplir un récipient en verre avec xylène (environ 30 mL pour un 3 x 3 x 3 mm de section de tissu) et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante (RT).
  3. Remplir un autre récipient en verre avec xylène fraîche avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante.
  4. Déposer 100 % d’éthanol dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante.
  5. Placez l’éthanol à 95 % dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante.
  6. Placez l’éthanol à 70 % dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante.
  7. Rincer le tissu au phosphate 0,01 M solution saline tamponnée (PBS) et place dans du PBS 0,01 M dans un tube conique s’équilibrer pendant 24 h à RT. veiller à ce que le tissu est exempt de paraffine (Figure 1 b, panneau de droite).

2. préparer le fixateur de paraformaldéhyde (PFA) 4 %

  1. Pipeter 10 mL 16 % PFA dans un tube conique de 50 mL, ajouter 4 mL de 0.1 M PBS et 26 mL eau distillée et désionisée (ddH2O). Fermer le couvercle et mélanger brièvement.
  2. Plus gros volumes de 4 % PFA peut être faite en avance et congelés en portions. Aliquotes sont bons pour 1 jour à température ambiante (RT), une semaine à 4 ° C et 1 mois à-20 ° C.

3. pancréas Fixation

  1. Difficulté de l’échantillon de pancréas (≤ 1 x 1 x 2 cm) fraîchement préparés 4 % PFA à 4 ° C pendant 48 h. Si l’échantillon est plus grand que 1 x 1 x 2 cm, utiliser un scalpel ou une lame de rasoir à disséquer en petits morceaux pas plus de 1 cm d’épaisseur. Laver le tissu échantillon dans trois changements de 0,01 M PBS pendant au moins 15 min chaque lavage et stocker dans tube à centrifuger 15 mL au 0.01 % PFA/0,01 M PBS ou 0,5 % sodium azide/0,01 M PBS jusqu'à utilisation.
  2. Après fixation, article le tissu en coupes 1-2 mm d’épaisseur pour un traitement ultérieur. Utilisez un vibratome afin d’aider à la même section.
    Remarque : Le nombre final des sections dépendra de la taille de l’échantillon de départ.

4. incorporer les tissus en Hydrogel

  1. Préparez 200 mL de la solution de monomère de 4 % d’acrylamide/1 % paraformaldéhyde (A4P1) hydrogel comme suit :
    1. Placer un ballon sur la glace dans un seau sur le dessus une plaque magnétique remuer. Assurez-vous que le ballon est assise plate et ajouter un magnétique.
    2. Ajoutez le code suivant dans l’ordre : 147,8 mL froid (4 à 8 ° C) ddH2O, PBS de 0,1 M de 20 mL, solution de 20 mL froide (4 à 8 ° C) 40 % d’acrylamide, 12,2 mL de solution de PFA 16 % et initiateur 250 mg VA-044. Mélanger la solution entière hydrogel avec une barre magnétique remuer pendant au moins 10 min et laisser la solution sur la glace pour l’étape suivante.
  2. Placer un tube conique de 15 mL dans la glace à côté de la fiole contenant la solution de l’hydrogel. Pipeter 14 mL de solution de monomère dans le tube et ajouter un morceau de l’échantillon de tissu fixe épais de 1 à 2 mm. • Bouchon puis le tube.
  3. Incuber l’échantillon en solution de monomère pendant 3 jours à 4 ° C et protéger de la lumière. Aliquote toute solution de monomère restants et les conserver à-20 ° C pour une utilisation future.

5. dégazer la Solution de monomère et polymériser l’Hydrogel

  1. Retirer l’oxygène de la solution de monomère hydrogel utilisant gazeux N28.
    1. Préparez un seau de glace et placer l’échantillon dans la solution de monomère d’hydrogel sur la glace.
    2. Rassembler les 2-3, les aiguilles hypodermiques calibre 18 par exemple, film de paraffine et une minuterie. Raccordez le tuyau au réservoir d’azote pour que l’azote peut circuler. Tout en gardant l’échantillon sur la glace, percer avec précaution le bouchon d’un tube conique contenant l’échantillon sur un côté et appuyez sur une aiguille hypodermique dans jusqu'à ce qu’il est sous la surface de la solution de monomère liquide.
    3. Utiliser une autre aiguille hypodermique pour piquer le côté opposé de la PAC, mais ne lui permettent pas d’être submergés.
      Remarque : La deuxième aiguille ventile le tube.
    4. Raccordez le tuyau du réservoir d’azote à la seringue hypodermique submergée sous l’hydrogel et tourner lentement sur l’azote jusqu'à ce qu’elle bouillonne régulièrement à travers le liquide.
    5. Permettre à l’azote à bouillonner à travers le liquide pendant 10 min.
  2. Une fois que l’oxygène est enlevé, les deux aiguilles de sortir rapidement et le couvercle avec un film de paraffine pour éviter tout nouvel échange de gaz entre le tube et de l’environnement. Placer l’échantillon dégazé dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 h à se polymériser l’hydrogel.

6. tissu Clearing

  1. Préparer 500 mL de solution (4 % SDS à pH 8,5) de compensation. À ~ 300 mL de ddH2O, ajouter 0,1 M 50 mL PBS et 20 g SDS en poudre, en remuant avec une barre d’agitation magnétique. Ajuster la solution à l’aide d’hydroxyde de sodium et acide chlorhydrique pH 8,5. Ajouter ddH2O jusqu'à ce que le dernier volume est de 500 mL.
  2. Après polymérisation, videz l’excès hydrogel et jetez-le dans un conteneur de déchets chimique. Utilisez une serviette en papier pour essuyer loin hydrogel de l’échantillon en douceur et jeter dans un conteneur de déchets chimique.
  3. Laver l’échantillon dans 3-5 circonscriptions de 0,01 M PBS (liquide de lavage jeter dans les déchets chimiques) pendant 15 minutes chaque étape de lavage. Transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL avec 40 mL de tampon de compensation.
  4. Incuber l’échantillon dans le tampon de compensation à 37 ° C et remplacez échantillon fraîchement déboisé tampon tous les deux jours.
    1. Laisser l’échantillon dans le tampon de compensation pendant 2 à 8 semaines selon la taille de l’échantillon (environ 8 semaines pour un 3 x 3 mm x 3 mm échantillon) afin d’assurer une compensation appropriée.
    2. Surveiller la clairière de tissu et arrêter lorsque vous avez terminé. S’assurer que l’échantillon est suffisamment transparent en le tenant à la lumière pour vérifier la bonne compensation (généralement une coloration beige restera dans les régions exocrines).
      NOTE : Un échantillon trop effacée paraîtra usé sur les bords et la texture sera très douce quand ramassé avec une pince. Il est fréquent que l’échantillon effacer de façon inégale. En outre, le tissu ne sera pas entièrement transparent tant que placé dans le montage des médias (insérer, Figure 1).

7. plusieurs Immunofluorescence

  1. Laver les échantillons sur un agitateur à 60 tr/min à RT pendant une journée avec 40 mL 0,01 M PBS changeant à mémoire tampon fraîche souvent (change de tampon de 4-5 au total, 40 mL chaque lavage, changer toutes les heures jusqu'à ce que le lavage final). Laissez le lavage final continuer toute la nuit à température ambiante.
  2. Préparer le Pacte de tampon de coloration. PBS de 0,01 M 500 mL, ajouter l’azoture de sodium 50 mg et de 0,5 mL TritonX-100. Bien mélanger.
  3. Incuber l’échantillon avec l’anticorps primaires.
    1. Ajouter 2 % sérum normal (même espèce que l’anticorps secondaire) à la base Pacte coloration tampon dans un tube à fond plat de 2 mL (volume total d’au moins 1 mL est recommandé par exemple/tube).
    2. Ajoutez l’anticorps primaire au 2 % sérum/Pacte de tampon de coloration. Utilisez environ 5 x la quantité d’anticorps primaire pour la coloration du Pacte que servirait pour immunohistochemistry standard (c'est-à-dire si un anticorps est dilué 1/500 pour immunohistochemistry standard, utilisation au 1/100 pour la coloration du Pacte).
    3. Utilisez une spatule pour retirer le tampon de lavage de l’échantillon et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec une solution d’anticorps primaire.
  4. Incuber pendant 2 à 4 jours à RT sur un agitateur à 60 tr/min. Laver soigneusement les échantillons à ta sur un agitateur à 60 t/mn dans du PBS 0,01 M changer de tampon frais 4 à 5 fois et en laissant le lavage final sur une nuit comme au point 7.1.
  5. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires.
    1. Ajouter 2 % sérum normal (même espèce que l’anticorps secondaire) à la base Pacte coloration tampon dans un tube à fond plat de 2 mL (volume total de 1 mL est recommandé par exemple/tube).
    2. Ajouter des anticorps secondaires à une concentration de 1 : 200 (5 µl dans 1 mL de tampon).
      NOTE : Petit format anticorps sont privilégiées, ainsi que fortement adsorbés à la croisée des anticorps si vous utilisez plus d’un anticorps primaire.
    3. Utilisez une spatule pour retirer l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec une solution d’anticorps secondaire.
  6. Incuber à RT sur un agitateur à 60 tr/min pendant 2 jours et protéger l’échantillon de la lumière.
  7. Se laver soigneusement les échantillons, comme au point 7.1, à ta sur un agitateur à 60 t/mn dans du PBS 0,01 M changer fraîche dans la mémoire tampon de 4 - 5 fois et en laissant la finale laver dessus durant la nuit, protéger de la lumière au cours de lavages.

8. montage des échantillons pour l’imagerie

  1. Préparer le tampon de solution appariés (jantes) de l’indice de réfraction.
    1. Peser avec 11 g du milieu gradient de densité non ionique (p. ex., Histodenz) et transvaser avec soin dans un tube conique de 50 mL.
    2. Ajouter environ 5 mL 0,02 M phosphate tampon (PB)8 à l’aide d’une spatule pour libérer l’air depuis le milieu de gradient de densité non ioniques poudre.
      Remarque : La solution sera très visqueux, bien mélanger.
    3. Porter le volume à 10 mL à l’aide de PB plus, mélanger avec une spatule et grattez le surplus au large de la spatule dans le tube.
    4. Incuber à 37 ° C jusqu'à dissolution les jantes, inverser et mélanger délicatement au besoin.
  2. Transférer les échantillons dans les jantes. Pour ce faire, pipette 1 mL jantes dans un tube à fond plat 2 mL. Utilisez une spatule pour retirer l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec la solution de jantes.
    1. Tapotez doucement le tube pour submerger l’échantillon dans les jantes. Placer les échantillons dans des jantes sur le banc à l’abri de la lumière à ta 2-4 jours avant d’imagerie.
  3. Pour l’image, placez une petite quantité de jantes dans une diapositive de chambre de fond 8 puits lamelle couvre-objet. Seulement ajouter juste assez pour recouvrir la partie inférieure, plus provoquera l’échantillon à flotteur rend plus difficile à l’image sur un champ inversé. Ajouter l’exemple dans le puits et le capuchon de la diapositive pour l’imagerie.

9. imagerie

  1. Microscopie confocale et logiciel d’imagerie
    1. Sélectionnez des lasers appropriés pour l’excitation et les spectres d’émission des fluorophores utilisés pour colorer les échantillons du Pacte. Ajustez les réglages du logiciel acquisition afin que tout chevauchement entre les canaux est éliminé. Utilisez des pistes séparées si nécessaire (lorsque deux fluorophores ont des spectres d’excitation similaire).
    2. Mettre en place l’acquisition d’images
      1. Choisissez la vitesse d’acquisition maximum, 16 bits, 4 ou plusieurs moyennes et résolution 1024 x 1024 ou plus.
      2. Zoomer sur l’objet à être photographié.
        Remarque : Ceci diminuera le temps d’acquisition pour réduire les photos-blanchiment et également diminuer la taille du fichier et le montage en aval.
    3. Installation de la pile-z.
      1. Sélectionnez la découpe optimale pour l’objectif utilisé. Si déconvolution est souhaitée par la suite, utiliser un z-pas plus petit qu’optimale comme 1 µm.
      2. Utilisez la correction z-pile.
        1. Commencer le plus proche de la surface du tissu et augmenter le gain que l’objectif se concentre dans le plan z et ajouter des corrections. Ne modifiez pas les paramètres laser pour la correction !
        2. Acquérir une pile de test avec une moyenne, une résolution de 512 x 512 et vitesse d’acquisition maximale. Vérifier l’image en 3D pour s’assurer qu’il y a une luminosité égale tout au long de la pile pour chaque couleur avant d’acquérir la haute résolution finale z-pile.
  2. Imagerie Lightsheet
    1. S’assurer que les échantillons ont été équilibrées dans jantes d’imagerie pendant au moins 24 h. idéalement, transférer les échantillons pour jantes douce dans la salle d’imagerie et laisser se pour équilibrer dans la chambre pendant au moins une journée.
    2. Monter l’échantillon pour l’imagerie
      1. Sélectionnez le plus petit capillaire (noir) pour monter l’échantillon
      2. Appliquer du mastic ou un plat pour contenir l’échantillon tout en appliquant une colle super à l’extrémité du capillaire. Coller le tissu pour le capillaire touchant aussi peu une surface du tissu que possible.
      3. Insérer l’échantillon pour l’imagerie.
    3. Image à l’aide de 5 X ou 25 objectifs X adaptés pour échantillons optiquement dégagés à l’aide du pivot scan option. En cas d’occultation ou flou, faites tourner l’échantillon et réessayer ou laisser l’échantillon s’équilibrer en jantes.
      Remarque : Une pile de 1 mm en général peut être acquis qu’en moins de cinq minutes, en fonction des paramètres.
    4. Affichez et modifiez les piles de l’image en utilisant le logiciel d’analyse de l’image.

Résultats

Ces méthodes de coloration ont été développés afin de fournir un examen à grande échelle du pancréas humain d’examiner des îlots et des réseaux autonomes et sensitifs associés. Plusieurs procédures ont été testés dont clarté7, iDISCO17, et Pacte8 avec la méthode Pacte trouvée mieux adapté pour pancréas humain et imagerie confocale.

Anticorps primaires étaient initialement testés sur fixe échantillons de pancréas humain avec des échantillons appropriés de contrôle positifs et négatifs (souris cerveau, autres). Les dilutions suggérées et les anticorps primaires sont répertoriées dans la Table des matières, mais chaque laboratoire peut s’attendre à optimiser des dilutions d’anticorps selon la source de nombre et tissu de beaucoup. Variation de lot à lot anticorps primaire peut incidence sur l’intensité de la coloration et la spécificité et implique une validation pour atteindre le même degré d’intensité de la tache comme avec l’ancien réactifs.

Dans le pancréas humain, îlots ont été délimités par l’insuline, glucagon et secretogranin 3 (Figure 2). Les cellules de Schwann ont été délimitées à l’aide de protéine gliale fibrillaire acide (GFAP, Figure 2 et Figure 3 a). Nerfs colorées avec les anticorps contre le marqueur parasympathique intestinal vasoactif (VIP) ont été projetés sur la Lightsheet (Figure 3 b). Nerfs sympathiques peuvent être vu avec une coloration pour la tyrosine hydroxylase (non illustré).

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Figure 1. Compensation optique pancréas humain. (A) une lame de rasoir est utilisée pour couper et desserrer une section de tissu de paraffine (panneaux supérieure) avant de retirer la section tissus et racler loin paraffine excès dans les tissus (panneaux inférieurs). Des échantillons de tissus représentant apparaissent avant (B gauche, C en haut) et après (B droite, milieu C) compensation optique des tissus inclus en paraffine, tel que décrit dans la section protocole. Le tissu vide, fixe n’est pas complètement transparent après avoir effacé (B droite, dessus C) et souvent les tissus gonflement peut être apprécié (C, panneau central). Le tissu défriché devient totalement transparent après équilibrage jantes (C, panneau inférieur). Barreaux de l’échelle : 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2. Réseau neuro-insulaire humain. Échantillons de pancréas humain ont été déboisés comme décrit de nPOD donneurs d’organes ou de tissus de paraffine d’archivage. (A-D) Cellules de Schwann (GFAP +, blanc) et cellules endocrines apparaissent colorées par les (rouge) de l’insuline et le glucagon (vert). (A) Confocal microscopie et maximum projection d’intensité (MIP) montre le traçage des cellules de Schwann (GFAP +) sur les nerfs situés à côté de vaisseaux sanguins à la périphérie de l’îlot et pénétrant dans les îlots. L’encart montre haute résolution obtenue et un contact entre les cellules de Schwann GFAP + et cellules endocrines. (B) une image 3D du panneau (échelle : x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. Un échantillon de paraffine-PACT est montré imagé par microscopie confocale et présenté comme une projection de l’intensité max (C) et en 3D (D), à l’échelle : x, y = 50 µm, z = 25 µm). Barres d’échelle A, C: 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3. visualisation 3D et coutures de. Trois piles de piqué d’image a été acquise de cellules de Schwann teinté à l’aide de GFAP et microscopie confocale et tracé à l’aide d’un plugin de traceur de neurites dans le logiciel d’analyse de l’image. (A) le remplissage 3D de la trace est affiché (barreaux de l’échelle : x = 150 µm, y = 200 µm (0,2 mm), z = 120 µm) (B) un Pacte échantillon était taché avec de l’anticorps VIP et photographié à l’aide d’un microscope de lightsheet. La pile est > 1 mm de profondeur et les fibres nerveuses sont bien visibles en haute résolution. Les fibres enveloppant un conduit (D, au premier plan) et un ganglion (G, fond) peuvent être vu (grands carreaux : x, y, z = 200 µm ; cochez les marques : x, y, z = 40 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La disponibilité de nouvelles méthodes de compensation optique a permis des examens à grande échelle sans précédent du central et du système nerveux périphérique chez des modèles animaux. Les tendances générales d’innervation du pancréas humain sont largement inexplorés en raison de la densité des tissus et des difficultés dans l’acquisition d’échantillons biologiques de haute qualité. Ce protocole propose un tissu optimisé protocole pour les tissus de pancréas humain d’échantillons d’archives fixes ou paraffine de compensation.

Temps de compensation dépend de la taille de l’échantillon, la type de fixateur, la durée, la durée de stockage et peut nécessiter 1 à 8 semaines, donc les considérations suivantes sont essentielles. Il est préférable effacer les tissus peu après la fixation de PFA 4 % si possible parce que le stockage à long terme augmente le temps de compensation. Pour minimiser le temps de compensation, le montant de l’IFP dans le monomère hydrogel a diminué de 4 %, tel qu’utilisé dans l’étape de fixation à 1 % pour le pancréas humain. Pour les autres tissus, en particulier les tissus de souris, le montant de l’IFP nécessaire pour assurer la rigidité suffisante de hydrogel pour préserver les antigènes doit être déterminé empiriquement. Compensation adéquate est également essentielle, étant donné que la pénétration d’anticorps est réduite dans les tissus mal dégagés et surface taches provoquées par l’anticorps secondaires est augmentée. Changer la solution de compensation chaque autre jour (ou même tous les jours) est le meilleur désodoriser la constante de pH et de détergent. À l’inverse, trop négativement de compensation impact sur la morphologie cellulaire et augmente la friabilité du tissu. Étant donné que certains échantillons de pancréas effacer inégalement en raison de pathologies inhérentes comme la région de fibrose de la pancréatite chronique ou d’autres pathologies, il est important de surveiller fréquemment ce processus. Utilisation de coupes épaisses vibratome peut également être utilisé pour faire une épaisseur uniforme mais ne sont pas nécessaire. Suivi du processus de compensation, si les échantillons sont retirés de détergent dès la lumière passe facilement à travers l’échantillon, fait en sorte que l’échantillon est suffisamment dégagé.

Pénétration de l’anticorps et la coloration de surface sont des questions importantes à examiner des échantillons de Pacte. Afin d’assurer la pénétration de bons anticorps, il est essentiel d’incuber les échantillons avec l’anticorps primaires pendant au moins 2 jours. Différents anticorps présentent des taux de diffusion différentes et devraient être optimisés individuellement, mais la plupart des anticorps, 4 jours est une durée suffisante pour une pénétration complète dans un échantillon de3 mm 1. Si la coloration de surface est un problème, surtout pour l’imagerie Lightsheet, l’échantillon peut être réduit de moitié, ou la surface disséqué loin après coloration. Anticorps de petit format lorsque disponible devrait aider avec tissu pénétration8. Anticorps preconjugated ne semblent pas fonctionner ainsi que le même clone non conjuguée et fond supérieur de fixation non spécifique et moins bonne pénétration tissulaire peut être observé si ils fonctionnent pas du tout. Pour meilleure réussite avec des anticorps preconjugated, augmentation sérique et TritonX-100 concentrations dans la coloration de la mémoire tampon et utilisent des incubations plues (> 4 jours). Après coloration, l’incubation de l’échantillon en jantes pendant plusieurs jours est essentielle. Houle de tissus défrichées dans PBS et jantes d’incubation permet de rétrécir à la taille originale. Surtout avec l’imagerie de lightsheet, l’échantillon doit être équilibré entièrement avant l’imagerie.

Lorsque l’imagerie des échantillons sur la microscopie confocale, la correction doit avoir la valeur de chaque fois qu’un nouveau poste est choisi. Différentes profondeurs d’acquisition et variation en intensité tout au long du tissu de coloration nécessite des ajustements pour chaque zone du tissu pour être photographié de manière optimale. De même, les anticorps secondaires utilisés doivent être soigneusement pesées. Déconvolution spectrale est difficile dans les échantillons de Pacte, sorte de fluorophores doivent être choisis de manière appropriée pour un chevauchement d’excitation et d’émission faible assurer un signal lumineux pour le filtrage des émissions sur la microscopie confocale. Pour chaque application, un doit s’équilibrer résolution, vitesse d’imagerie et de réduction du bruit pour que la meilleure qualité d’image peut être acquis sans photo-blanchiment. Résolution supérieure à 1024 x 1024 n’est pas détectable par le œil humain, mais peut être nécessaire pour certaines applications si la quantification de la tache est nécessaire.

Il y a beaucoup de choses à considérer lors du choix d’une technique de compensation optique et lors du choix de compensation optique sur d’autres méthodes plus traditionnelles. Antigènes de faible abondance ne soient pas détectables à l’aide de la méthode Pacte il y a donc des limitations concernant la détection de l’antigène. Certains antigènes comme antigènes immunologiques (CD3, CD4, CD8, etc.) sont détruits par la méthode Pacte et sont indétectables malgré des anticorps de haute qualité disponibles pour les détecter. Une autre limite de cette méthode est la variabilité inhérente entre le pancréas de donateurs qui sont difficiles à discerner qu’après coloration de compensation. Chaque tissu donneur tend à effacer et des taches de la même façon entre les procédures, mais les tissus de différents donateurs ont largement divers moments de la clairière et qualité morphologie tissulaire après compensation. La possibilité d’utiliser des tissus d’archivage peut atténuer cette limitation, si on peut avoir un accès adéquat à un grand nombre d’échantillons de patients pancréas, bien que cela n’a pas été soigneusement étudiée. Le protocole de Pacte rapporté ici s’est avéré peu coûteux et facilement mis en œuvre avec le matériel de laboratoire standard. Défrichée échantillons ont été adaptés pour l’imagerie par microscopie confocale traditionnelle, ainsi que 2 photons et Lightsheet technologies et fourni à haute résolution des images 3D des nerfs et des îlots dans les grandes sections du pancréas humain. Les applications futures de cette procédure comprennent des études sur le développement du pancréas foetal pour compartiments fois exocrines et endocrines et études d’îlot en type 1 et diabète de type 2.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Dr Ann Fu et Joseph Canzano pour l’assistance technique, Dr. Jennifer Treweek de précieux conseils et Dr. Kristin Overton et Dr Karl Deisseroth pour la formation à MCT, par le biais de l’atelier de la clarté de l’Université de Stanford. FRDJ nPOD et les organisations d’approvisionnement orgue a fourni des échantillons de tissus. Ce travail a été financé par la FRDJ (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) et TR001773 1OT2 NIDDK à MCT.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Tampons FisherBP399-1
Tampon de phosphate de sodium dibasique anhydreS375-500PB (RIMS)
Phosphate de sodium monobasique monohydratéSigma71507-250Tampon PB (RIMS)
16 % de paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique Sciences15714-5Fixation par immersion, hydrogel, stockage solution
40 % acrylamideBio-Rad161-0140Hydrogel
2 % bis-acrylamideBio-Rad161-0142Hydrogel
VA-044 initiateurWako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044Hydrogel
Dodécylsulfate de sodium (FDS)FisherBP166-5Tampon de clarification
Azoture de sodiumSigmaS8032Tampon de stockage d’échantillons
Aiguilles de calibre 18 Fisher 14-840-91Solution d’hydrogel de dégazage
N2 réservoirAirGasdiversSolution d’hydrogel de dégazage
Triton X-100Sigma-Aldrich100 mlTampons
Chèvre, sérum normalVectorS-1000Utilisation comme 2 % dans le tampon bloquant
HistodenzSigmaD2158-100GRIMS
Lames de chambre à 8 puitsIbidi80827Imagerie
Microscope confocal à balayage laserZeiss710Imagerie
Microscope LightSheetZeissZ1Imagerie
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Anticorps primaire
CD45Biossbs-4820R-A488Hôte : Rabbit
Dilution : 1:100
Commentaires : N’a pas fonctionné
CD45DAKOM0754Hôte : Mouse
Dilution : 1:200
Commentaires : N’a pas fonctionné
GFAPDAKOZ0334Hôte : Rabbit
Dilution : 1:50
Commentaires :
Glucagontravaillé BD Biosciences565891Hôte : Mouse
Dilution : 1:50
Commentaires : Signalisation cellulaire du
glucagontravaillé 2760SHôte : Rabbit
Dilution : 1:200
Commentaires : N’a pas fonctionné
GlucagonAbcamab10988Hôte : Mouse
Dilution : 1:200
Commentaires : Insuline DAKO
A0564Hôte : Cobaye
Dilution : 1:200
Commentaires : NCAM travaillé
(CD56)DAKOM730429-2Hôte : Mouse
Dilution : 1:50
Commentaires : N’a pas fonctionné
NCAM (CD56)-FITC conjuguéDAKOM730429-2Hôte : Souris
Dilution : 1:50
Commentaires : N’a pas fonctionné
PériphérineEnCorRPCA-PeriHôte : Lapin
Dilution : 1:100
Commentaires : A fonctionné
PGP9.5DAKOZ5116Hôte : Lapin
Dilution : 1:50
Commentaires : N’a pas fonctionné
Sécrétogranine 3SigmaHPA006880Hôte : Rabbit
Dilution : 1:200
Commentaires :
Travaillé Muscle lisse actineSigmaA5228 ; C6198 (Cy5)Hôte : Souris
Dilution : 1:200 ; 1:200
Commentaires : Travaillé ; Conjugué a mieux fonctionné que non conjugué
Substance PBioRad8450-0505Hôte : Rat
Dilution : 1:200
Commentaires :
Tyrosine hydroxylaseMilliporeAB152Hôte : Rabbit
Dilution : 1:200
Commentaires :
Tyrosine hydroxylaseAbcamAb76442Hôte : Chicken
Dilution : 1:100
Commentaires : Travaillé, mais
Peptide intestinal vasoactif (VIP)Immunostar20077Hôte : Rabbit
Dilution : 1:100
Commentaires :
Transporteur vésiculaire d’acétylcholine (VAChT)Systèmes synaptiques139103Hôte : Rabbit
Dilution : 1:50
Commentaires : Anticorps secondaire
<> travaillé
Guinée porc IgGThermoFisher ScientificDiversHôte : Goat
Dilution : 1:200
Commentaires : AlexaFluor conjugues
Souris IgGThermoFisher ScientificDivers Hôte : Goat
Dilution : 1:200
Commentaires : AlexaFluor conjugue
Rabbit IgGThermoFisher ScientificDivers Hôte : Goat
Dilution : 1:200
Commentaires : AlexaFluor conjugués
Rat IgGThermoFisher ScientificDiversHôte : Chèvre, Âne
Dilution : 1:200
Commentaires : Conjugués AlexaFluor
Poulet IgGThermoFisher ScientificDivers Hôte : Chèvre
Dilution : 1:200
Commentaires : Conjugués AlexaFluor
Fisher travaillée travaillée

Références

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