Method Article

La ligature partielle biliaires chez la souris : un modèle contrôlé de la cholestase Obstructive localisée

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici la ligature partielle du cholédoque comme modèle chirurgical des lésions hépatiques et la régénération chez les rongeurs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chez les rongeurs, ligature complète du cholédoque (LCCC) de la voie biliaire principale est une technique chirurgicale établie pour l’étude de prolifération de cholestase et canal biliaire obstructive. Cependant, des expériences à long terme peuvent conduire à la mortalité et une morbidité accrue. Chez les souches de souris sélectionnez avec hépatopathie sous-jacente, des comparaisons significatives sont possibles même avec ligature d’un seul lobe du foie, qui peut réduire les frais et pertes animales. Nous décrivons ici la ligature partielle du cholédoque (pBDL) chez la souris, dans lequel seul le canal biliaire hépatique gauche est ligaturé, provoquant une obstruction biliaire dans le lobe gauche mais pas les lobes restants. Avec soin technique microchirurgicale, pBDL expériences peuvent être rentables, étant donné que le lobe unligated sert de témoin interne aux lobes ligaturés, lorsqu’ils sont soumis aux mêmes conditions chez le même animal. Contrairement à la LCCC, un groupe de contrôle opérés distinct n’est pas nécessaire. pBDL est très utile de comparer directement les modèles localisés par rapport aux effets systémiques de la cholestase et d’autres composants de la bile retenue. pBDL peut également être réutilisé comme nouvelle méthode pour étudier les mécanismes associés aux médicaments et la migration cellulaire.

Introduction

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Les modèles chirurgicaux d’atteinte hépatique aiguë et de réparation, par exemple une hépatectomie partielle ou la ligature du cholédoque (LCCC), ont servi pendant des décennies chez les rongeurs pour étudier la régénération du foie et biopathologie1,2. Dans cBDL, le canal cholédoque (qui draine toutes les bile produite dans le foie) est ligaturé, entraînant une cholestase obstructive, l’inflammation et la fibrose dans les 2 ou 3 premières semaines suivant la chirurgie, avec éventuelle évolution vers la cirrhose3. Prolifération des canaux cholédoques, transdifférenciation et l’induction de cellules progénitrices du foie résident sont également caractéristiques de la LCCC4,5. Bien que la LCCC élucide des mécanismes spécifiques de cholangiopathie obstructive, qui sont bien caractérisés avec des résultats reproductibles chez les souris de type sauvage et chez ces souches avec foie normal6,7,8, le procédure peut être techniquement difficile dans certains modèles de souris transgéniques de maladies du foie, nécessitant plus d’animaux que prévu en raison de la morbidité plus élevée et la mortalité d’obstruction des voies biliaires au fil du temps. Cette technique est également bénéfique pour l’étude des maladies des souris transgéniques avec les sous-jacents du foie, qui pourrait tolérer pas sinon le stress d’expériences de cours temps prolongé après la LCCC.

pBDL peut fournir une solution de rechange raisonnable pour aider à surmonter certains de ces défis. PBDL initiale des études chez la souris sauvage visant à distinguer localement par intérim et systémiques des médiateurs de l’inflammation9. Dans pBDL, confluent biliaire principal des canaux biliaires hépatiques droite et gauche au-dessus de la voie biliaire principale est visualisé avec précaution à l’hile et seulement le canal biliaire hépatique gauche est ligaturé pour générer une cholestase obstructive localisée. pBDL offre plusieurs avantages à la LCCC. Dans pBDL, le lobe droit unligated sert de témoin interne identique apparié pour le lobe gauche ligaturé, soumis aux mêmes effets systémiques, tels que l’état nutritionnel ou de facteurs de la circulation. Bien que des médiateurs pro-inflammatoires systémiques étaient présents, Osawa et al. observé moins la fibrose et nécrose dans les lobes unligated, mais augmenté des cellules inflammatoires et l’expression de β-facteur de croissance transformant dans le lobe ligaturé9.

Plus récemment, pBDL a été redéfini pour étudier les effets parenchymateux hépatiques de bile retenu10. En utilisant le même animal contrôle interne (unligated « trompe-l'œil ») et de groupes expérimentaux, pBDL efficacement diminue de moitié le nombre d’animaux nécessaires par l’expérience, qui à son tour est plus rentable. Les souris tolèrent les effets de pBDL beaucoup mieux, afin que le moment idéal cours expérimenter (≥ 2 semaines) peuvent être réalisés dans le lobe ligaturé. Mais surtout, pBDL peut distinguer des effets directs intrahépatiques de cholestase obstructive et conservé des composants de la bile dans le lobe ligaturé, par rapport au lobe unligated contrôle. Dans l’ensemble, pBDL est une méthode intéressante pour étudier les effets de lobe spécifique de la cholestase localisée dans le foie.

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Protocol

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Toutes les procédures ont été menées conformément aux lignes directrices éthiques de l’animalier institutionnel et le Comité d’urbanisme de l’Université de Pittsburgh.

1. bases Techniques et procédures communes

  1. Autoclave tout équipement MICROCHIRURGICAL avant utilisation.
  2. Pour éviter de tuer la souris par l’anesthésie, vérifiez attentivement sa respiration.
  3. Toucher des organes et des intestins aussi peu que possibles éviter d’endommager les organes et causant une hémorragie. Appuyez sur points de saignements avec des cotons-tiges mouillés ou des éponges de gaze.
  4. Utiliser des cotons-tiges mouillés pour une manipulation douce des organes. Éponges de gaze humide et non tissés sont utilisés dans deux tailles, 3,5 × 3,5 cm et 6,0 x 6,0 cm. utilisent la plus petite se pour rétracter foie entier. Utiliser plus pour envelopper les petits et gros intestins.

2. une préparation

  1. Utiliser les souris c57/b6 mâles, 8-12 semaines d’âge (quelle poids est environ de 20 à 35 g) pour ligature partielle du cholédoque.
  2. Permettre les souris libre accès à l’eau et de nourriture jusqu'à ce que l’induction de l’anesthésie.

3. opération de ligature partielle du cholédoque

  1. Anesthésier la souris en plaçant l’animal dans une chambre à induction avec un mélange de 1,5 à 2,0 % isoflurane et 1 L/min d’oxygène. Surveiller attentivement l’animal en observant la fréquence respiratoire. Lorsque le taux de respiration de l’animal est un souffle par seconde, la souris est bien anesthésiée. Étant donné que le réflexe de retrait avant branche disparaît plus rapidement, pincer le pied du membre postérieur ainsi pour confirmer l’absence totale du réflexe de retrait. Yeux doit être lubrifiés avec un agent lubrifiant ophtalmique pour prévenir les ulcères cornéens. Remarque cette première dose d’analgésique peut être donnée en pré-opératoire pour empêcher la stimulation des récepteurs de la douleur.
  2. Raser la paroi abdominale avec tondeuses à cheveux et placez la souris sur la table d’opération chirurgicale sous le microscope chirurgical. Fixer tous les membres de la table avec du ruban. Inhalation isoflurane permet de maintenir la souris sous anesthésie générale.
    1. Ajustez le vaporisateur isoflurane et utilisez isoflurane 2,0-3,0 % pour l’induction.
  3. À l’aide d’écouvillons stériles, désinfecter la paroi abdominale tout d’abord avec 0,3 à 0,5 mL povidone-iode appliqué par voie topique, suivie de l’éthanol à 70 %. Animal devrait être recouvert d’un drap stérile.
  4. Faire une incision abdominale médiane longue de la xiphoïde au pubis en utilisant les ciseaux et pinces Adson. Après avoir fait l’incision abdominale, réduire l’isoflurane à 0,8-1,0 % pour l’entretien.
  5. Exposer la cavité abdominale à l’aide d’un Micro-retractor. Tenez la xiphoïde avec une pince de moustique et rétracter vers la tête de la souris. Fixer la pince du moustique à l’aide d’argile molle.
  6. Instiller 1 à 2 mL de chaud (37 ° C) stérilisée saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la cavité abdominale pour ne pas blesser les organes abdominaux. Tenez l’intestin grêle avec des cotons-tiges mouillés et les retirer doucement vers la tête de la souris. Couper les ligaments entre l’intestin grêle et le rétropéritoine pour ne pas blesser l’intestin grêle (Figure 1 a).
  7. Envelopper les intestins petits et grands avec un tampon de gaze humide, non tissé. Placez-les sur la partie caudale de la cavité abdominale. Intestins, enveloppés dans une gaze stérile peuvent être placés sur le champ stérile et drapé pour éviter la contamination.
  8. Retirer doucement le foie entier vers la xiphoïde en utilisant une éponge petite gaze humide de non-tissé pour exposer le hile hépatique et le ligament hépato-duodénal (Figure 1 b).
  9. Cocher pour confirmer l’anatomie du hile hépatique. Le canal cholédoque est situé sur la face ventrale de la veine porte. Confirmer les emplacements de la droite et la gauche hépatiques et biliaires, qui se jettent dans le confluent biliaire principal à du hile hépatique.
  10. Identifier la gauche biliaires hépatiques qui draîne le lobe gauche et entourent avec une suture de nylon de 10-0 en utilisant le côté brutal d’une aiguille de suture (Figure 2 a). Ne pas blesser la veine porte, artère hépatique et la surface du foie.
  11. Ligaturer le canal biliaire gauche avec du nylon de 10-0. (Figure 2 b).
  12. Placer les petits et les grands intestins dans la même position qu’avant l’opération à l’aide de tampons de coton humide.
  13. Confirmer il n’y a aucune torsion intestinale et hémorragie intra-abdominale, puis fermez le muscle et la peau en deux couches avec vicryl 4-0. Suture tressée (Vicryl) a été utilisé pour la fermeture de la peau, mais monofilament est préféré à réduire le risque d’infection.
    Remarque : Fermez fascia par suture continue de xiphoid au pubis et fermez la peau par suture continue du pubis à la xiphoïde.
  14. Arrêter l’anesthésie après la fermeture de l’incision.

4. suivi et traitement postopératoire

  1. Juste après la chirurgie, pincer la peau du dos de la souris et injecter Buprenex (0,1 mg/kg) et la céfazoline (100 mg/kg) par voie sous-cutanée, suivi par Buprenex injection toutes les 12 h pendant 3 jours et la céfazoline toutes les 24 h pendant 3 jours respectivement11,12 ,,13. Remarque cette première dose d’analgésique peut être donnée en pré-opératoire pour empêcher la stimulation des récepteurs de la douleur. Céfazoline et autres antibiotiques péri-opératoire ne sont nécessaires pour les animaux immunodéprimés, tels que ceux utilisés dans les études de transplantation.
    Remarque : Si la chirurgie est effectuée avec succès, la souris habituellement récupère dans 30 min. activité des souris sera presque identique à l’État préopératoire.
  2. Vérifier les souris tous les jours pour des signes de détresse.
    1. Sacrifier les souris par la dislocation cervicale sous anesthésie générale pour se procurer les foies et autres échantillons de tissus aux points de temps définie (p. ex., 7, 14, 21 jours) après pBDL.

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Results

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Pour cette expérience typique, pBDL a été réalisée chez les souris transgéniques PiZ en triple, qui récapitulent la maladie du foie humaine trouvée en alpha-1 antitrypsine (A1AT). La souris de PiZ risque un transgène consistant en plusieurs fragments génomiques d’ADN qui contiennent les régions codantes du gène mutant à A1AT humaine et promoteur, ainsi que les introns et ~ 2 kilobases d’en amont et en aval bordant les régions14, 15

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Discussion

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Bien que cBDL est la technique la plus courante expérimentale pour cholestase obstructive, il peut présenter des défis multiples chez les rongeurs. Selon le nombre de jours postopératoires requis pour atteindre un point de terminaison, les animaux peuvent éprouver une cause de morbidité et de mortalité avec le temps. Le degré de lésion tissulaire et nécrose biliaire est encore aggravé lorsque vous travaillez avec certains modèles de souris transgéniques de maladie du foie, qui démontrent le parenchyme hépatique anormale ...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgements

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Le Dr Khan reconnaît subventions de NIH/NICHD K12HD052892, la Fondation de l’Alpha-1, la Fondation Hillman et le centre de recherche de foie de Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconnaît subventions de NIH/NIDDK P01DK096990. Nous apprécions l’assistance technique excellente et généreuse de Anne Orr. Nous sommes également reconnaissants à m. David A. Geller pour donner accès au laboratoire de transplantation/rongeur microchirurgie.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope-Leica Wild M650, 6&ndash ; 40&fois ; grossissementLeica Microsystemsn/a
Tec 3 isoflurane entonnoir vaporisateurd’anesthésie généralen/a
Stevens Tenotomie CiseauxPrécis Chirurgical & Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Pince AdsonOutils scientifiques fins11006-12
Moustique classique pince hémostatique délicateCodman30-4472
Micro-écarteurMurdock ; Instrument chirurgical RobozRS-6550
Éponges de gaze non tisséeFisherband870-PC-DBL
Puritan 6" Petit coton-tige avec manche en boisPuritan Medical Products Company868-WCS
Dumont SS Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/13.5cmOutils scientifiques fins11203-23
Dumont SS Forceps - Standard Tips/Angled 45° ;/Inox/13.5cmOutils scientifiques fins11203-25
Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant 3mmOutils scientifiques fins15000-00
Porte-micro-aiguillesAesculap Surgical InstrumentsFD231R
Micro AROSuture, suture stérile en nylon 10-0, 70 & micro ; m, points TAPAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
Seringue de 5 mlBD309646
Falcon Boîte de culture tissulaire, 60 × ; 15 mmCorning353002
Isoflurane, Liquide de la Pharmacopée des États-Unis (USP) pour inhalation, 250 mlPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
Buprenex injectable (chlorhydrate de buprénorphine)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Céfazoline pour injection , USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
Solution de gommage PVP (povidone&ndash ; iode 7,5 %)MedlineNDC 12496-0757-1
70 % éthanolDecon Labs2716
Saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésiumLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
HematolxylinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
FormolFisherSF100-20
Services

References

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