Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.
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Article de méthode
Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.
Introduction
L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé....
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Protocole
Toutes les procédures animaux dans cette étude ont été approuvées par soit l’Université de Washington à animalier institutionnels St.Louis et Comité de l’urbanisme (protocole 20160187) ou animalier institutionnel d’Université de Pittsburgh et Comité de l’urbanisme (protocole 14103918). Humain intestin fœtal à moins de 24 semaines de grossesse a été obtenue conformément aux directives marchés publics tissus anatomiques Université de Pittsburgh après approbation Institutional Review Board (protocole PRO14100537) de l’Université de Pittsburgh santé Sciences Banque de tissus grâce à un système intermédiaire honnête. Le lait maternel humain dépersonnalisées ou du lait mate....
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Résultats
Tout d’abord, nous avons voulu étudier si avec du lait maternel ou du lait maternel pasteurisé donneur a eu un effet sur petit enteroids intestinale. En effet, lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la croissance des souris néonatale (Figure 1 a) et prématurée humaine dérivée enteroids (Figure 1 b).
Étant donné que le lait maternel humain a augmenté la cro.......
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Discussion
L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L’importance du modèle enteroi.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêt.
Remerciements
MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (insuline) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s ( DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicine | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotéricine B | Gibco | 15290-026 | |
| 0,5 M Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M Acide n-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-acétylcystéine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplément | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplément moins vitamine A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x inhibiteur de ROCK Y-27632, dichlorhydrate | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Souris recombinante Wnt3a Protéine | R& D Systems | 1324-WN | |
| Souris murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Souris recombinante R-Spondin 1 | R& D Systems | 3474-RS | |
| Facteur de croissance épidermique murin recombinant (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Facteur de croissance matrigel Matrice de membrane basale réduite | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Boîte de Pétri de culture cellulaire | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24 puits | Eppendorf | 0030722116 | |
| Cellule 48 puits Plaque de culture | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8 puits Nunc Lab-Tek II Système de lames de chambre | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Tube conique | Corning | 352070 | |
| 100 &mu ; M Passoire à cellules stériles | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 &mu ; M Passoire à cellules stériles | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16 % de paraformaldéhyde (PFA) | Microscopie électronique Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Âne normal Sérum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Couvercle de microscope Verre | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Microscope confocal Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G Aiguille de 1,5 pouce | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Ocytocine | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Humain Double Tire-lait électrique | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Tube à essai à fond rond | Corning | 352058 | |
| Bouchons en caoutchouc | Frey Scientific | 560761 | |
| Anticorps Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| amorce humaine Mki67 F : 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R : 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated | DNA Technologies | N/A |
Références
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
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