Ce manuscrit décrit l’utilisation de souris transgéniques journaliste et itinéraires différents administration des colorants fluorescents en angiotensine II l’hypertension induite par microscopie intravitale vidéo des vaisseaux sanguins pour évaluer l’activation des cellules immunitaires et leur capacité à rouler et à adhérer à l’endothélium.
Article de méthode
Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges
Dans cet article
Résumé
Résumé
Intravitale vidéo microscopie à épifluorescence (IVM) des vaisseaux sanguins est une méthode établie pour évaluer l’activation des cellules immunitaires et leur aptitude au rôle et adhèrent à la couche endothéliale. Visualisation des cellules circulantes par injection de colorants fluorescents ou anticorps couplé à un fluorophore est couramment utilisée. Alternativement, les souris journaliste fluorescent peuvent être utilisés. Les interactions des leucocytes, en particulier lysozyme M+ (LysM+) monocytes, avec la paroi des vaisseaux jouent un rôle essentiel dans la promotion d’une dysfonction vasculaire et une hypertension artérielle. Nous présentons ici la technique pour visualiser et quantifier les leucocytes de roulement et l’adhérence dans les artères carotides de l’angiotensine II (AngII)-induite de l’hypertension chez les souris par IVM.
L’implantation d’un cathéter endommage la paroi vasculaire et mène aux réponses de l’altération des cellules sanguines. Nous avons comparé les techniques d’injection différent et voies d’administration de visualiser des leucocytes dans un LysMCre++ d’IRG souris généralisée et d’expression de la protéine fluorescente rouge expression conditionnelle de la protéine fluorescente verte en LysM + cellules. Pour étudier l’activation des cellules LysM+ , nous avons utilisé AngII infusé de souris dans lequel roulant et l’adhésion des leucocytes à l’endothélium est augmentée. Nous avons injecté soit cathéter de l’acridine orange à l’aide d’une jugulaire ou directement si la queue de la veine et par rapport à la quantité de laminage et adhérant cellules. Nous avons constaté qu’implantation de cathéter Jugulaire en soi a augmenté le nombre de roulement et adhérent aux cellules LysM+ en trompe-l'œil infusé LysMCre+souris IRG+ par rapport aux témoins. Cette activation est augmentée chez les souris AngII infusé. Fait intéressant, injection d’adhésion cellulaire de l’acridine orange directement par le biais de la queue veineuse n’a pas augmenté LysM+ ou roulement chez les souris infusé sham. Ainsi, nous avons démontré l’importance des souris transgéniques journaliste exprimant des protéines fluorescentes ne pas gêner le processus de in vivo au cours de l’expérimentation. En outre, queue injection dans la veine des traceurs fluorescents peut être une alternative possible à des injections de cathéter jugulaire.
Introduction
L’hypertension artérielle augmente le risque de maladie cardiovasculaire et de décès et favorise le développement de l’athérosclérose, maladie coronarienne et artériels ou veineux thromboembolisms1. Le développement de l’hypertension repose sur l’interaction des facteurs environnementaux, génétiques, endocriniens et hémodynamiques. Actuellement, immunité et inflammation connexe sont appréciés pour jouer un rôle important dans l’étiologie de l’hypertension2.
Parmi les cellules immunitaires, macrophages ainsi que les monocytes et les lymphocytes T se sont avérés pour être causalement impliqués dans l’inflammation vasculaire induite par AngII et l’hypertension, en partie liée à leur capacité à déclencher d’espèces réactives de l’oxygène3. Souris déficientes en macrophage colony-stimulating factor a montré une réponse réduite à AngII concernant l’augmentation de la pression artérielle et de l’inflammation vasculaire4. Dans un travail antérieur, nous avons pu montrer que les monocytes LysM + lecteur dysfonction vasculaire et l’inflammation dans l’hypertension induite par AngII5. Plus récemment, nous avons décrit une nouvelle voie dans laquelle la coagulation facteur XI coopère avec les plaquettes et la paroi des vaisseaux pour provoquer l’inflammation vasculaire dépendante de thrombine6. Les connaissances actuelles sur le rôle du système immunitaire dans l’hypertension a été récemment résumées et examinés par Rodriguez-Iturbe et al. 7
Depuis l’implication de cellules immunitaires dans le développement de l’hypertension artérielle est devenue évidente, modèles et techniques pour étudier l’interaction entre le navire et les cellules immunitaires est devenu nécessaires. IVM épifluorescence des vaisseaux sanguins est un outil utile pour l’observation in vivo des interactions entre circulation des cellules sanguines et l’endothélium8,9,10. Avec cette technique, injection de colorants intercalant avec l’ADN (par exemple l’acridine orange) permet de visualiser les cellules nucléées (circulation ainsi que de l’endothélium). Plaquettes isolés teint ex vivo avec rhodamine 6 G ou dichlorofluorescéine (DCF) peut être injectée pour visualiser le thrombus plaquettaire riche en modèles de lésion artérielle ou veineuse.
En règle générale, un cathéter de veine jugulaire est utilisé pour injecter à traceurs ou marqué les plaquettes. Altération de l’endothélium et activation subséquente de la cascade de la coagulation sont tous deux connus pour avoir des effets sur l’activation des monocytes. Lésion endothéliale conduit immédiatement à l’activation plaquettaire par l’intermédiaire de molécules de la matrice étant pour sceller le tissu, avec qui s’ensuivit monocyte attraction et activation11. Au contraire, un endothélium intact est connu pour avoir des propriétés d’anticoagulant (p. ex. via inhibiteur de voie de facteur tissulaire ou thrombomoduline)12 et des effets inhibiteurs directs sur les monocytes, par exemple, par le biais de la sécrétion de extracellulaires vésicules contenant des microARN13. Monocytes sont connus pour produire un facteur tissulaire, l’activateur extrinsèque de la cascade de coagulation et express protéase récepteurs activés (Sea) qui peuvent être activées par la thrombine et participer aux monocytes activation14,15 . Par conséquent, toute activation des plaquettes ou de la cascade de la coagulation en raison de lésions vasculaires peut-être avoir des effets inattendus sur l’activation des monocytes et interférer avec le phénomène observé. Avec l’aide de souris transgéniques transgéniques IRG LysM Cre, une souris double-fluorescent de journaliste Cre (LysMCre++d’IRG), nous proposons d’étudier en détail l’effet des injections avec un cathéter et des méthodes alternatives sur LysM+ myélomonocytaire cellules dans un modèle murin d’hypertension artérielle,16.
Protocole
Des expériences ont été menées sur l’âge des souris mâles âgés sous l’approbation du Comité d’éthique sur l’expérimentation animale du Land de Rhénanie-Palatinat (numéro d’autorisation de 23 177-07/G12-1-002 et 23 177-07/G15-1-051) de 8 à 12 semaines.
1. préparation de la chirurgie et l’anesthésie de souris
- Avant l’opération, vérifier la bonne santé et la condition des animaux. Avant la chirurgie, surveiller les animaux une fois par jour pendant 2-3 jours de leur état général (apparence, attitude, comportement spontané) ainsi que la consommation d’eau, de nourriture et poids corporel.
- Préparer le mélange maître anesthésie avec le midazolam (5 mg/kg de poids corporel), médétomidine (0,5 mg/kg de poids corporel) et le fentanyl (0,05 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale (i.p.) injecter 200 µL/30 g souris dans la seringue de 1 mL avec une aiguille de 26 G.
- Implantation de pompe osmotique et préparation animaux pour des expériences IVM sont exécutées sur un champ d’opération avec un 39 ° C de réchauffement plate-forme. Stériliser tous les outils dans un bain de désinfection et désinfecter la plate-forme de réchauffement de la planète.
- Au cours de la procédure, protéger les yeux animaux avec pommade ophtalmique. Enlever la fourrure avec des rasoirs avant l’implantation de pompe osmotique. Utilisez une crème dépilatoire et cotons-tiges pour isoler des carotides et implantation de cathéter jugulaire dans les expériences de l’IVM. Désinfecter la peau d’un animal à l’aide de deux désinfectants de la peau : un antiseptique et désinfectant contenant la polyvidone iodée et une peau antiseptique octenidine contenant en solution à base d’alcool.
- Préparer le mélange maître d’antagoniser l’anesthésie (« antisedan mix ») avec atipamezol (0,05 mg/kg de poids corporel) et flumazénil (0,01 mg/kgdepoids poids) et de préparer 200 µL/souris dans la seringue de 1 mL avec aiguille 26 G jusqu'à être par voie sous-cutanée (s.c.) injecté.
2. implantation et préparation de la pompe osmotique
Remarque : L’infusion AngII sous-cutanée à l’aide de pompes osmotiques a été décrite en détail par Lu et al. 17
- Préparer l’AngII en reconstituant la poudre lyophilisée avec du sérum physiologique stérile et ajuster la concentration avec le poids de l’animal et le débit de la pompe. Garder l’AngII reconstituée dans des tubes en plastique (ne pas utiliser de tubes de verre).
- Remplir les pompes avec la solution AngII pour livrer 1 mg/(kg·d) pendant 7 jours. Après la préparation, maintenir les pompes dans une solution saline stérile pendant 4-6 h minimum à 37 ° C.
- Tester l’anesthésie complète de la souris après injection de la combinaison de l’anesthésie avec arrière réflexes des pieds et placez-le sur le champ de fonctionnement chaud. Induction de l’anesthésie prend 10-15 min et fonctionne mieux si les animaux sont placés dans un environnement sombre.
- Se raser le bas du dos de la souris et les désinfecter avec une antiseptique de la peau alcoolique.
- Faire une incision de 1 cm perpendiculairement à la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux. Créer une poche pour la pompe à l’aide d’une pince hémostatique du détroit et introduire la pompe (débit tout d’abord le modérateur). La poche doit permettre la libre circulation de la pompe sans aucune pression sur la plaie.
- Refermer la plaie avec des points de suture et pas de pinces, afin de limiter l’inflammation ; puis désinfecter avec antiseptique de la peau.
- Antagoniser l’anesthésie par injection s.c. 200 µL du mélange antisedan et regagner sa cage de la souris.
- Réaliser l’analgésie postopératoire avec la buprénorphine (0,075 mg/kg s.c.) une seule fois après la chirurgie et à la demande selon le comportement animal.
3. Implantation de cathéter jugulaires et carotides préparation
- Tester l’anesthésie complète de la souris après injection de l’anesthésie se mêlent les réflexes alimentaires arrière et placez l’animal anesthésié dans recumbence dorsal sur la plaque chirurgicale de 39 ° C avec une sonde rectale afin de maintenir la température et mettre la pommade sur les yeux pour les protéger pendant la procédure.
- Enlever les poils du cou à l’aide de la crème dépilatoire. Utilisez un coton-tige pour répandre et frotter la crème pendant 2 min jusqu'à ce que les poils commencent à tomber. Après un 2 min supplémentaire, retirer la crème et les poils avec une spatule et désinfecter la peau avec une antiseptique de la peau alcoolique.
- Effectuer la chirurgie sous un stéréomicroscope. Faire une incision longue de 1 à 1,5 cm dans la peau longitudinalement dans le cou, 1 cm à côté de la trachée. Ensuite, faire deux autres incisions perpendiculairement aux deux extrémités des incisions premières.
- Retirer les tissus à côté de la peau soigneusement et enlever le morceau de peau recouvrant la veine jugulaire gauche et la trachée.
- Isoler soigneusement la glande parotide ; glandes sublinguales et sous-maxillaires de la zone d’intérêt avec une pince courbe 2. Ne pas couper ou endommager les glandes, placez-les pour permettre le meilleur accès à la veine jugulaire et aux carotides.
- Pour isoler la veine jugulaire, utiliser des pinces fines et ouvrir lentement et fermez-le pour libérer doucement le navire du tissu environnant. Une fois la veine est parfaitement propre, positionner la pince sous le vaisseau et placer deux sutures 7-0 de 10 cm de chaque sous lui.
- Fermer la suture proximale à la tête par deux nœuds. Sur les autres sutures, préparer 1 noeud, mais ne le fermez pas.
- Maintenir le cathéter (0,28 mm diamètre intérieur, diamètre extérieur 0,61 mm) rempli d’une solution saline stérile à 37 ° C avec une pince d’une main ; alors qu’avec l’autre main, faire une petite incision dans le vaisseau avec une paire de ciseaux fine ou une aiguille courbe de 26 G. Ensuite insérer le cathéter dans la veine jugulaire et fermer le noeud deux fois. Fermer la suture proximale à la tête sur le cathéter afin d’assurer l’immobilisation complète.
- Pour isoler et préparer les artères carotides, disséquer la superficie de la trachée avec une pincette courbée fine.
- Une fois les carotides sont libres des tissus environnants, enlever le nerf de vagus (qui ressemble à une ligne blanche adjacente à la carotide) du navire (mais ne pas couper). La pince fine peut être fermée et ouvert lentement afin de mobiliser doucement le nerf.
- Une fois que les deux artères sont complètement propres, placer la pince sous la première artère carotide et placer un petit noir 3 mm large x 2,5 cm longueur morceau de plastique sous le bateau. Il est très important de ne pas grever le navire et pour vérifier que le flux sanguin est présent une fois que le titulaire du navire est placé. Placez le deuxième artère au-dessus du support à bateau. Si la souris ne se trouve pas directement sous le microscope, remettre en place les glandes sur la trachée et appliquer une solution saline stérile à 37 ° C pour éviter le dessèchement de la zone.
4. Evaluation de laminage et d’adhérence des leucocytes / LysM + cellules avec IVM
- Préparer l’acridine orange d’une solution mère de 2 mg/mL, conservée à-20 ° C et le diluer 1 / 4 dans du sérum physiologique stérile (concentration finale de 0,5 mg/mL) dans une seringue de 1 mL.
- Tester des conditions différentes : (1) Injection de l’acridine orange avec le cathéter jugulaire ; (2) injection de l’acridine orange directement dans la veine latérale de queue (avec cette condition que sans cathéter Jugulaire a été implanté) ; (3) mesure sans souris l’acridine orange en utilisant la fluorescence LysMCre++ d’IRG (là encore sans cathéter Jugulaire a été implanté).
Résultats
Carotides LysMCre++ d’IRG souris imprégnés AngII ont été constatées à l’aide de IVM. L’acridine orange a été injecté à l’aide d’un cathéter jugulaire. L’étude visait à examiner la proportion de cellules LysM+ au contact de la paroi vasculaire par rapport à toutes les cellules nucléées de circulation (qui pourraient également interagir avec le navire puisque la discrimination du type interagissant avec le navire est resté ouvert question de nos travaux antérieurs). Au départ, la présence d’un cathéter Jugulaire provoque l’adhérence des cellules LysM+ (Figure 2 a, D). Après l’injection de l’acridine orange, les mêmes cellules fluorescentes, mais aussi les cellules endothéliales étaient fluorescents (Figure 2 b, E). Après que la réduction de l’arrière-plan pour limiter endothéliale liée à fluorescence, les données indiquent que presque toutes les cellules adhérentes sont LysM+ (Figure 2, F) ; Ces résultats vrai après la perfusion de AngII confirmant nos résultats antérieurs et démontrant que le LysMCre++ d’IRG est un bon modèle pour observer l’effet de l’AngII sur l’activation des cellules LysM+ .
Nous avons évalué le rôle des voies d’administration de l’acridine orange sur l’activation des cellules après la perfusion de AngII dans LysMCre+IRG+LysM+ . Après une semaine d’infusion AngII, les interactions de l’endothélium de leucocytes dans les artères carotides de LysMCre++ d’IRG souris ont été imagées et visualisées par IVM avec ou sans injection d’acridine orange via un cathéter Jugulaire ou la veine caudale. Sans cathéter ou injection, laminage des cellules LysM+ a significativement augmenté après que infusion AngII par rapport aux souris non traitées et adhérence ont montré une augmentation (Figure 3). L’injection de l’acridine orange avec une adhérence de cathéter Jugulaire augmentée et roulant AngII traité des souris dans une plus large mesure par rapport aux souris sans un cathéter (Figure 3). L’injection de l’acridine orange dans la veine caudale mène à adhérence similaire et rouler par rapport aux souris n’ayant pas reçu d’injection de l’acridine orange (Figure 3).
La figure 1. Système de perfusion d’angiotensine II et d’évaluation de LysM+ des cellules de laminage et adhésion chez les souris. LysMCre++ d’IRG souris ont été infusées 7 jours avec AngII et adhérant ainsi que LysM+ de roulement sur les carotides, les cellules ont été quantifiées avec ou sans injection d’acridine orange via un cathéter Jugulaire ou par la veine caudale injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Évaluation de l’adhésion cellulaire LysM+ et rouler dans les artères carotides de LysMCre+souris IRG+ . Adhésion de LysM+ cellules LysMCre+souris IRG+ avant (A, D) et après (B, E) acridine injection via un cathéter jugulaire. Fluorescence rouge et vert ont été enregistrés, les cellules LysM+ (en vert) et les cellules musculaires lisses (en rouge) étaient visibles. Après l’injection de l’acridine orange, les cellules endothéliales sont également visibles en vert mais supprimant la fluorescence de fond permet circulant seule nucléées visualisation cellule (C, F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Évaluation des voies d’administration des colorants fluorescents en angiotensine II infusé LysMCre+souris IRG+ . Cellules de quantification de roulement (A) et en s’adonnant (B) LysM+ en trompe-l'œil exploité ou animaux AngII infusé et avec ou sans injection de l’acridine orange à l’aide d’un cathéter Jugulaire ou par injection dans la veine queue. Photos représentatives des conditions différentes (C). Les résultats sont moyenne ± écart-type de la moyenne. 2-way ANOVA a été réalisée et post hoc essai de Bonferroni, n = 3-12/groupes ; p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
LysM+ monocytes étaient déjà montrés à être impliquée dans le développement de l’hypertension5. Ici, nous montrons que les cellules immunitaires LysM+ roulent et adhèrent à la couche endothéliale en réponse à une perfusion AngII. Cette conclusion a été obtenue à l’aide de LysMCre++ d’IRG souris de nos études précédentes explorer le rôle des cellules immunitaires dans l’hypertension in vivo en visualisant des leucocytes avec injection de l’acridine orange6,10. Ainsi, la discrimination des types de cellules adhérant à l’endothélium n’a pas été possible.
IVM est un outil très utile pour les études vasculaires et observations de in vivo des cellules directement dans le système vasculaire, mais l’impact de l’injection de colorants à l’aide d’un cathéter inséré chirurgicalement dans le contexte inflammatoire de l’hypertension artérielle demeure inconnue. Pour évaluer l’effet potentiel du cathéter et de l’acridine orange injection nous avons profité de la LysMCre+souris IRG+ . Infusion d’AngII a augmenté le nombre de cellules LysM+ de roulement à l’endothélium. Insertion d’un cathéter dans la veine jugulaire amplifié l’effet et leucocytes plus roulants et des adhérents ont été détectés chez les souris infusé AngII instrumentés avec un cathéter par rapport à des souris sans cathéter implants. Cela indique que l’implantation d’un pose de cathéter carotide une réaction inflammatoire systémique dans le cadre de la cicatrisation qui recouvre avec la réaction immunitaire chez l’hypertension18. En outre, en raison de la proximité de la veine jugulaire et l’artère carotide une activation immunitaire supplémentaire seraient intervenues en agissant sur la veine jugulaire. Étant donné que cet effet n’était pas présent lorsque les injections ont été faites directement dans la veine caudale, on peut supposer que l’effet était due non pas à la teinture, mais à la procédure d’insertion du cathéter. Nous avons démontré ici l’importance des souris transgéniques journaliste exprimant des protéines fluorescentes ne pas gêner le processus de in vivo au cours de l’expérimentation. En outre, queue injection dans la veine des traceurs fluorescents peut être une alternative possible à des injections de cathéter jugulaire.
Une étape cruciale de la procédure est la perfusion AngII. Évaluation de Brassard de queue de la tension artérielle peut faire afin de contrôler l’efficacité de la livraison AngII par la pompe. La tension artérielle devrait augmenter après 2−3 jours de perfusion. Pour limiter l’inflammation qui pourrait influer sur activation de cellules LysM+ , fermeture de l’incision où la pompe est implantée il faut suturer au lieu de clips. Convient de noter une restriction sur l’injection dans la veine queue : pour faire l’acquisition de données possible meilleure, 4 vidéos sont généralement prises pour chaque carotide. Si le signal fluorescent diminue, 50 µL de l’acridine orange sont injectés mais avec injection de queue, il est plus difficile de faire plusieurs injections et de maintenir les carotides stable sous l’objectif de microscope. La durée de la présence d’un cathéter dans la veine jugulaire peut aussi moduler l’activation de cellules immunitaires puisqu’elle affecte l’activation de la coagulation dans le plasma riche en plaquettes préparé 4 h après l' implantation de cathéter19. Cet aspect de l’implantation du cathéter doit être enquête.
Enfin, même si nous apprécions l’impact de l’implantation de cathéter Jugulaire sur l’activation des cellules LysM+ après la perfusion de AngII, nous ne pouvons pas estimer pleinement le rôle de la préparation, enlèvement de la peau et l’isolation carotide sur une potentielle cellule LysM+ activation. Nous concluons que l’utilisation de souris journaliste fluorescence comme le LysMCre++ d’IRG souris est recommandée pour éviter toute perturbation de l’intégrité du navire lors de la préparation d’animaux pour l’imagerie in vivo .
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le ministère allemand pour l’éducation et de la recherche (BMBF 01EO1003 et 01EO1503 BMBF).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthésie mixte | |
| Medetomidine Pfizer | Deutschland GmbH | Anesthésie mixte | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthésie | |
| Alzane | Zoetis | Mélange antisedan | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Mélange antisedan | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schü ; lke | ||
| Pompes osmotiques | Alzet | 1007D | Implantation de pompe osmotique |
| Angiotensine II | Sigma-Aldrich | Implantation de pompe osmotique | |
| 7-0 suture prolène | Ethicon | Implantation de pompe osmotique | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Diamètre intérieur, 0,28 mm ; diamètre extérieur, 0,61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI Microscope | |
| Séparateur de faisceau | Photométrie | CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager | |
| Objectif | Olympus | UMPLFLN10X | Objectif à immersion dans l’eau avec monochromateur |
| Caméra | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Acquisition et analyse d’images logiciel | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Souris | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Souris | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
Références
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Réimpressions et autorisations
