Article de méthode

Quantification de l’endogène auxine et cytokinine durant la Culture entre-nœud d’ipéca

DOI :

10.3791/56902

⸱

15 mars 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des pousses adventives peuvent être induites sur les segments internodales d’ipéca sans traitement phytohormone. Pour évaluer la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré endogène auxine et cytokinine dans des segments internodales par LC-MS/MS.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formation de pousses adventives est une technique importante pour la propagation des cultures d’importance économique et à la régénération de plantes transgéniques. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces. Si des pousses adventives peuvent être induites sont déterminée par l’équilibre entre auxine et cytokinine (CK) niveaux. Beaucoup d’efforts va dans la détermination des concentrations optimales et des combinaisons de phytohormones dans chaque tissu utilisé comme explants et dans chacune des espèces végétales. Dans ipecac, toutefois, des pousses adventives peuvent être induites sur internodales segments dans le milieu de culture sans traitement phytohormone. Cela permet la plasticité inhérente d’ipéca pour la différenciation des cellules doit être évaluée. Pour induire des pousses adventives en ipecac, nous cultivées internodales segments à 24 ° C sous 15 µmol m−2 s−1 de lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h sur un milieu B5 sans phytohormone solidifié avec gomme Gellane 0,2 % pendant 5 semaines. Pour étudier la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré l’acide indole 3-acétique endogène et CKs dans les segments par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide LC-MS/MS. Cette méthode permet l’analyse de l’acide indole 3-acétique endogène et CKs niveaux de manière simple. Il peut être appliqué afin d’étudier la dynamique de l’auxine endogène et CK pendant l’organogenèse chez d’autres espèces végétales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) a proposé le concept de « totipotence », par quelles plantes cellules peuvent diviser, différencier et régénérer des plantes entières même après leur différenciation préalable en types spécifiques de cellules de plantes matures1. En culture de tissus, si la régénération des plantes peut être induite ou non dépend de la combinaison et la concentration des phytohormones exogènes appliquées dans le milieu de croissance. Skoog et Miller ont constaté que des pousses adventives peuvent être induites de tabac cals sur milieu de culture contenant un taux élevé de CKs d’auxines, tandis que des racines adventives pouvaient être induites sur un milieu contenant un faible ratio2. Depuis cette conclusion, culture de tissus a été largement utilisée pour la propagation des cultures d’importance économique et pour la régénération des plantes transgéniques3. Des pousses adventives peuvent être induites de tissus autres que le méristème apical, tels que des feuilles, des racines et des entre-noeuds. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces végétales. Toutefois, les combinaisons et les concentrations optimales diffèrent par espèce et entre les tissus utilisés comme explants. Ainsi, beaucoup d’efforts va en déterminer les concentrations optimales et les combinaisons de phytohormones pour des expériences.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipéca) est une plante médicinale qui contient des alcaloïdes tels qu’émétine et Céphéline, surtout dans les racines4. Extraits de racines sont utilisées comme expectorant, émétique et un amoebicide5. Bien que l’ipéca pousse naturellement dans les forêts tropicales du Brésil, il est réticent à mettre les graines dans la culture, et le taux de germination diminue pendant le stockage de semences au Japon, avec son de climat plus froid6. Au lieu de cela, il est propagé par culture de tissus, dans laquelle adventives tirer formation sur entre-noeuds est la plus efficace méthode de7,,8. Fait intéressant, les pousses adventives peuvent être induites chez cette espèce sans phytohormone traitement8.

Des pousses adventives sont forment sur l’épiderme dans la région apicale des segments internodales sans obtention, mais pas dans la région basale9. Cette différence indique les polarités de tissus dans les segments internodales, qui est probablement en vertu du règlement phytohormonal. Le système de culture d’ipéca permet une occasion unique d’analyser les changements dans les niveaux endogènes phytohormone au cours de la formation de pousses adventives. Ici, nous présentons notre méthode pour l’analyse des niveaux endogènes d’une auxine (acide indole 3-acétique (AIA)) et quatre CKs (isopentényl adénine (iP), isopentényl adénine riboside (iPR), trans-zéatine (tZ) et trans-zéatine riboside (tZR)) dans les segments internodales grâce à l’utilisation de CL-SM/SM.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remarque : Ipéca (c. ipécacuanha) a été utilisée dans cette étude, car elle facilite l’analyse des phytohormones endogènes.

1. croissance Conditions d’induire des pousses adventives d’ipéca

  1. Préparer un milieu B5 sans phytohormone ajusté à pH 5,710et ajoutez la gomme Gellane 0,2 %. Stériliser à l’autoclave.
  2. Verser 25 mL de milieu stérilisé dans une boîte de Petri stérile (90 × 20 mm).
  3. Couper des segments internodales 8 mm de plantules d’ipéca utilisant un scalpel chirurgical avec une lame n ° 22 sur une plaque acrylique stérile et placer sur le support (Figure 1).
  4. Culture sur un milieu B5 sans phytohormone à 24 ° C sous 15 µmol m−2 s−1 de la lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h pendant 5 semaines.
  5. Identifier les régions j’ai (apical) à IV (basal) dans chaque segment (Figure 1B). Compter le nombre de tiges adventives > 0,3 mm de longueur dans chaque région sous un microscope, une fois par semaine.

2. extraction et Purification de Phytohormones

  1. Mettre un boudin de 5 mm zircone dans chacun des quatre tubes échantillon de 2 mL.
  2. Couper les segments en régions I à IV (chaque 2 mm de longueur) à l’aide d’un bistouri sur une plaque acrylique stérile.
  3. Collecter les huit segments de chaque région dans les tubes d’échantillons distincts (10-30 mg de poids frais).
  4. Peser et puis congeler les échantillons dans l’azote liquide.
  5. Écraser les échantillons congelés en utilisant un homogénéisateur axée sur le talon.
  6. Suspendre les échantillons écrasées dans 1 mL d’acétonitrile contenant 500 pg de chaque étalon interne de l’auxine et CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- droits de propriété intellectuelle) à l’aide d’un agitateur Vortex.
  7. Maintenez à 4 ° C pendant 1 h, puis centrifuger à 3 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
  8. Laver le culot dans l’acétonitrile de 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique. Centrifuger à nouveau à 3 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Combiner les surnageants (à partir de mesures 2.7 et 2.8) dans un tube de verre jetable.
  9. Ajouter 600 µL d’eau contenant l’acide acétique 1 % (v/v) pour chaque surnageant combinée et évaporer l’acétonitrile utilisant une pompe à vide.
  10. Equilibrer les cartouches de colonne (HLB) hydrophile-lipophile-équilibré en appliquant 1 mL d’acétonitrile, méthanol et de l’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
  11. Appliquer une solution de l’échantillon par cartouche HLB équilibré.
  12. Laver les cartouches avec 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
  13. Éluer les hormones avec 2 mL d’acétonitrile 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique dans un tube de verre.
  14. Évaporer l’acétonitrile dans l’éluat pour obtenir l’extrait dans l’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique à l’aide d’une pompe à vide.
    Remarque : Ne pas sécher cela complètement.
  15. Equilibrer les cartouches colonne échangeuse de cations en mode mixte, forte (MCX) en appliquant 1 mL d’acétonitrile, 1 mL de méthanol, 0,5 mL HCl 0,1 de M et 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
  16. Appliquer une solution de l’échantillon par cartouche MCX équilibré.
  17. Laver les cartouches avec 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
  18. Éluer IAA avec 2 mL d’acétonitrile 30 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique dans un tube de verre.
  19. Laver les cartouches avec 2 mL d’acétonitrile 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
  20. Laver les cartouches avec 2 mL d’eau et 1 mL d’eau contenant de l’ammoniaque aqueuse de 5 %.
  21. Éluer les CKs avec 2 mL d’acétonitrile 60 % (v/v) contenant de l’ammoniaque aqueuse 5 % dans un tube de verre.
  22. Laisser évaporer le solvant de chaque fraction de l’hormone à l’aide d’une pompe à vide et conserver à −30 ° C jusqu'à l’analyse de LC-MS/MS.

3. LC-MS/MS analyse des IAA et CKs

  1. Dissoudre chaque extrait d’hormone dans un tube contenant 600 µL de méthanol et transvaser la solution dans un flacon de récupération totale de cou de vis. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’une pompe à vide.
  2. Dissoudre la fraction IAA dans 20 µL 30 % (v/v) d’acétonitrile et les fractions CK dans 20 µL eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique à vis récupération totale flacons.
  3. Analyse des échantillons en mode ion positif sur un système de MS triple-quadrupôle équipé d’un système HPLC.
    NOTE : Nous avons mis les conditions CLHP comme indiqué au tableau 1.
    1. Pour l’élution de l’IAA, utiliser un gradient binaire de 5 à 50 % de solvant B plus de 7 minutes, puis augmenter de 98 % de solvant B pendant 1 min et ensuite équilibrer pendant 2 min à 5 % de solvant B par injection de nid.
    2. Pour l’élution de la CK, utiliser un gradient binaire de 2 % - 40 % solvant B pendant 5 min, 40-70 % de solvant B à 7 min, puis augmenter de 95 % de solvant B maintenez pendant 1 min et ensuite équilibrer pendant 2 min à 2 % de solvant B par injection de nidification.
    3. Définir l’ionisation par électrospray (ESI)-MS des paramètres de la source d’ions énumérés au tableau 2.
  4. Utiliser la réaction multiples surveillance passage (MRM) pour la quantification de chaque analyte énuméré au tableau 3.
  5. Quantifier les taux endogènes de IAA et CK contre une courbe d’étalonnage du ratio de sans étiquette aux normes marqués au deutérium.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À la 1st semaine, aucun des pousses adventives n’avaient formé. À la 2ème semaine, petites pousses sont apparus. À la 3rd et 4ème semaines, le nombre de pousses accru pour la plupart dans les régions apicales (I et II) (Figure 2A). À la 5e semaine, le nombre de pousses était approximativement 7 en région I et 5 dans la région II (Figure 2B). ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour identifier la distribution des phytohormones impliqués dans l’organogenèse, c’est important d’utiliser des matières végétales dans lesquelles organogenèse peut être observé sur un milieu sans phytohormone, parce que quand les phytohormones sont appliqués exogène d’explants pour induire tiges ou racines, ils affectent l’explant entier, rendant difficile d’évaluer la plasticité inhérente des plantes dans la différenciation cellulaire et l’organogénèse. Des pousses adventives peuvent être induites sur milieux de cultur...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants à M. Akira Murakami, du département de Biosciences appliquées, Université de Toyo et M. Koudai Taniguchi de l’Agricultural Technology Center de Gunma pour leur assistance technique. Nous sommes également reconnaissants au professeur Shosaku Kashiwada et Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Université Toyo pour leurs suggestions. Cette étude a été financée en partie par le centre de recherche pour la vie et Sciences de l’environnement, l’Université Toyo.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
[2H5]acide indole-3-acétiqueOlchemlm Ltd031 1531Étalon interne pour LC-MS/MS[
2H5]trans-zéatineOlchemlm Ltd030 0301Étalon interne pour LC-MS/MS
[2H5]riboside trans-zéatineOlchemlm Ltd030 0311Étalon interne pour LC-MS/MS[
2H6]N6-isopentenyl adénineOlchemlm Ltd030 0161Étalon interne pour LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adénosineOlchemlm Ltd030 0171Étalon interne pour LC-MS/MS
indole-3-acétique ÉtalonWako098 00181Étalon pour LC-MS/MS
trans-zéatineSIGMA-ALDRICHZ0876 Étalon 5MGpour LC-MS/MS
trans-zéatine ribosideWako262 01081Étalon pour LC-MS/MS
N6-isopentenyle adénineSIGMA-ALDRICHD7674 Étalon 1Gpour LC-MS/MS
N6-isopentenyl adénosineACROS ORGANICS22648 1000étalon pour LC-MS/MS
acétonitrile hypergrade pour LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000solvant pour LC-MS/MS
Eau pour chromatographie LiChrosolvMERCK1.15333.1000solvant pour LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccWatersWAT094225cartouche colonne
Oasis MCX 30 mg/1 ccWaters186000252cartouche colonne
à vis colWaters186002805
bleu, 12 x 32mm bouchon à vis et septum en PTFE/siliconeWaters
Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 100 mmWaters186002350Colonne UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2,1 x 50 mmAgilent699775-902Colonne UPLC
Microscope numériqueLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Lame chirurgicaleFeatherNo. 22
Manche de scalpelFeatherNo. 4
Savant SpeedVac/Piège à vapeur réfrigéréThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104concentrateur sous vide
Tobe en verre jetable (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Boîte de Pétri stérileINA OPTICAI-90-20
vis flacon de récupération totale 186000274

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Analyse des cytokininesm thode LC MS MSformation de pousses adventivesculture d entre n uds d ip cadynamique des phytohormonesculture de tissus v g tauxquantification hormonalemilieu base de gomme gellaneconcentrateur sous vide

Articles connexes