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Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

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DOI :

10.3791/56913

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3 avril 2018

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Résumé

Haut débit pangénomique Arni (interférence ARN) dépistage technologie a été largement utilisée pour découvrir les facteurs de l’hôte qui ont une incidence de réplication du virus. Nous présentons ici l’application de cette technologie à découvrir sur hôte cibles qui modulent spécifiquement la réplication du virus de Maraba, un rhabdovirus oncolytiques et virus de la Vaccine dans le but d’améliorer la thérapie. Alors que le protocole a été testé pour une utilisation avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, cette approche est applicable à d’autres virus oncolytiques et peut également être utilisée pour identifier des cibles d’hôte qui modulent la réplication virale dans les cellules de mammifère en général. Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de criblage à haut débit Arni dans les cellules de mammifères, les considérations clés et des étapes de préparation importantes pour la réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire et un guide étape par étape pour réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire ; en outre, il décrit globalement les méthodes pour effectuer la validation de l’écran secondaire et les études de validation tertiaire. L’avantage de l’ARNi haut-débit, présélection, c’est qu’il permet de répertorier, de manière approfondie et impartiale, facteurs de l’hôte qui modulent n’importe quel aspect de la réplication du virus pour lesquels on peut se développer un test in vitro , tels que l’infectiosité, éclatement de taille, et la cytotoxicité. Il a le pouvoir de découvrir imprévues biothérapeutiques cibles basées sur les connaissances actuelles.

Introduction

Criblage à haut débit pangénomique Arni s’est avéré pour être un outil précieux pour révéler des connaissances biologiques dans divers domaines d’études dont la biologie du virus. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont entrepris sur les cellules à grande échelle Arni dépistage pour identifier les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus (révision1,2,3,4 largement , 5 , 6 , 7). il est intéressant, un grand nombre de ces écrans ont été mené dans les cellules cancéreuses et plusieurs avec les virus qui sont des candidats de virus oncolytiques actuels y compris vaccinia virus8,9,10 , Myxome virus11, herpès simplex virus12, virus de la stomatite vésiculeuse13,14et Maraba virus15. Alors que la majorité de ces études portait sur l’identification des facteurs de l’hôte qui influent sur certains aspects de la réplication du virus et ne pas sur l’identification des produits biothérapeutiques cibles pour améliorer virales oncolytiques, données précieuses pourraient être exploitées de ces ensembles de données dans cet égard. Il est clair que le puissant potentiel d’identifier des objectifs d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques n’a pas été pleinement exploité.

Une multitude de plates-formes de virus oncolytiques sont actuellement à l’essai dans les études précliniques et cliniques, y compris les virus herpes simplex virus, réovirus et vaccine, qui ont eu des succès tangibles dans les essais cliniques de stade avancé. Pour la majorité de ces plates-formes, des efforts ont été dirigées vers modifier les génomes de virus afin d’améliorer la thérapie. Par exemple, pour augmenter la spécificité de la tumeur, les gènes des virus spécifiques ont été supprimés ou mutés pour restreindre considérablement la réplication virale dans les cellules normales, mais pas dans les cellules tumorales. Dans certains cas, les transgènes ont été ajoutés comme GM-CSF (granulocyte and macrophage colony-stimulating factor) pour potentialiser la réponse immunitaire ou NIS (symporteur de l’iodure de sodium) pour permettre à l’imagerie in vivo et l’absorption cellulaire radioiodure pour thérapeutique fins. Cependant, il y a eu très peu de travail axé sur la manipulation des gènes de l’hôte/tumeur et explorer l’impact des gènes de l’hôte/tumeur sur la réplication du virus oncolytiques. Avec l’avènement de la technologie de criblage à haut débit, il est maintenant possible de sonder les interactions hôte-virus à l’échelle du génome et de déchiffrer les possibilités de manipuler le génome de l’hôte pour améliorer virales oncolytiques (revu en16, 17,,18).

Nous avons signalé la première étude mettant en évidence de validation pour l’utilisation de haut-débit génétique de dépistage pour identifier les cibles d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Pour découvrir les gènes hôtes qui modulent Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolytiques actuellement testée en phase I et II des essais, nous avons mené écrans Arni Génome-large à travers trois lignées de cellules tumorales différentes en double avec un siARN (abrégé interférant RNA) bibliothèque de ciblage de gènes 18 12015. Analyse de la voie de succès identifiés dans les écrans a révélé enrichissement des membres des voies de réponse de stress ER (réticulum endoplasmique). Nous avons sélectionné 10 hits dans ces voies pour validation secondaire à l’aide de siARN avec des séquences de ciblage différentes de celles de l’écran principal. Dans le cadre de la validation tertiaire, nous avons réalisé une expérience de sauvetage avec IRE1α (nécessitant de l’inositol alpha enzyme 1) pour confirmer que le coup était sur la cible. In vitro et in vivo , essais à l’aide d’un inhibiteur de la petite molécule de IRE1α a entraîné oncolytiques considérablement amélioré l’efficacité.

Workenhe et al. 12 a également mené un écran de RNAi de Génome-large à l’aide d’une mise en commun shARN des gènes (abrégé hairpin RNA) Bibliothèque ciblant des gènes 16 056 afin d’identifier les facteurs de l’hôte limitant le virus de l’herpès humain de type 1 (HSV-1) mutant KM100-mediated oncolysis du sein cellules cancéreuses. Dans l’écran principal, ils ont identifié des 343 gènes la précipitation de qui conduisent à la cytotoxicité accrue de cellules infectées par le KM100 au-dessus des cellules infectées par un simulacre ; ils ont sélectionné 24 de ces gènes pour la validation secondaire. Sur les 24 gènes, 8 gènes ont été confirmés dans l’écran secondaire avec l’un d'entre eux étant SRSF2 (riche en sérine/arginine épissage facteur 2) qui a ensuite été confirmée à l’aide d’une expérience de sauvetage génétique lors de la validation tertiaire. Le groupe a ensuite pour identifier un ADN topoisomerase inhibiteur chimiothérapeutique réduit la phosphorylation de SRSF2 et a montré que le traitement de combinaison de HSV-1 KM100 avec cet inhibiteur d’avance à une survie prolongée des souris de tumeur-roulement TUBO.

Dans les études susmentionnées, un flux de travail similaire a été suivie. Chacun a commencé avec un écran de RNAi pangénomique primaire suivi d’un écran secondaire sur un certain nombre de possibilités identifiées dans l’écran principal. Ceci a été suivi par des études tertiaires validation incluse confirmant que le coup était sur la cible en effectuant génétique sauver des expériences in vitro avec ultime validation effectuée en manipulant la cible de produit génique in vivo. Dans cet article, nous fournissons tout d’abord un protocole général pour le développement et la validation d’un test de siARN-criblage haut débit, qui consiste à déterminer les conditions optimales de transfection, quantité de virus et la durée de l’infection. Nous offrons également un protocole détaillé pour effectuer un primaire un écran siARN haut débit ainsi qu’une description générale de la méthode pour effectuer la validation de l’écran secondaire et tertiaire validation.

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Protocole

1. développement et validation d’un siARN haut-débit, test de dépistage

Remarque : Pour toutes les expériences, utiliser des milieux de culture tampon Hepes appropriés pour chaque lignée cellulaire. Voir la Figure 1 pour une vue d’ensemble du flux de travail de l’optimisation de l’analyse de validation tertiaire.

  1. Détermination des conditions optimales de transfection
    1. Sélectionnez une lignée de cellules tumorales ou idéalement des cellules tumorales multiples lignes permettant d’optimiser les conditions de la transfection (p. ex. 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8 U20S ; voir Discussion pour en savoir plus sur la sélection des lignées cellulaires).
    2. Sélectionnez un réactif de transfection ou plusieurs pour tester. Il peut être nécessaire de tester plusieurs réactifs de transfection, car certains peuvent être plus toxiques et plus efficients que d’autres dans une lignée cellulaire donné. Aussi, gardez à l’esprit que certaines peuvent avoir une incidence sur l’infection par le virus, ou peuvent générer le signal de fond élevé sur l’imagerie.
    3. Décider sur positif [e. g. siARN ciblant l’ARNm PLK-1(Polo Like Kinase 1), qui provoque la mort cellulaire] et négatif des contrôles transfection (p. ex. ne pointeraient siRNA).
    4. Suivre le protocole de transfection inverse pour le réactif de transfection particulière, mais varier la quantité de réactif de transfection (p. ex. 0,05, 0,1, 0,15 à 0,2 μL/puits) et cellulaire (p. ex. 625, 1250, 2500 cellules/puits) la densité de semis. Inclure les répétitions des conditions suivantes : sans traitement de cellules, simulé transfecté des cellules (c.-à-d. cellules plus réactif de transfection) et les cellules transfectées avec le siARN contrôle positifs et négatifs de la transfection (voir Figure 2 a pour une plaque d’échantillon mise en page).
      1. En général, préparer des 80 nM dilutions de chaque siARN pour une concentration finale dans le puits de 10 nM (selon la bibliothèque, une concentration plus élevée de siARN peut être nécessaire). Sauf indication contraire, diluer le siARN avec le diluant réactif de transfection. Préparer des dilutions du réactif de transfection.
      2. Pipette 5 μL de siRNA / puits suivie de 5 μl de réactif de transfection dilué. Pour faciliter cette étape, distribuer le long d’une colonne d’une plaque de fond U 96 puits, les mélanges de siRNA et le diluant de siARN seul (pour les cellules transfectées non traitées et simulation). Distribuer le long d’une seconde colonne, le réactif de transfection dilué et le diluant réactif de transfection seul (pour les cellules non traitées).
        1. En utilisant une pipette électronique, la pipette 5 μL/puits du contenu de la première colonne contenant des siARN ou siRNA diluant dans les puits correspondantes de la plaque 384 puits suivie de 5 μL/puits du réactif de transfection dilué ou réactif de transfection de diluant de la deuxième colonne.
      3. Centrifuger les plaques à 1026 x g pendant 1 min à température ambiante et incuber pendant le délai prescrit pour le réactif de transfection (par exemple 5-20 min).
      4. Alors que les plaques sont en incubation, préparer des suspensions cellulaires de densités différentes. Pipette 30 μL de la suspension de cellules par puits. Avant de placer les plaques dans l’incubateur, laisser les plaques pendant 45-60 min à température ambiante pour permettre le tassement uniforme de cellules19.
        Remarque : Si la période d’incubation, prescrite pour le réactif de transfection de siARN est courte, préparer les suspensions cellulaires avant l’incubation.
      5. Incuber pendant 48 à 72 h selon la longueur désirée de précipitation choisie pour l’écran.
    5. Préparer une fixation et coloration solution consistant en formaldéhyde, Hoechst 33342 et PBS (tampon phosphate salin) pour une concentration finale dans chaque puits de 4 % de formaldéhyde et de 5 µg/mL de Hoechst 33342. Au besoin, essayez un plus élevé (par exemple 7,5 ug/mL) ou la plus faible concentration (par exemple 2 ug/mL) de Hoechst si le signal est trop faible ou trop forte, respectivement.
    6. Ajouter 30 μL de la solution de fixation et coloration directement dans tous les puits. Incuber les boîtes pendant 30 min à 37 ° C. Stocker les plaques à 4 ° C. Si vous utilisez un microscope confocal-non, laver les plaques avec du PBS à l’aide d’un laveur de plaques ; dans la plupart des cas, le lavage est inutile lorsque vous utilisez un microscope confocal.
    7. Développer un script afin de quantifier le nombre de cellules par puits.
      Remarque : Il y a plusieurs suites logicielles disponibles à cet effet et, bien que chacun peut avoir différentes façons de générer des scripts, ils ont généralement tous un moyen d’identifier les noyaux, les cellules et les régions d’intérêt ainsi que calcul des intensités et propriétés morphologiques. Lorsque vous développez un script de dépistage, il est important de tenir compte du temps requis pour exécuter le script par plaque et peut-être inclure des mesures seulement essentiels pour minimiser le temps de traitement. Par exemple, afin de quantifier le nombre de cellules, on peut calculer la superficie de Hoechst par nettement supérieur à une intensité spécifiée ; et afin de quantifier la propagation du virus, on peut calculer l’aire de (protéine fluorescente verte) de GFP par nettement supérieur à une intensité spécifiée. Le script « remplie vers le bas » devra être comparée au script plus élaboré pour assurer qu'aucune information essentielle n’est perdue.
    8. Analyser les résultats afin de déterminer les conditions optimales de transfection, c'est-à-dire la quantité de réactif de transfection et la cellule ensemencement densité qui entraîne la mort cellulaire significative (0-30 % la survie des cellules) et est très peu toxique pour les cellules(ex : 90-100 % survie des cellules). Remarque : Il peut prendre plus de temps à observer le phénotype de mort cellulaire dans les lignées cellulaires avec des temps de doublement depuis longtemps. Voir la Figure 2 b et 2C pour résultats représentatifs. En outre, s’assurer que les cellules transfectées avec le siARN ne pointeraient sont environ 90-100 % anastomosé au moment de la fixation, comme plus tard on voudra d’infecter des cellules qui sont de cette confluence.
  2. Détermination de la quantité optimale de virus et de la durée de l’infection
    1. Effectuez les mêmes étapes de la transfection inverse comme décrit plus haut (voir 1.1.4.1 à 1.1.4.4) ; Toutefois, utiliser seulement les conditions optimales de transfection (voir 1.1.8) (p. ex. pour les cellules de 786-O : 1500 cellules/puits et 0,05 μL/puits de RNAiMAX) et, en outre, comprendre un puits supplémentaire d’être infectées par le virus [p. ex. puits avec des cellules non traitées, maquette les cellules transfectées, cellules transfectées avec ne pointeraient siARN et les cellules transfectées avec les contrôles positifs de virus si ceux sont connus (c'est-à-dire les siARN Ciblant des gènes hôtes qui inhibent ou améliorer la réplication)].
      1. Voir Figure 3 a un aménagement de plaque d’échantillon. Incuber pendant 48 à 72 heures.
    2. Contaminer les puits d’une souche du virus avec un virus ONCOLYTIQUE exprimant une protéine fluorescente journaliste (p. ex. GFP) avec une gamme des multiplicités d’infection (MOIs) (p. ex. 0,001 à 10 ; La gamme choisie être dépendra du niveau de la résistance ou la sensibilité d’une lignée cellulaire.). Inclure des puits non infectés ainsi. Pipette 40 μl de chaque dilution de virus / puits pour un volume final de 80 μL. Centrifuger chaque plaque à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
    3. Suivant l’infection, image, les cellules vivent avec une forte teneur, automatisé microscope à intervalles réguliers (par exemple toutes les 4-8 h). Voir la Figure 3 b et 3C.
    4. Développer un script afin de quantifier la propagation de virus (p. ex. , surface de GFP / puits) (voir 1.1.7). Analyser les images, puis sélectionnez un point de temps et un MOI qui permettent la détection des augmentations et diminutions de propagation. S’assurer que le point dans le temps et à l’automne MOI dans une plage linéaire pour faciliter la détection de petits changements dans la propagation. Estimer le facteur Z (ou Z') pour le moment-point donné et MOI.
      NOTE : Estimées facteur Z = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, où σp est l’écart échantillon des contrôles positifs de virus et σn est l’écart échantillon négatif du virus de la contrôles ; et μp correspond à la moyenne de l’échantillon des contrôles positifs de virus et μn la moyenne d’échantillonnage de la valeur du contrôle négatif. Un facteur Z estimé de 0,5 - 1,0 est considéré comme un excellent test et adapté pour le dépistage de20,21.
    5. Confirmer que le siARN contrôle de virus négatif a aucun effet sur la réplication virale en le comparant aux fausses puits transfectées et non traitées. Il est souvent nécessaire de tester plusieurs contrôles négatifs comme certains négatif siARN contrôles peuvent avoir un impact sur la réplication virale.
  3. Validation finale de l’essai de criblage à haut débit
    1. Répétez les étapes 1.2.1 et 1.2.2 ci-dessus, mais seulement ce cellules infect temps avec le ministère de l’intérieur optimale. Au lieu de l’imagerie live, difficulté et tacher la plaque (comme décrit dans 1.1.5 et 1.1.6) à l’optimal (voir 1.2.4)-point dans le temps.
    2. Image de la plaque. Analyser les résultats en utilisant le même script qui sera utilisé pour l’écran (voir 1.1.7 et 1.2.4). Confirmer les conditions de transfection (c'est-à-dire bonne précipitation dans le puits transfectée avec le contrôle positif de transfection et toxicité minimale dans les puits transfectées avec contrôle de transfection négatif). Estimer le facteur Z afin de déterminer la solidité du dosage (voir 1.2.4).
  4. Des essais supplémentaires et considérations pour la conduite de criblage à haut débit
    1. Essai de la durabilité des plaques microtitration quelques plaques peuvent se fissurer lors de la centrifugation, surtout quand les couvercles sont tenus et plusieurs plaques sont centrifugés à la fois. Pour réduire la fissuration, centrifuger sans les couvercles (à condition les plaques sont joints), ou diminuer le nombre de plaques centrifugé par seau.
    2. Tester la stabilité du mélange réactif transfection au fil du temps. Une fois que le réactif de transfection est ajouté aux plaques, il peut y avoir un retard important avant l’ajout de cellules ; par conséquent, il est important de connaître la période pour laquelle le mélange réactif de transfection resteront efficace. Pour l’écran, il peut être nécessaire de préparer les cellules avant d’ajouter le mélange réactif de transfection pour les plaques.
    3. Préparer à l’utilisation du distributeur de liquid. Déterminer les volumes requis pour distribuer le réactif de transfection, les cellules, les virus et le fixer en tenant compte du volume que les cales de tube, le volume perdu à distribution préalable (si l’unité dispose de cette fonctionnalité) et le volume résiduel nécessaire dans les bouteilles utilisées pour une distribution.
      1. Définir et tester les programmes qui seront utilisés pour la distribution des virus, des cellules et réactif de transfection. Pour minimiser la perte de réactif de transfection, limite, si possible, le nombre de pré dispense. Établir un protocole d’étalonnage le distributeur de liquide et de tester son exactitude et précision.
    4. Se préparer à la distribution en vrac de réactif de transfection, les cellules et les virus
      1. Tout d’abord déterminer le nombre d’assiettes à traiter en un seul lot, compte tenu du nombre de plaques de cellules qui peuvent facilement être trypsinisées en même temps, le nombre de plaques de microtitration qui peut être centrifugé à la fois, la longueur du temps nécessaire pour traiter un lot de plaques avec le distributeur de liquide et également le temps requis pour l’imagerie. Remarque : Généralement, environ 30 plaques de traitement à la fois est tout à fait faisable et traitement 3 lots de plaques est gérable en une seule journée.
      2. Empiriquement, vérifier le volume de réactif de transfection requis pour traiter un lot de plaques. Test que ce volume est adéquat par dosage 5 μl d’eau distillée plusieurs fois à travers une plaque un nombre équivalent de temps qui sera nécessaire pour traiter un lot.
      3. Afin d’assurer la distribution uniforme des cellules, estimer le temps nécessaire pour distribuer les cellules dans un lot de plaques. Préparer une bouteille contenant le volume de cellules nécessaires pour un lot et distribuer les cellules dans plusieurs colonnes d’une plaque à la fois, à intervalles réguliers pendant la même période, il faudra pour passer à travers un lot de plaques. Tester combien de fois, il sera nécessaire de mélanger les cellules afin de maintenir une répartition uniforme des cellules.
      4. Afin d’assurer la distribution uniforme de virus, répétez la même procédure que ci-dessus (voir 1.4.4.3), mais cette fois-ci, distribution des virus sur les puits confluentes. Si le virus n’est pas également réparti, envisager de préparer le virus dans des tubes coniques et mélangé au vortex chaque tube avant le dosage.
    5. Suivre la croissance des cellules afin de déterminer la chronologie pour cultiver suffisamment de cellules pour l’écran. En outre, déterminer le nombre moyen de cellules qui peuvent être récoltées par plaque de cellules qui croissent en phase logarithmique afin d’être en mesure d’estimer le nombre requis pour l’écran.
  5. Étapes de la préparation finale pour le criblage à haut débit
    1. Place à un mois avant de commencer le dépistage, déterminer tous les matériaux nécessaires à l’écran. Commander des réactifs nécessaires (voir documentation). S’assurer que la quantité de virus nécessaire est sur place (de préférence, utiliser la même souche qui a été utilisée lors de l’optimisation.).
    2. Jusqu'à deux semaines avant de commencer le dépistage, décongeler et grandissent les cellules nécessaires à l’écran. Assurer la disponibilité de la centrifugeuse et seaux carrés centrifugeuse.
    3. Au cours de la semaine avant de commencer le dépistage, préparer les bouteilles de médias pour la transfection inverse et l’infection, un stock de l’éthanol à 70 %, diluant réactif de transfection 2 X (par exemple 2 X Opti-MEM), si nécessaire (par exemple si la bibliothèque de siARN est diluée dans RNase-free d’eau, un voudront utiliser 2 X pour transfecter de cellules) et des parties aliquotes de virus (un par lot de plaques). Vérifiez l’état des cellules.
      1. Préparer une solution de Hoechst 33342 tache (p. ex. 5 mg/mL). Préparer une plaque de compensation si une sera requise pour la centrifugation.
      2. S’assurer que la rondelle de plaque est en bon état de fonctionnement si elle sera utilisée. S’assurer que le distributeur de liquide est correctement calibré et distribution avec exactitude et précision. En outre, s’assurer que les programmes sont définis correctement sur la distributeur de liquide.

2. mener l’écran primaire à haut débit

Remarque : Avant de commencer l’écran Arni, microplaques (telle qu’une plaque 384 puits) doivent être rangés avec les contrôles de dépistage et de bibliothèque de siARN. Les étapes suivantes sont mieux menées par deux personnes avec une seule personne (ex. personne A) étant principalement responsable de la distribution le réactif de transfection et cellules sur les plaques et la deuxième personne (c.-à-d. la personne B) étant responsable de centrifugation les plaques immédiatement avant la transfection et pour préparer les cellules. Sont inclus entre parenthèses quelques détails pour le traitement d’un lot de 33 plaques (c'est-à-dire la moitié de la bibliothèque) avec la lignée cellulaire de 786-O.

  1. Préparation pour la transfection inverse
    1. Personne A: mettre suffisamment de médias, la trypsine et PBS nécessaire pour traiter un lot d’assiettes dans un bain-marie à 37 ° C. En option : Trypsinize une plaque de cellules et compter le nombre de cellules par plaque afin de fournir une estimation en temps réel du nombre de plaques nécessaires par lot.
    2. Obtenir un lot de plaquespar exemple 33 du congélateur et attendre 20-30 min pour permettre les plaques décongeler. Alors que les plaques sont décongélation, passez aux étapes suivantes.
      1. Personne A: pipette dans conique de 50 mL tubes la quantité de diluant réactif de transfection nécessaire au traitement d’un lot de plaques (par exemple 2 x 37.125 mL) et les placer dans un bain-marie à 37 ° C. Remplir deux bouteilles d’éthanol à 70 % (par exemple les bouteilles de 250 à 500 mL). Remplir deux tubes conique de 50 mL de PBS et l’autre avec de l’eau distillée.
      2. Personne a : immerger le distributeur de liquide tube dans un flacon d’éthanol à 70 %. Si tous les conseils ne doit pas être utilisé pour distribuer le réactif de transfection (p. ex. si les puits externes de la plaque ne sont pas utilisés), détacher le tuyau inutile tout d’abord. Placez un morceau de ruban adhésif autour de la tuyauterie pour marquer le point en dessous duquel le tube peut être considéré comme stérile. Prime d’environ 25 mL. Versez additionnel éthanol dans la bouteille pour remplacer le volume perdu. Laisser le tube s’asseoir dans l’éthanol pendant au moins 5 min.
      3. Personne b : Préparez-vous à trypsinize des cellules. La culture de tissus (TC) capote avec l’éthanol à 70 %. Spray et placer les pipettes nécessaires, des conseils, des bouteilles et des microtubes pour préparer des cellules dans le capot (voir 2.2.1.1 et 2.2.1.2). Centrifuger les plaques scellées dans des ensembles à 1026 x g pendant 2 min à température ambiante. Retirer les couvercles des plaques sous une hotte à TC, si préalablement déterminées que les plaques pourraient fendre lors de la centrifugation, lorsque les paupières sont maintenues (voir 1.4.1).
    3. Personne A: enlève les joints des plaques. Avant, pendant ou après les joints ont été supprimés (en fonction de la durée d’incubation nécessaire), ajouter la quantité requise de réactif de transfection (p. ex. 375 μL/tube pour une concentration finale de 0,05 μl de RNAiMAX/puits) dans les tubes coniques contenant le diluant réactif de transfection préchauffé (p. ex. 37.125 mL/tube).
    4. La composition de pipetage et descendre de 10 fois. Incuber à température ambiante pendant le délai prescrit pour le réactif de transfection utilisé (par exemple 0-10 min).
  2. Inverser la transfection
    1. Avoir la personne B effectuer les tâches suivantes.
      1. BEGIN trypsinisation des cellules (par exemple 3 plaques de cellules 786-O). Aspirer les médias de chaque plaque. Rincer avec 9 mL de PBS. Pipette de 3 mL de trypsine par plaque. Incuber à 37 ° C pendant environ 5 min. remettre en suspension les cellules avec 22 mL de médias. Pipette de haut en bas 10 fois.
      2. Combiner la suspension cellulaire de chaque plaque de culture de tissus dans un flacon stérile. Mélanger la suspension cellulaire en inversant. Pipette 1 ml de la suspension cellulaire dans deux des microtubes distinct. Retirer un échantillon de chaque tube à centrifuger et compter les cellules non vides. Calculer le volume de la suspension de cellules nécessaire à la densité requise (par exemple 1500 cellules/puits) et de préparer suffisamment suspension cellulaire dilué (par exemple 500 mL) pour distribuer à travers un lot de plaques.
    2. Avoir les personne A à effectuer les tâches suivantes en parallèle à la personne B.
      1. Vider le distributeur de liquide tube d’éthanol. Amorcer la tubulure avec environ 25 mL de PBS et puis vider le tube. Soyez prudent lorsque vous manipulez la tubulure pour s’assurer que la section du tuyau sous le ruban-cache qui seront plongé dans le réactif de transfection et plus tard dans la suspension cellulaire est maintenu stérile. Mis à part les plaques qui peuvent être effectuées sans risque avec un tube à fond conique de la solution de réactif de transfection.
      2. Distribuer les solutions de réactif de transfection haut et en bas 10 fois. Amorcer le tube avec la solution de réactif de transfection. Pour minimiser la perte de réactif de transfection, amorcer avec une solution juste assez pour effacer à peine le bout. Sélectionnez le programme approprié sur la distributeur de liquide et ajouter 5 μl de réactif de transfection par puits.
        ATTENTION : Suivre de près le niveau de réactif de transfection de la sorte qu’il est plein avant il s’épuise. L’achèvement des plaques qui sont réservées devraient fournir un repère pour ajouter la solution de réactif de transfection plus.
      3. Centrifuger les plaques à 1026 x g pendant 1 min à température ambiante. Cette fois les couvercles sera allumé, il est donc nécessaire de centrifuger moins plaques à la fois pour prévenir la fissuration (p. ex. 2 plaques par seau). Incuber les plaques à température ambiante pendant le délai prescrit pour le réactif de transfection utilisé (par exemple 10-20 min).
      4. Pendant l’incubation, vider le tube de la solution de réactif de transfection et placez-le dans un tube conique plein 50 mL contenant du PBS. Rincer la tubulure avec environ 25 mL de PBS de l’amorçage et la vidange.
        1. Si plus des conseils vont être utilisés pour la distribution des cellules qu’ont été utilisés pour la distribution de réactif de transfection, ré-attacher le tuyau inutilisé et re-stériliser toute la tuyauterie avec l’éthanol à 70 %, avant de rincer la tubulure avec du PBS (voir 2.1.2.2).
      5. Mélanger la solution contenant la suspension de cellules une fois qu’il a été établi. Placer le tube dans la suspension cellulaire et amorcer assez pour voir que chaque pointe est distribuer correctement. Diluer 30 μL / puits de la suspension cellulaire à travers toutes les plaques. Si nécessaire, mélanger la suspension cellulaire à intervalles réguliers pour éviter de s’installer.
        ATTENTION : Parfois des gouttelettes de suspension contenant les médias peuvent adhérer aux parois des conseils. Lorsque cela est observée, aspirer dès que possible ou essuyer avec du tissu pelucheux arrosé dans l’éthanol à 70 %.
      6. Vider le tube de la suspension cellulaire. Rincer la tubulure avec environ 25 mL de PBS, suivie par environ 50 mL d’eau distillée.
    3. Laisser les plaques s’asseoir pendant 45-60 min de l’époque de cellule ensemencement à température ambiante avant de retourner les plaques à l’incubateur. Incuber les boîtes dans un incubateur non perturbé pour la longueur désirée du gène silencieux (par exemple 48 h) (voir 1.1.4.5).
  3. Infection
    1. Pour gagner du temps, le jour avant d’infecter les cellules, pipette en stérile bouteilles le montant précis des médias pour infecter chaque lot de plaques, y compris les médias pour les puits non infectées (par exemple 2 x 350 mL et 2 x 50 mL pour 33 plaques). En outre, le distributeur de liquide pour la précision et l’exactitude d’essai et ré-étalonner si nécessaire.
    2. Réchauffer les médias à 37 ° C. Remplir deux bouteilles avec l’éthanol à 70 %, deux tubes de 50 mL conique avec du PBS et l’autre avec de l’eau distillée. Vérifiez que la centrifugeuse est à température ambiante.
    3. Stériliser le tube avec l’éthanol à 70 % et rincer avec du PBS comme décrit précédemment (voir 2.1.2.2 et 2.2.2.1). Si le tube est assis dans l’éthanol, pipette le volume précis de virus requis dans le flacon contenant le support préalablement préparé pour infection (voir 2.3.1). Rincer la tubulure avec PBS d’amorçage avec 25 mL et puis vider.
    4. Enlever les plaques de l’incubateur et placez-les dans la hotte de TC. Amorcer le tube avec les médias. Ajouter 40 μL des médias dans les puits de contrôle non infectés. Vider le tube de médias et rincer avec 25 mL de PBS. (voir 2.2.2.5 prudence)
    5. Après avoir mélangé le virus, placer le tube dans le flacon contenant le virus. Ajouter 40 μl de virus à travers les plaques. Centrifuger les plaques pendant 30 min à 400 x g à la température ambiante. Remettez les plaques dans l’incubateur. Incuber les boîtes pendant la durée préalablement déterminée (par exemple 24h) (voir 1.2.4).
  4. Fixation et coloration des cellules
    1. Pour gagner du temps, la veille de la fixation, préparer une bouteille de fixation et coloration solution contenant du formaldéhyde et PBS (p. ex. 179 mL de 37 % de formaldéhyde et 270 mL de PBS pour une concentration finale de 4 % de formaldéhyde) pour chaque lot d’assiettes, mais omettre le Tache de Hoechst. Ranger dans l’armoire à l’abri de la lumière inflammable.
    2. Rincer la tubulure avec 70 % d’éthanol et PBS comme décrit précédemment (voir 2.1.2.2 et 2.2.2.1). Ajouter le volume requis de Hoechst (e.g. 2,5 mL de 5 mg/mL de Hoechst pour une concentration finale dans le puits de 7,5 µg/mL) à la fixation et coloration solution et mélanger.
    3. Ajouter 30 μL de fixation et coloration de solution dans l’ensemble de toutes les plaques. Placer les plaques dans l’incubateur pendant 30 min. Après l’incubation, appliquer les joints pour les plaques et stocker les plaques à 4° C, abri de la lumière. Laver les plaques si nécessaire (voir 1.1.6).
  5. Imagerie et analyse d’images
    1. Image les plaques avec un microscope automatisé, à haute teneur. Utilisez les paramètres préalablement déterminées, mais d’abord tester les paramètres pour assurer qu'aucun réglage n’il faut faire.
    2. Quantifier la GFP (ou autre rapporteur fluorescent) et Hoechst zone par bien en utilisant le script développé antérieurement (voir 1.3.2). Tester le script avec une poignée de plaques tout d’abord de déterminer si les légères modifications doivent être apportées avant lot analysant toutes les plaques.
    3. Identifier les hits. Remarque : La méthode robuste de Z-score/MAD (écart absolu moyen) est une méthode qui est souvent utilisée à cette fin. En règle générale, les scores de > 2 ou < -2 sont définies comme des seuils. Cette méthode est mieux utilisée lorsque les échantillons de siARN sont distribuées au hasard à travers les plaques et pas, par exemple, regroupés par fonction, comme les échantillons sont utilisés comme témoins négatifs de fait . Filtrer les siRNAS cytotoxiques comme ceux-ci devraient diminuer non spécifiquement les virus propagation (voir pour plus de détails sur le filtrage cytotoxiques hits).

3. validation d’écran secondaire de grands succès avec la bibliothèque de shARN TRC (le RNAi Consortium)

Remarque : Voir la Discussion pour plus de détails sur la sélection des hits pour validation secondaire et, éventuellement, technologies de dépistage. Si la technologie siARN est sélectionnée pour validation secondaire, le même protocole de développement et de validation de test peut être utilisé que celui utilisé pour l’écran principal (voir 1).

  1. Obtenir une bibliothèque personnalisée de shARN TRC ciblant les gènes candidats d’intérêt comme des stocks de glycérol.
  2. Préparer l’ADN de plasmide de qualité de transfection provenant des stocks de glycérol. Note : Un protocole détaillé (c.-à-d. « ShARN/sgRNA/ORF glycérol et préparation d’ADN plasmidique ») peut être trouvé ici : http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produire des lentivirus exprimant shARN ciblant les gènes d’intérêt avec les plasmides d’ADN. Remarque : Un protocole détaillé pour la production de lentivirus en plaques 96 puits [c'est-à-dire « shARN/sgRNA/ORF haut débit Production virale (96 puits) »] peut être trouvé ici : http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infecter les cellules avec les lentivirus. Remarque : Un protocole détaillé pour l’infection des gènes dans des plaques de 96 puits (c.-à-d. « Infection des gènes ») est disponible en ligne à http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infecter les cellules avec les virus oncolytiques soit sélection puromycine suivante (voir point 3.4 du protocole de sélection) de cellules avec succès transduits ou transduction suite immédiatement (sans sélection de puromycine). Pour déterminer la quantité optimale de virus et de la durée d’incubation avec le virus, utilisez la même méthode utilisée pour l’écran principal.

4. tertiaire validation

Remarque : Le tertiaire validation vise à confirmer avant tout que le coup est sur la cible, tumeur spécifique et améliore l’efficacité in vivo. On peut aussi tester si il module la propagation dans un éventail de lignées cellulaires tumorales

  1. Confirmation que défiant du gène candidat est sur la cible
    1. Tout d’abord confirmer qu’il existe une corrélation entre le phénotype et le silençage génique. Utilisez la même épreuve qui a été développée pour l’écran ou le modifier pour un format de 6 puits afin d’évaluer l’amélioration ou l’inhibition de la propagation dans un format plus grand. Mener un temps avec les cellules transfectées avec le siARN ciblant le gène d’intérêt plu et moins de virus.
    2. Les puits contenant des cellules infectées par le virus de l’image et recueillir les lysats cellulaires provenant des puits non infectés à intervalles réguliers. Déterminer s’il existe une corrélation entre le silençage génique et d’amélioration ou de l’inhibition de la prolifération. Évaluer le silençage génique par Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) ou Western Blot.
    3. Réaliser une expérience de sauvetage génétiques pour confirmer que le coup est sur la cible. Remarque : Dans une expérience de sauvetage typique, le gène candidat est démontés avec Arni alors qu’en même temps les cellules sont transfectées transitoirement par ARNi résistant cDNA (p. ex. les orthologues du gène) exprimant le gène candidat afin de déterminer si la phénotype du gène est restauré ou « sauvé ». Des lignées stables surexprimant Arni résistant ADNc du gène candidat d’intérêt peuvent également être employées.
    4. Alternativement, au lieu d’une expérience de sauvetage génétique, utiliser plusieurs dosages orthogonales pour confirmer que le coup est sur la cible [par exemple déterminer si le même phénotype est obtenu sur l’inactivation du gène cible avec des siRNAs multiples, à la précipitation de le gène cible dans plusieurs lignes cellulaires stables exprimant shARN contre le gène cible et à élimination directe avec CRISPR (Clustered régulièrement dois‑je courts palindrome répétition)-technologie Cas9 dans plusieurs lignées cellulaires.].
  2. Confirmation que le coup est spécifique et module répartis sur une gamme de lignées cellulaires tumorales
    1. Procéder à un test semblable comme dans 4.1.1, mais avec des cellules normales ainsi qu’avec d’autres lignées de cellules tumorales.
  3. Confirmation que la manipulation du gène candidat améliore l’efficacité in vivo
    NOTE : Décrites ci-dessous est trois méthodes possibles pour la manipulation du gène ciblent in vivo.
    1. Trouver un médicament pour manipuler la cible de gène. S’il y a un médicament comme un inhibiteur de petites molécules qui ciblent le même gène, l’administrer avec la de virus oncolytiques in vivo. Il est important de déterminer le moment optimal pour administrer le médicament.
    2. Ingénieur, le virus d’inhiber ou surexpriment la cible du gène selon qu’on désire inhiber ou améliorer la cible de gène. Pour inhiber le gène, l’ingénieur le virus oncolytiques pour exprimer un dominant négatif du gène ou de shARN express ciblant le gène. Pour renforcer l’expression de la cible de gène, cloner le virus oncolytiques avec un transgène surexprimant le gène.
    3. Ingénieur des lignées de cellules avec le gène démontésent ou frappé à l’aide shARN ou technologie CRISPR-Cas9, respectivement. La lignée cellulaire machiné et sauvage cell line in vivo de l’implant et ensuite infecter avec le virus oncolytiques. Remarque : Cette méthode sert comme une preuve de principe et peut aider à déterminer s’il serait utile d’investir plus de temps et de ressources pour développer un médicament pour manipuler le gène in vivo, par exemple.

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Résultats

Une vue d’ensemble du flux de travail pour identifier des cibles pour améliorer virales oncolytiques hôte est présenté dans la Figure 1.

Tel qu’illustré à la Figure 1, la première étape essentielle à la réalisation d’un écran de RNAi de haut débit est développement de dosage. Figure 2 a fournit une disposition de plaque d’échantillon pour l...

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Discussion

Nous présentons ici un protocole pour l’emploi de criblage à haut débit Arni pour identifier les cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Ceci a été testé avec succès avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, mais, comme indiqué, il peut être adapté pour être utilisé avec d’autres virus oncolytiques ou autres virus généralement pour identifier les gènes de l’hôte qui modulent la réplication du virus. Le protocole de dépistage vise également à identifier les gènes qui...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut ontarien pour la recherche sur le Cancer, la Fondation canadienne pour l’Innovation, la Fondation Cancer région d’Ottawa et l’Institut de recherche Terry Fox. K.J.A. a été soutenu par une bourse supérieures du Canada Vanier, un Canadian Institute for Health Research-maîtrise Award et une bourse d’études supérieures de l’Ontario.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Consumables
siRNAlibrary GE DharmaconG-005005-02
Corning 384-well plateCorning3985
Falcon 384-wellplate Becton Dickinson353962
WaterSigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars Negative Control siRNAQiagenSI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM/HIGH GlucoseGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
Fetal BovinSerum SigmaF15051-500ML
HEPES solution (1M)SigmaH3535-100ML
Pénicilline-Streptomycine 100X solutionGE Healthcare Life SciencesSV30010
Trypsine-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS/ModifiedGE Healthcare Life SciencesSH30028.02
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
OligofectamineThermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Sel de sodium de résazurineSigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
Formaldéhyde (37 % en poids)Fisher ScientificF79-4
Bouteilles de 500 mlCorning
d’étanchéité adhésif 430282 pour microplaquesExcel Scientific361006007
Feuille de thermoscellage pelableThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo Select Cassette distributriceFisher Scientific11-120-625
NomEntrepriseCatalog NuméroCommentaires
Equipment
MicroFlo Select (distributeur de liquide)Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT lecteur de plaquesBiotekN/A
Opera Imaging andInstrument PerkinElmerHH10000115
Bras robotique KiNEDxAnalyse et automatisation des pics (anciennement Peak Robotics)KX-300-660
Incubateur automatisé série Cytomat 24CThermo Fisher Scientific50080227
JANUS Station de travail automatiséePerkinElmerAJI4M01
Carrouselà plaques Analyse et automatisation des pics (anciennement Peak Robotics)N/A
Alps 3000 scelleusede plaquesThermo Fisher ScientificAB-3000
Film Analysis

Références

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