Ce protocole décrit la fabrication de surfaces de verre de qualité optique adsorbé avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue qui peuvent être utilisés pour surveiller la fusion des macrophages de spécimens vivants et permet de microscopie de Super-résolution d’échantillons fixés .
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Article de méthode
Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages
Dans cet article
Résumé
Résumé
Visualisation de la formation de cellules géantes multinucléées (MSG) de spécimens vivants a été difficile due au fait que plus les techniques d’imagerie live nécessitent de propagation de la lumière à travers le verre, mais sur verre fusion des macrophages est un événement rare. Ce protocole présente la fabrication de plusieurs surfaces de verre de qualité optique où adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue transforme verre en une surface coniques. Tout d’abord, la préparation des surfaces de verre propre comme matériau pour la modification de la surface de départ est décrite. En second lieu, une méthode est fournie pour l’adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue pour convertir les non-coniques verre en un substrat coniques. Troisièmement, ce protocole décrit fabrication de surface micropatterns qui favorisent un degré élevé de maîtrise spatio-temporelle de formation MGC. Enfin, la fabrication de vaisselle en verre bas est décrite. Des exemples d’utilisation de ce système de cellules in vitro comme modèle pour étudier la fusion des macrophages et formation MGC sont montrés.
Introduction
La formation de MSG accompagne un certain nombre d’états pathologiques dans le corps humain se distingue par une inflammation chronique1. Malgré l’accord qui les macrophages mononucléés se fusionnent pour former MSG2, étonnamment peu d’études ont montré de fusion dans le contexte de vie des spécimens de3,4. C’est parce que les surfaces de verre propre qui sont requis pour la plupart des techniques d’imagerie ne favorisent pas la fusion des macrophages quand induit par des cytokines inflammatoires5. En effet, si le verre propre est utilisé comme substrat pour la fusion des macrophages, puis faible aux objectifs intermédiaires de grossissement (c.-à-d., X 10-20) et plus de 15 h de continu imagerie doivent souvent d’observer un événement unique fusion.
Sur l’autre main, les surfaces en plastique coniques (p. ex., permanox) ou plastique qualité bactériologique promouvoir fusion2. Toutefois, l’imagerie par le biais de plastique est problématique car le substrat est épais et disperse la lumière. Ce qui complique l’imagerie depuis longtemps des objectifs de distance (LWD) de travail sont nécessaires. Toutefois, les objectifs de GDL ont habituellement basse lumière rassemblant la capacité par rapport à leurs homologues de la lamelle couvre-objet-corrigé. En outre, techniques qui exploitent des changements dans la polarité de la lumière passant à travers l’échantillon comme le contraste interférentiel différentiel sont impossibles, car le plastique est biréfringent. Les obstacles liés à l’utilisation de plastique sont encore soulignées par le fait qu’il est impossible de prédire où formation fusion/MGC macrophage se produira sur la surface. Ensemble, ces restrictions limitent la visualisation de la fusion des macrophages à l’optique de contraste de phase, étendue des durées d’imagerie totales (> 15 heures consécutives) et en basse résolution.
Récemment, nous avons identifié une surface de verre hautement fusogène tout en menant la microscopie seule molécule Super-résolution avec macrophages fixes/MSG4. Cette observation a été surprenant parce que nettoyer le verre surfaces promouvoir fusion au très faible taux de ~ 5 % après 24 h en présence de l’interleukine-4 (IL-4), tel que déterminé par la fusion de l’index4. Nous avons constaté que la capacité à promouvoir la fusion était due à la contamination de l’olΘamide. Adsorption d’olΘamide ou d’autres composés contenant de la même façon les hydrocarbures à chaîne longue fait le verre coniques. La plupart fusogène composé (paraffine) a été MICROIMPRIMEES, et il donnait un haut degré de contrôle spatio-temporelle sur fusion des macrophages et une augmentation de 2 fois le nombre d’événements de fusion observée dans le même laps de temps par rapport à permanox. Ces surfaces de qualité optique a fourni le premier coup de œil sur les caractéristiques morphologiques et cinétique qui régissent la formation des MSG dans les spécimens vivants.
Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication d’une variété de surfaces de verre qui peut être utilisé pour suivre la formation de MSG de spécimens vivants. En outre, nous montrons que ces surfaces soient prêtent à des techniques de champ lointain Super-résolution. Fabrication de surface dépend de l’objectif de l’expérience, et chaque surface est décrite avec des exemples dans le texte de la procédure.
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Protocole
Les procédures qui utilisent des animaux ont été approuvées par les comités d’utilisation à la Mayo Clinic, Campus de recherche Janelia et Arizona State University et animalier.
1. préparer la lamelle couvre-objet nettoyé à l’acide
Remarque : couvercle en verre acheté chez de nombreux fabricants n’est peut-être pas aussi propre comme prévu. Envisager de nettoyage régulièrement des lots de la lamelle couvre-objet avant toute procédure lorsqu’il s’agit de microscopie.
- Acheter raideur élevée lamelle couvre-objet. Prenez soin de choisir l’épaisseur appropriée (0,15 ou 0,17 mm).
Remarque : Le choix de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet dépend de l’objectif de microscope et est inscrite directement sur le barillet de l’objectif. - Incuber le couvercle en verre à l’acide chlorhydrique 12 M dans une hotte chimique bien aéré pendant 1 h avec sonication (42 kHz, 70 W). Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires avec frais 12 M HCl.
- Remplir un bécher distinct d’eau ultrapure et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.
- Incuber le couvercle en verre dans l’acétone pure dans une hotte chimique bien aérée pendant 30 min avec la sonication. Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires.
- Remplir un bol séparé avec de l’eau ultrapure stérile et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.
- Incuber le couvercle en verre 100 % d’alcool éthylique dans une hotte chimique pendant 30 min avec la sonication. Répéter cette étape deux fois.
Remarque : La pureté de l’alcool éthylique est importante. Contaminants sous forme de solides dissous sécheront sur le verre et peuvent favoriser la fusion des macrophages. - Pour le stockage à long terme, placer le couvercle en verre nettoyé à l’acide dans un récipient rempli d’alcool éthylique pur. Vous pouvez également sécher le couvercle en verre avec l’azote gazeux et l’entreposer dans un dessiccateur à vide.
2. préparation des Surfaces coniques-qualité optique
- Dissoudre exempt de DMSO fusion eleve point paraffine dans le toluène ultrapure.
Remarque : Les concentrations de Stock sont faites à 10 mg/mL et sont dilué 1:9 dans le toluène ultrapure de faire un 1 mg/mL solution de travail.
ATTENTION : Toluène doit être manipulé avec soin comme un tératogène. Disposer du toluène conformément au plan institutionnel hygiène chimique. - Appliquer la paraffine solution à un verre de couverture nettoyé à l’acide sec de travail à un volume qui recouvre uniformément la surface du verre. Décanter la solution de l’excès et le couvercle en verre avec l’azote gazeux ou d’air à sec. Pour la préparation en vrac, utilisez une coloration conçue pour accueillir le couvercle en verre.
- Polir le couvercle en verre de 3 coups dans l’axe des x et ensuite en 3 coups dans l’axe des y avec un chiffon non pelucheux (voir Table des matières).
- Juste avant que l’expérience est réalisée, lavez le couvercle en verre avec de l’eau ultrapure stérile et ensuite stériliser pendant 15-30 min avec une lumière ultraviolette dans une hotte de sécurité biologique. Vous pouvez également stériliser le couvercle en verre par irradiation gamma ou de l’oxyde d’éthylène.
3. contenant des hydrocarbures microstructuration composés de confiner la Fusion à prédéterminés régions
- Sécher le couvercle en verre nettoyé à l’acide et immobiliser le verre sur une surface plane.
- Avec une pincette, plongez délicatement une grille de finder de microscopie électronique de transmission or dans une solution de travail de la composé d’hydrocarbures. Choisir un composé d’hydrocarbure qui répond à l’objectif final de l’expérience (voir tableau 1). Mèche de solution excès away en tapotant doucement la grille sur un papier filtre et immédiatement placer la grille au centre de la lamelle couvre-objet. Permettre le toluène à sécher pendant 2 min avant de passer à l’étape suivante.
- Assurez-vous que la grille est collée à la vitre en retournant doucement le verre. Si la grille détache Répétez l’étape 3.2 en utilisant un nouveau couvercle en verre.
Remarque : Si un plasma cleaner n’est pas disponible, omettre étape 3.4. - Plasma nettoyer la lamelle couvre-objet de traitement par plasma sous vide.
Remarque : La grille de recherche agit comme un masque pour protéger la surface sous-jacente adsorbée aux hydrocarbures à chaîne longue du plasma. Les régions qui sont pas protégées par la grille sont rendues non-fusogène par exposition au plasma. La durée de que la lamelle couvre-objet est exposé au plasma doit être déterminée empiriquement. - À l’aide de pinces à pointe fine, retirer délicatement la grille de la surface du verre pour exposer la composition.
4. fabrication de vaisselle en verre bas
- Percer un trou circulaire de 6 à 10 mm dans le fond d’un plastique de 35 mm boîte de Pétri avec une mèche d’étape.
Remarque : Il est essentiel d’utiliser un foret d’étape pour créer des bords lisses. Si les bords sont trop rude, le couvercle en verre adhère pas à plat sur le fond du plat. Surfaces planes imparfaitement compliquent la microscopie. - Soigneusement mélanger et dégazer élastomère de silicone selon les instructions du fabricant (p. ex., polydiméthylsiloxane ; PDMS).
- Appliquez une fine couche d’élastomère immédiate juste au bord de (c'est-à-dire, le fait de circonscrire) le trou.
Remarque : L’élastomère doit apparaître comme une bande continue quoique mince entourant le trou. - Appliquer doucement le couvercle en verre coniques (voir section 2), ou le verre couverture sèche nettoyé à l’acide (voir section 1) afin de couvrir le trou entouré d’élastomère pour le plat. Assurez-vous que le couvercle en verre apparaît à ras du fond du plat et s’étend au-delà du diamètre du trou, afin qu’une partie importante de la vitre est en contact avec le plastique. Guérir l’élastomère par cuisson à 50 ° C pendant 2-3 h.
- Si fusogène verre est préféré, UV stérilisent les cellules plat et de la culture conformément aux protocoles standards. Toutefois, si une composition est préférée, passez à l’étape 3.2 pour la préparation de la composition (le plasma de gaz utilisé lors de microstructuration stérilise le plat et fortement couples PDMS au verre).
5. collecte des Macrophages thioglycolate-induites
- Injecter des souris C57BL/6 8 semaines 0,5 ml d’une solution stérile de thioglycolate de Brewer 4 % comme décrit précédemment3,4,6.
- Soixante-douze heures plus tard, euthanasier l’animal selon animalier agréé et utiliser les lignes directrices et recueillir des macrophages par lavage péritonéal avec la solution saline tamponnée au phosphate glacee additionnée de 5 mM de tétrasodium.
- Centrifuger les macrophages à 300 g pendant 3 mn et remettre en suspension dans 1 mL de DMEM:F12 additionné de 15 mM HEPES, 10 % de SVF et 1 % antibiotiques (milieu de culture).
Remarque : Les cellules sont ensuite comptés avec un hémocytomètre Neubauer. Les macrophages sont dilués à la concentration appropriée et appliqués sur les surfaces. Le nombre de cellules à appliquer sur une surface donnée doit être examiné attentivement par le chercheur aux fins de la question expérimentale. Consulter les normes connues dans la littérature primaire. - Après 30 min Lavez les surfaces avec HBSS additionné de 0,1 % de BSA pour enlever les cellules non adhérentes et réinstaller avec milieu de culture fraîche. Remettez les cultures dans l’incubateur (5 % CO2 dans l’air à 37 ° C).
- 2 h plus tard, aspirer le milieu et remplacer par le milieu de culture enrichi de 10 ng/mL d’IL-4. Les cellules comme décrit ailleurs4de l’image.
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Résultats
Les paramètres physico-chimiques de matériaux ont des effets dramatiques sur l’étendue des macrophages fusion7,8,9,10. En outre, contaminants de surface sont connus pour favoriser des macrophages fusion11. Par conséquent, il est important de commencer par nettoyer lamelle couvre-objet comme témoin négatif pour la fusion des macrophages. N...
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Discussion
La nécessité d’identifier et de développer par la suite les surfaces de verre de qualité optique qui favorisent la fusion des macrophages découlait du fait que, jusqu'à l’étude non publiée récemment directement visualisé la fusion des macrophages dans le cadre de vie des spécimens3, 4. Cela est dû au fait que fusogène surfaces plastiques qui sont couramment utilisés nécessitent objectifs GDL et sont en grande partie limitées à l’optique de contraste de phase. Ce...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Ugarova et chercheurs au centre de métabolisme et de la biologie vasculaire pour une discussion utile de ce travail. Faust de James tient à exprimer sa gratitude pour les instructeurs du cours de l’European Molecular Biology Laboratory Super résolution microscopie en 2015. Nous tenons à remercier Satya Khuon Janelia pour aide à la préparation de l’échantillon pour LLSM. Au cours de l’examen et le tournage des parties de ce document, James Faust était soutenue par une bourse T32 (5T32DK007569-28). Le composant de feuille de lumière de treillis de ce travail a été soutenu par HHMI et Betty et Gordon Moore Foundation. T.U. est financé par les NIH grant HL63199.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nettoyeur de plasma | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Grille de recherche | Microscopie électronique sciences | G400F1-Au | n’importe quelle grille TEM dorée fonctionnera |
| Verre de couverture (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | n’utilise que du verre de couverture à haute résistance |
| Cire de paroftine | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | doit être exempt d’alpha ;-tocophérol s’il est substitué |
| Oléamide | Sigma Aldrich | O2136 | préparer frais |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluène | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acétone | VWR International | BDH1101 | |
| Éthanol Microscopie électronique sciences | 15050 | utiliser faiblement dissous solides éthanol | |
| Acide chlorhydrique | Fischer Scientific | A144C-212 | à utiliser pour laver à l’acide le verre de couverture |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mélanger dans un rapport de 1:10 et durcir à 50 ° ; C pour 4 h |
| 35 mm boîte de Pétri | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont n° 5 pince | Microscopie électronique sciences | 72705 | idéale pour retirer la grille TEM dans la section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM :F12 | Corning | 10-092 | contient 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | utilisation à 0,1 % dans HBSS pour laver les macrophages non adhérents |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquote à 10 &mu ; g/mL et conserver à -20 ° ; C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | utilisation pour des échantillons fixes ou des techniques qui ne nécessitent pas d’agents de contraste |
| souris eGFP-LifeAct | n/a n | /a | utilisation pour l’imagerie par fluorescence vivante |
| Kimwipe | Kimberly Clark ; | 34155 | Utilisation pour polir les surfaces adsorbées d’hydrocarbures |
Références
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Réimpressions et autorisations
