Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire

18.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/56921

⸱

15 février 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.

Résumé

Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé au cours des 30 dernières années. La pathogenèse de l’entérocolite nécrosante est caractérisée par des lésions intestinales et atteinte muqueuse guérison8,9,10,11, cependant, les voies de signalisation conduisant à un exacerbée la réponse inflammatoire et mécanismes d’inverser l’inflammation restent incomplètement compris.

L’administration de lait maternel s’est avérée pour être la stratégie de protection seulement contre NEC pour les bébés prématurés. Nous avons déjà montré que le lait maternel protège contre NEC développement par le biais de l’inhibition du récepteur toll-like récepteurs immunitaires innées 4 (TLR4) dans l’épithélium intestinal par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)11de la voie de signalisation. La supplémentation du lait maternel à une formule expérimentale de NEC a atténué la réponse inflammatoire chez NEC, tel que démontré par l’inhibition de l’apoptose de l’entérocyte et restauration des entérocytes prolifération d’une manière qui dépendait de croissance épidermique Factor (EGF) et EGFR11. Dans une autre étude, il a été démontré que des nitrates, une autre composante du lait maternel, contribue à son caractère protecteur en modulant la perfusion intestinale, comparativement aux préparations pour nourrissons, qui manque de nitrate et peuvent contribuer à l’augmentation de la fréquence de l’entérocolite nécrosante dans formule nourris les bébés12,13. Autres composés présents dans le lait maternel qui sont sont révélées être impliquées dans la protection contre le NEC incluent des oligosaccharides de lait humain, L-arginine, glutamine et lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Ces éléments bénéfiques du lait maternel révèlent la nécessité de son utilisation dans la prévention de l’entérocolite nécrosante, mais soulignent également l’importance d’étudier les mécanismes de signalisation des voies et les effets cellulaires impliqués dans la façon dont le lait maternel est médiation la protection contre le NEC .

Dans l’ordre afin d’étudier les propriétés protectrices du lait maternel dans un modèle murin de NEC, nous avons développé une technique innovatrice et facile à utiliser, par où la souris le lait maternel peut être extraite d’un barrage anesthésié à l’aide d’un maternel électrique pompe11,12 . Cette stratégie d’acquisition de lait maternel de la souris est avantageuse, non seulement parce que humain tire-laits sont facilement accessibles et efficaces dans l’achat de lait maternel, mais aussi parce que cette méthode permet des analyses de lait maternel propres à chaque espèce. En conséquence, nous permet de comparer les effets du lait maternel de la souris avec celles du lait maternel humain comme donneur humain le lait pasteurisé provenant une banque de lait dans les modèles spécifiques à l’espèce. Cette technique permet l’étude des composants du lait maternel en ce qui concerne leur contribution à la prévention de la NEC. Autres chercheurs ont mis au point des méthodes d’extraction lait maternel, mais ces techniques sont manuelles et nécessitent plus d’un laboratoire membre20,21,22. Une technique simple qui peut être utilisée en modifiant un tire-lait électrique humain pour collecter le lait d’une souris est présentée ici. Cette technique peut également être appliquée à d’autres espèces.

Afin de bien interroger les voies de signalisation impliquées avec NEC, modéliser les systèmes sont nécessaires pour évaluer tous les types de cellules différents connus pour être affectés dans le processus de la maladie. Ici, nous discutons un tel système de modèle - enteroids - et leur mise en place de la souris et de l’intestin humain. Enteroids intestinaux humains (Eih) en particulier fournir des promesses importantes, parce qu’ils offrent un modèle humain novateur, génétiquement diverse le ex vivo pour faciliter l’étude des processus physiopathologiques qui se déroulent dans le tractus gastro-intestinal 23. Enteroids ont été trouvés à être cultivées à long terme et peuvent être congelés pour plus tard utilisation23, et contrairement à l’humain organoïdes intestinale (HIOs), dont les cultures sont développées à partir des cellules souches pluripotentes inductible, enteroids sont générés à partir des cellules souches dans les cryptes intestinales isolées24. Enteroids exigent moins d’entretien, peut être infecté rapidement25et peut être facilement établie puisque des cryptes intestinales sont plus différenciés que HIOs23. Donc, HIEs offrent de nombreux avantages par rapport aux techniques existantes car ils peuvent être développés pour exposer des propriétés de compositions et les fonctions spécifiques à une région de l' épithélium gastro-intestinal humain23. L’utilisation d’enteroids est un choix très efficace lorsque le besoin d’un modèle humain de l’intestin, avec respect des limites propres à chaque région et facilité d’utilisation. Nous démontrons la technique d’isoler et de maintenir les principales cellules souches dérivées petit intestinale enteroids de souris et les humains prématurés.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures animaux dans cette étude ont été approuvées par soit l’Université de Washington à animalier institutionnels St.Louis et Comité de l’urbanisme (protocole 20160187) ou animalier institutionnel d’Université de Pittsburgh et Comité de l’urbanisme (protocole 14103918). Humain intestin fœtal à moins de 24 semaines de grossesse a été obtenue conformément aux directives marchés publics tissus anatomiques Université de Pittsburgh après approbation Institutional Review Board (protocole PRO14100537) de l’Université de Pittsburgh santé Sciences Banque de tissus grâce à un système intermédiaire honnête. Le lait maternel humain dépersonnalisées ou du lait maternel pasteurisé donneur a été obtenu avec une dispense de consentement de l’Université de Pittsburgh Institutional Review Board.

1. crypte isolement et mise en place d’Enteroids de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré

  1. Préparation des médias
    NOTE : Media doit être préparés dans la hotte la veille de l’isolement de la crypte.
    1. Préparer des milieux de Culture L 1,11. Commencer avec 1 L support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine et ajouter 110 mL sérum fœtal (SVF) (concentration finale 10 %), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL insuline stérile (final concentration de 0,1 %).
    2. Préparer 500 mL d’un mélange PBS-antibiotique. Commencer avec 500 mL 1 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) avec 10 % FBS et ajouter 5 mL de gentamicine (concentration finale 1 %), 1 mL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %).
    3. Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #1. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 600 µL 0,5 M d’acide tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).
    4. Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #2. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 300 µL 0,5 M EDTA (concentration finale 5 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).
    5. Préparer 50 mL de milieu de Culture crypte sans facteurs de croissance. Mesurer 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 et ajouter 10 mL FBS (concentration finale 20 %).
      1. Ajouter 500 µL pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acide sulfonique (HEPES) (concentration finale de 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 500 µL 100 x N-2 Supplément, 1 mL 50 x sans sérum supplément (par exemple, B-27) moins de vitamine A et 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
    6. Préparer 1 mL de milieu de Culture crypte présentant des facteurs de croissance. Tout d’abord préparer 1 mL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance. Ajouter 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (concentration finale 500 ng/mL) et 0,5 µL 100 µg/mL EGF (concentration finale 50 ng/mL).
  2. Isolement de la crypte
    1. Place solubilisée extrait de la membrane basale (voir Table des matières) sur la glace pour décongeler avant de commencer.
      NOTE : Membrane basale donjon sur glace ou il va polymériser.
    2. Respectant un protocole institutionnel animalier et Comité d’urbanisme pour souris supérieures à 14 jours d’âge, euthanasier souris avec deux méthodes d’euthanasie avec le second constituant une mesure physique pour s’assurer de la mort.
      Remarque : Pour les souris sous 14 jours d’âge, la décapitation est la procédure standard à l’aide de ciseaux.
    3. À l’aide de ciseaux et pinces, pratiquer une incision verticale vers le bas de la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, pour toute la longueur de l’abdomen. L’accise de l’intestin grêle de l’estomac pour le caecum avec des ciseaux et enlever le mésentère avec une pince.
      Remarque : Deux semaines mâles et femelles C57BL/6J souriceaux, chacun pesant 5,5-7 g, ont été utilisés pour l’isolement de la crypte. N’importe quel âge ou taille de la souris peut être utilisée pour l’isolement de la crypte.
    4. Pour préparer l’intestin grêle fraîchement récolté pour l’isolement de la crypte, intestin position droite et couper l’intestin longitudinalement sur toute sa longueur à l’aide de ciseaux.
      Remarque : La souris et l’intestin humain peuvent être préparés de la même façon.
    5. Propres selles dans l’intestin en le secouant doucement l’intestin en arrière dans un récipient Petri de PBS-antibiotique mélange avec une pincette.
    6. Ajouter 30 mL de perturbation des cellules Media #1 pour un tube conique de 50 mL. Couper l’intestin en morceaux de longueur 0,5 cm directement dans le tube. Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.
    7. Alors que les tissus sont sur le shaker, procurer des plaques de 24 ou 48 puits pour cultiver des cryptes si les enteroids sont à utiliser pour les ARN, ADN ou isolement de protéine. Utilisation 8 puits chambre diapositives à cultiver des cryptes si les enteroids doivent être utilisés pour tout Mont imagerie confocale.
    8. Dans la hotte, ajouter 15 µL de membrane basale au fond de chaque puits de la plaque de 24 ou 48 puits. Si vous utilisez des diapositives de la chambre, ajouter 9 µL de membrane basale dans le fond de chaque chambre.
      Remarque : Régler le volume de la membrane basale selon la taille de la plaque si nécessaire.
    9. La membrane basale avec l’embout de la pipette se propager rapidement afin que la membrane basale forme une couche mince sur le fond du puits. Placer la plaque à 37 ° C dans l’incubateur pendant 30 min permettre à la membrane basale à polymériser.
      Remarque : Les cryptes ne s’attachera pas si la membrane basale n’est pas une mince couche ou si la membrane basale contient des bulles d’air.
    10. Après 15 min sur un agitateur, filtrer le tissu à travers un tamis de 100 µm. Jeter le débit à travers.
    11. Ajouter 30 mL de cellule perturbation Media #2 dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube.
    12. Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.
    13. Après 15 min sur le shaker, filtrer des tissus à travers un tamis de 100 µm. Maintenir les flux grâce à cette étape, au cas où les rendements sont faibles dans les étapes ultérieures.
      NOTE : Tous les flux à travers des tubes doit être conservé sur la glace.
    14. Ajouter 15 mL DMEM avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube. Vigoureusement agiter le tube à la main pendant 10 s. filtre à travers un tamis de 100 µm et de recueillir les traversent. Répétez jusqu'à ce que traversent ne contient aucuns particules.
    15. Dans la hotte, filtrer le flux par le biais de l’étape précédente dans un nouveau tube conique de 50 mL à l’aide de 70 µm crépines pour tissus de souris ou 100 µm crépines pour les tissus humains.
      NOTE : Ont des filtres supplémentaires en attente et versez lentement comme crépines seront obturé par des débris.
    16. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min à 4 ° C et déposez directement dans un seau à glace dans la hotte. Retirez le surnageant par pipette sans déranger le culot. Resuspendre le culot avec le montant souhaité de la crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.
      Remarque : Les cryptes enrichis sont la couche « sable » de la pastille. Chacun requiert bien 250 µL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.
  3. Mise en place d’enteroids
    1. Plaque de mélange médias crypte directement sur la membrane basale.
    2. Vérifier les cryptes avec un microscope pour s’assurer que le processus d’isolement a été un succès.
      Remarque : Les cellules et les boules de cellules sont souhaitées. Environ 100 des cryptes sont plaqués par puits.
    3. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h permettre des cryptes d’adhérer à la membrane basale.
      Remarque : Cette incubation est avec crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.
    4. Retirez lentement les médias et les cryptes excès, impossible d’attacher à l’aide d’une pipette de P-200.
      Remarque : Ne pas déranger la membrane basale comme les cryptes ci-joint peuvent se déplacer.
    5. Ajouter lentement 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance à chaque puits.
      Remarque : Pour 24, 48 plats ou chambre glisse, 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance est suffisante.
    6. Remplacer les médias tous les 2 jours avec frais crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance pendant 5 jours avant les traitements permettant la croissance et une fixation optimale.

2. souris Breast Milk Collection

  1. Séparer un barrage qui allaitent C57BL/6J au post-partum 7-12 jours de ses chiots durant 6 h avant la traite.
  2. Anesthésier le barrage de lactation avec isoflurane via un cône de nez et d’administrer une injection sous-cutanée d’ocytocine à 0,15 UI/kg de poids corporel. Attendre 3 minutes avant d’effectuer la procédure de traite.
  3. Nettoyer les trayons avec éthanol à 70 % avant la procédure de traite et laissez sécher.
  4. Extraire le lait de tétines un à la fois en utilisant une pompe électrique maternel avec tube silicone dimensionnée en fonction des tétines de souris dans un tube de prélèvement de 5 mL.
    Remarque : Tire-lait optimale possèdent deux paramètres, un pour la vitesse et un pour l’aspiration. Il est préférable de commencer avec les plus petits paramètres de chacun et les deux augmente lentement jusqu'à ce que le lait est extrait. Idéalement, le rendement total sera ~ 500 µL - 1 mL de lait maternel de la souris par barrage de lactation.
  5. Le lait maternel immédiatement aliquote et conserver à-80 ° C.
    Remarque : Évitez de gel/dégel cycles.
  6. Traiter les enteroids le jour 5 avec 50 µL/mL de lait maternel souris / mL de milieu de Culture de crypte présentant des facteurs de croissance pendant 24 h à 37 ° C.

3. ensemble de monter la coloration des Enteroids

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer les PBS 1 x 16 mL par 8 puits.
    2. Préparer 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) en solution de 1 PBS x par 8 puits.
    3. Préparer 2 mL 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x par 8 puits.
    4. Préparation de 24 mL PBS Tween (PBST est 0,1 % Tween 20 à 1 x PBS) par 8 puits.
    5. Préparer 2 mL 10 % âne normal de sérum (NDS) dans 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) par 8 puits.
    6. Préparer 4 mL 1 % NDS dans 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) par 8 puits.
  2. Jour 1 de la coloration
    1. Aspirer au large de traitements et enteroids avec du PBS de lavage. Ajouter 250 µL 4 % PFA / puits. Placer sur rotateur pendant 1-2 h à 4 ° C. Enlever les 4 % PFA avec pipette.
    2. Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 10 min à température ambiante (RT).
      Remarque : Il est possible de stocker la plaque pendant 1 à 2 jours à 4 ° C si nécessaire.
    3. Ajouter 250 µL/puits 0,1 % X-100 Triton. Incuber pendant 1 heure à RT. Remove 0,1 % Triton X-100 avec la pipette.
    4. Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 15 min à température ambiante.
    5. Ajouter 250 µL/puits 10 % NDS/PBST. Incuber pendant 45 min à RT. Remove 10 % NDS/PBST avec pipette.
    6. Ajoutez l’anticorps primaire µL/puits 250, 1/250 dilué à 1 % NDS/PBST et incuber une nuit à 4 ° C.
      Remarque : La dilution optimale anticorps varie selon le fabricant.
  3. Jour 2 la coloration
    1. Laver au moins 5 fois pendant 4-5 h avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur à 4 ° C entre chaque lavage.
    2. Ajouter 250 µL/puits secondaires anticorps, dilué 1/1 000 à 1 % NDS/PBST. Enrouler la plaque au fleuret et incuber une nuit à 4 ° C.
  4. Jour 3 de coloration
    1. Ajouter 250 µL/puits nucléaires tache 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min.
      Remarque : Maintenir la plaque dans l’obscurité.
    2. Laver 6 fois avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur pendant 10 min à 4 ° C entre chaque lavage.
    3. Lamelle de Mont sur Chambre glisser avec support de montage.
    4. Prendre des photos avec un 40 X objectif microscope confocal et également restituer dans un raster éditeur graphique (voir Table des matières).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Tout d’abord, nous avons voulu étudier si avec du lait maternel ou du lait maternel pasteurisé donneur a eu un effet sur petit enteroids intestinale. En effet, lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la croissance des souris néonatale (Figure 1 a) et prématurée humaine dérivée enteroids (Figure 1 b).

Étant donné que le lait maternel humain a augmenté la cro...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L’importance du modèle enteroi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamineLonza12-604F
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco26140-079
Pénicilline-StreptomycineGibco15140-122
Humulin N (insuline)Eli Lilly And Company0002-8315
1x solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s ( DPBS)Sigma-AldrichD8537
GentamicineGibco15750-060
Amphotéricine BGibco15290-026
0,5 M Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0Invitrogen15575-020
1x Advanced DMEM/F-12Invitrogen12634-028
200 mM L-GlutamineGibco25030-081
1 M Acide n-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES)Sigma-AldrichH3537
N-acétylcystéineSigma-AldrichA9165
100x N-2 SupplémentGibco17502-048
50x B-27 Supplément moins vitamine AGibco08-0085SA
100x inhibiteur de ROCK Y-27632, dichlorhydrateSigma-AldrichY0503
Souris recombinante Wnt3a ProtéineR& D Systems1324-WN
Souris murine NogginPeproTech250-38
Souris recombinante R-Spondin 1R& D Systems3474-RS
Facteur de croissance épidermique murin recombinant (EGF)PeproTech315-09
Facteur de croissance matrigel Matrice de membrane basale réduiteCorning356231
35 x 10 mm Boîte de Pétri de culture cellulaireEppendorf0030700112
24 puitsEppendorf0030722116
Cellule 48 puits Plaque de cultureEppendorf0030723112
8 puits Nunc Lab-Tek II Système de lames de chambreThermo Scientific154534
50 mL Tube coniqueCorning352070
100 &mu ; M Passoire à cellules stérilesFisher Scientific22-363-549
70 &mu ; M Passoire à cellules stérilesFisher Scientific22-363-548
1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2Invitrogen20012-027
16 % de paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique Sciences15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Âne normal Sérum (NDS)Sigma-AldrichD9663
4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate (DAPI)InvitrogenD1306
Couvercle de microscope VerreFisher Scientific12-544-D
Microscope confocal Leica TCS SP8 XLeica MicrosystemsN/A
Photoshop CS6Adobe SystemsN/A
18 G Aiguille de 1,5 pouceBecton Dickinson305196
IsofluraneSigma-Aldrich792632
OcytocineSigma-AldrichO3251
Humain Double Tire-lait électriqueLansinoh044677530163
5 mL Tube à essai à fond rondCorning352058
Bouchons en caoutchoucFrey Scientific560761
Anticorps Ki67AbcamAB15580
amorce humaine Mki67 F : 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R : 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A

Références

  1. Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
  2. Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
  3. Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
  4. Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
  5. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
  6. Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
  7. Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
  8. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  9. Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
  10. Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
  11. Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
  12. Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  13. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  14. Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
  15. Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
  16. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  17. Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
  18. Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
  19. Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
  20. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  21. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
  24. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  25. Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
  26. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Culture d ent ro deseffets du lait maternelisolation de l intestin de sourisisolation des cryptespolym risation de la membrane basalemarquage par immunofluorescenceextraction du lait maternelent ro des de souris n onataletraitement au lait maternel humain
Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.