Article de méthode

Une Time-lapse, sans étiquette et Quantitative Phase imagerie de cellules cancéreuses humaines dormantes et Active

DOI :

10.3791/57035

⸱

16 février 2018

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phénotypes de cellules dormantes et active du cancer ont été caractérisées à l’aide de l’imagerie quantitative phase. Essais sur la prolifération, la migration et la morphologie des cellules ont été intégrées et analysées dans une méthode simple.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’acquisition du phénotype angiogénique est une composante essentielle de l’évasion de la dormance de la tumeur. Bien que plusieurs essais classiques in vitro (p. ex., prolifération, migration, etc.) et in vivo des modèles ont été développés pour évaluer et caractériser des phénotypes cellulaires angiogénique et non-angiogénique, ces méthodes sont temps forte intensité de main d’oeuvre et nécessitent souvent des réactifs coûteux et les instruments, mais aussi une expertise appréciable. Dans une étude récente, nous avons utilisé une nouvelle phase quantitative (QPI) technique d’imagerie pour mener des caractérisations de Time-lapse et sans marquage de cellules de SDU ostéosarcome humain angiogénique et non-angiogénique. Un panneau des paramètres cellulaires, y compris la morphologie cellulaire, la prolifération et la motilité, ont été mesurés quantitativement et analysées à l’aide de QPI. Ce roman et l’approche quantitative offre la possibilité d’en permanence et de façon non invasive étudier les processus cellulaires pertinents, des comportements et des caractéristiques des cellules cancéreuses et autres types de cellules dans une façon simple et intégrée. Ce rapport décrit notre protocole expérimental, y compris la préparation de cellules, QPI acquisition et analyse des données.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un des premiers postes de contrôle dans le développement et la progression d’une tumeur solide est l’acquisition du phénotype angiogénique, une caractéristique du cancer. Cette progression implique une variété de processus biochimiques et moléculaires1,2,3. Un défi technique pour l’étude de cette étape clé dans la progression tumorale est le manque d’outils pour continuellement et quantitativement caractériser et différencier les phénotypes angiogénique et non-angiogénique des cellules de cancer vivent de manière impartiale. Les dosages traditionnels utilisés pour étudier les comportements cellulaires des cellules angiogéniques et non-angiogénique généralement nécessitent des instruments et des réactifs coûteux, par exemple, la prolifération et la migration des cellules dosages4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 ou complémentaires en vivo évaluations4,5,6,8,15,16, comme nécessitant une forte intensité et une expertise appréciable consommation de temps et du travail.

Récemment, la phase quantitative imaging (QPI) est apparu comme une nouvelle technique qui permet l’évaluation accélérée et sans étiquetage d’une variété de cellule morphologie et le comportement paramètres17,18,19, 20 , 21 , 22. Contrairement à la microscopie optique conventionnelle, QPI quantifie les variations de déphasage pixel par pixel après la lumière passe à travers un objet optique, puis reconstruit un testament olographe avec épaisseur optique converti et volume, permettant ainsi le direct analyse des cellules vivantes et les caractéristiques suivantes : (1) quantitative imagerie, imagerie (2) non invasive et Time-lapse, imagerie (3) l’étiquette-libre et l’imagerie multiparamétrique (4) simultanée. Ces caractéristiques font de QPI un outil puissant pour évaluer et comprendre les processus pathologiques au niveau cellulaire.

Dans une étude récente, nous avons utilisé le QPI pour quantitativement caractériser et différencier les angiogénique SDU-A et non-angiogénique SDU-N phénotypes des cellules d’ostéosarcome humain d’une manière systématique et quantitative, combinant l’analyse de la morphologie cellulaire, prolifération et23de la motilité. À l’aide de logiciels d’analyse image, un panneau de cellule morphologique et comportement paramètres ont été quantitativement comparées entre les cellules humaines ostéosarcome angiogénique et non-angiogénique et cinq différences caractéristiques ont été identifiées entre ces deux phénotypes. Cette approche novatrice fournit une plate-forme intégrée et quantitative pour évaluer une variété de caractéristiques cellulaires biologiquement pertinentes.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de biosécurité institutionnel du Boston Children Hospital.

1. préparation de la cellule

  1. Dégel SDU-A et cellules -N
    1. Milieu de culture, c'est-à-dired’échauffement Dulbecco Eagle milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal (vol/vol) (FBS) et 1 % (vol/vol) pénicilline/streptomycine modifié.
    2. Prélever les coupes cryogéniques de cellules dans le réservoir de l’azote liquide, plonger le fond du flacon dans l’eau chaude dans un bain-marie à 37 ° C et agitez doucement les coupes cryogéniques pour accélérer la décongélation. Gardez le couvercle des flacons cryogéniques de prendre contact avec l’eau pour éviter toute contamination. Dès que les cellules sont décongelés, stériliser le flacon cryogénique par pulvérisation de solution d’éthanol à 70 % et en essuyant le flacon.
    3. Dans une hotte à flux laminaire, aspirer immédiatement la suspension de cellules à partir du flacon cryogénique et Suspendez doucement en milieu de culture de 10 mL chauffé (décrit en 1.1.1). Centrifuger des suspensions de cellules à environ 200 g pendant 5-7 min.
    4. Resuspendre le culot cellulaire avec milieu de culture de 10 mL réchauffé et transvaser dans une fiole de T75. Pipetez doucement plusieurs fois de suspendre les cellules uniformément à l’aide d’une pipette 10 mL.
    5. Placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % (vol/vol) CO2 et atmosphère humidifiée. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 12 h.
    6. Incuber les cellules pendant environ 3 à 7 jours jusqu’au confluent de 80 à 100 %. Changer le milieu de culture tous les 2-3 jours.
  2. Fractionnement des SDU-A et cellules -N
    1. Retirez le support de culture du flacon.
    2. Laver les cellules avec 5 mL de PBS stérile (1 x) sans calcium et magnésium, pour enlever les cellules non adhérentes ou fraction.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % dans la fiole et agiter brièvement le ballon pour s’assurer que la trypsine-EDTA est dispersé uniformément.
    4. Incuber le flacon pour 2-3 min dans un incubateur à 37 ° C ou 3-5 min à température ambiante. Vérifier les cellules au microscope à un grossissement de x 400 environ pour s’assurer que les cellules sont arrondis et détachés.
    5. Une fois que les cellules sont individuelles, ajouter 10 mL de milieu de culture et Pipetez doucement le milieu de haut en bas plusieurs fois pour briser les agrégats de cellules en suspension monocellulaire à l’aide d’une pipette 10 mL.
    6. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. La suspension cellulaire des semences dans des fioles T75 nouvelles à une densité de 2 × 106 cellules soit un ratio de 1:4.
    7. Permettre aux cellules de croître jusqu'à 80-100 % confluence avant de semer pour l’expérience QPI.
  3. SDU-A l’ensemencement et cellules -N pour QPI
    1. Graine de rue-A et -N cellules dans 6 plats à la densité de 50 000-300 000 cellules/puits avec 5 mL de milieu de culture après avoir compté avec un compteur de cellules.
      Remarque : La densité de semis dépend le taux de prolifération cellulaire et la période de temps d’imagerie afin d’avoir < confluence de 100 % au cours de l’acquisition d’imagerie.
    2. Incuber les cellules pendant au moins 12 h permettre la fixation.
    3. Changer le milieu avec les supports neufs avant d’effectuer le QPI.

2. QPI Acquisition

  1. Lamelle couvre-objet mis en place
    1. Nettoyer la lamelle couvre-objet en rinçant plusieurs fois à l’eau désionisée et stériliser avec la solution d’éthanol 75 % par immersion pendant 15 min. mettre la lamelle couvre-objet dans une hotte stérile à flux laminaire pour sécher.
    2. Placez délicatement la lamelle couvre-objet sur une plaque de 6 puits pour éviter les bulles d’évidents. Veiller à ce que la partie inférieure de la lamelle couvre-objet est immergée dans les milieux de culture (minimum 5 mL/puits).
    3. Placer la plaque dans l’incubateur (37 ° C, 5 % CO2et atmosphère humidifiée) s’équilibrer pendant au moins 15 min. Si le brouillard se forme sur la lamelle couvre-objet, utilisez un coton-tige stériles pour essuyer.
  2. L’imagerie de cellules au microscope
    1. Ouvrez le logiciel pour initialiser le système, y compris auto-étalonnage des temps d’exposition, contraste de motif et le bruit de l’hologramme. Assurez-vous que les valeurs sont acceptables (illustrée dans la plage verte ou jaune).
    2. Placez la plaque de 6 puits sur la scène du microscope QPI.
    3. Cliquez sur « Live Capture » et sélectionnez « Manuel » dans « Focus logiciel. » Grossièrement mettre les images de phase de cellules en réglant la distance de travail en « Configuration de Microscope » pour obtenir des contours pour les cellules dans les images de phase. Remplacez « Automatique » dans « Focus logiciel. »
    4. Cliquez sur « Nouvelle expérience » pour créer une nouvelle expérience. Commencez par le choix des postes d’acquisition image à l’aide de la souris ou les touches de direction sur le pavé numérique. Cliquez sur « Mémoriser » après chaque sélection. Normalement 3-5 emplacements pour chaque échantillon sont sélectionnés.
    5. Configurer les intervalles d’imagerie et de la période de temps dans la section « Timelapse ».
      Remarque : Pour suivre clairement les cellules cancéreuses, les intervalles doivent être plus courtes que 5 min. 48 heures est défini comme la période de temps pour la combinaison analyse QPI.
    6. Lancer le test en cliquant sur « Capture », qui portera automatiquement et acquérir les images dans les points de temps de réglage.

3. analyse des données

  1. Analyse de la morphologie cellulaire
    1. Cliquez sur « Identifier les cellules ». Ajustez le réglage numérique pour « Seuil de fond » afin que les cellules sont séparées bien du bruit de fond. Ajuster le nombre de paramètre pour « Taille de l’objet » pour s’assurer que chaque cellule possède un noyau. Maintenir les paramètres compatibles pour les échantillons qui doivent être comparées, car ceux-ci peuvent affecter les mesures finales de surface et volume. Modifier manuellement les segments de la cellule à l’aide de « Modifications manuelles, » si nécessaire.
    2. Utilisez la fonction « Analyser les données » dans le logiciel afin d’analyser les cellules. Lancez une nouvelle analyse de données en cliquant sur « New analysis. » Faites glisser les images sélectionnées dans les paramètres « Images sources » onglet et cellule morphologie dont la zone de cellule (µm2), l’épaisseur optique (µm) et volume (µm3) pour chaque cellule. Choisissez un scatter plot ou histogramme mode et exportation données comme des tableaux ou figures.
  2. Analyse de prolifération cellulaire
    1. Sélectionnez au moins 5 images pour les différents moments d’intérêt (par exemple, initial, 12 h, 24h, 36 h et 48 h). Nombre de cellules record qui est fournis par le logiciel.
    2. Pour estimer le temps de doublement, tracer le nombre de cellules après la normalisation avec les nombres premiers et s’adapter aux courbes de croissance exponentielle.
  3. Analyse du mouvement cellulaire
    1. Utilisez la fonction « Suivi des cellules » dans le logiciel. Cliquez sur « Nouvelle analyse » pour commencer une nouvelle analyse de données. Série de glisser des images pour une période de temps sélectionnée (par exemple, 4 h après 24 h d’incubation) dans l’onglet « Images sources » choisir au hasard 10-30 cellules en cliquant sur cellules sous le mode de sélection « Ajouter des cellules ». Exclure les cellules sur les bords et ceux qui se déplacent hors du champ de vision.
    2. Vérifiez attentivement le suivi dans la série d’images. Dans le cas où le système perd la trace d’une cellule ou des pistes de la mauvaise cellule, ajuster manuellement la cellule de suivi en cliquant sur « Identifier » pour identifier les cellules ou en cliquant sur « Modifier emplacement » sous le mode « Select » pour modifier l’emplacement de la cellule.
    3. Choisissez rose intrigue des trajectoires de cellule en « Mouvement de terrain » ou terrain pour les autres paramètres liés au mouvement dans « Caractéristiques de la parcelle, » tels que la vitesse de motilité (µm/h), la motilité (µm), migration (µm) et franchise de migration. Exporter des données sous les tables ou les figures.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 1 illustre une caractérisation de la morphologie cellulaire typique. Les images sont présentées comme des hologrammes (Figure 1 a-B) et des images 2D (Figure 1-D). Épaisseurs de cellules optiques (calculées à partir de l’indice de réfraction et de la longueur du trajet optique) sont quantifiés par profil de ligne ou d’une mesure de cellules entières. Des intrigues de la surface et l’épaisseur de la rue-A et cellules de SDU-N mesurée pour une cellule entière ont été tracées, comme Figure 1E-G, où ces deux phénotypes affichent différentes distributions. Les nombres moyens de l’histogramme (Figure 1 H-M) ou les fichiers exportés a démontré que les cellules de SDU-A avoir des zones de cellules plus petites et une plus grande épaisseur que les cellules SDU-N.

À l’aide de la fonction compteur de cellules, les profils de prolifération cellulaire ont été obtenus (Figure 2). Ceux-ci n’ont pas montré une différence significative entre la rue-A et cellules -N. En outre, le temps de doublement cellulaire peut être estimé à partir de la courbe de prolifération (c.-à-d., 24-26 h), qui n’ont pas démontré des différences significatives.

Figure 3 a -D montre la localisation typique des SDU-A et -N cellules non directionnel (aléatoire) motion mode et les trajectoires correspondants. La motilité cellulaire moyen (Figure 3E-F), vitesse de motilité ()Figure 3-H), distance de migration ()Figure 3I-J)et la franchise de migration ()Figure 3 K-L) ont été tracées par rapport à la durée d’enregistrement. Par rapport aux cellules SDU-N, SDU-A cellules ont montré une plus grande vitesse de motilité, aboutissant à plus longue distance de motilité et de la migration.

figure-results-1
Figure 1 : caractérisation de la morphologie de la cellule. (A-B) Des hologrammes représentant des cellules de (A) et -N de le SDU-A (B) par quantitative phase d’imagerie. Barre d’échelle est que 191,4 EISN µm. dans le coin en bas à droite montrent le profil de ligne quantitative d’épaisseur optique pour la ligne bleue tracée dans les images. (C-D) Images représentant QPI de segmentation de la cellule pour les cellules (C) et -N SDU-A (D). Barre d’échelle est de que 100 µm. les cellules sur les bords ont été exclus pour la quantification. (E-G) Épaisseur mesurée par rapport à la zone pour les cellules individuelles des cellules de (E) et -N SDU-A (F). Chaque point représente une cellule individuelle (n = 200-300). L’intrigue de chevauchement (G) montre des modèles de dispersion différente pour SDU-A et cellules -N. (H-M) Histogrammes de l’épaisseur de la cellule (H-je), les cellules de surface (J-K)et volume (L-M) distribution pour SDU-A (H, J, L) et -N (I, K, M). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : caractérisation de la prolifération de cellules. Le panneau supérieur montre segmentation cellulaire représentatif pour compter le nombre de cellules. Barre d’échelle est de 100 µm. Le panneau du bas montre le taux de prolifération de cellule calculée correspondant. Données se présente comme la moyenne ± écart-type. Test de t de Student (non apparié, à deux points) a été utilisé pour des analyses statistiques. Résultats des tests ont été considérés comme significatifs lorsque p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : caractérisation du mouvement de la cellule. (A-B) Suivi de la cellule représentant images pour SDU-A (A) et -N (B) des cellules. Barre d’échelle est de 100 µm. les cellules sélectionnées sont présentés avec des couleurs différentes. Motilité cellulaire enregistrée en un 4 h période est présentée avec la ligne de couleur correspondante. (C-D) Trajectoires cellulaire des cellules de (D) (C) et -N SDU-A tracée entre le point d’origine (0,0). Chaque ligne représente une cellule individuelle. SDU-A cellules montrent une configuration plus dispersée, comparée aux cellules SDU-N (n = 10). (E-L) Enregistre les paramètres quantitatifs durant la période étudiée pour le mouvement de la cellule de SDU-A (E, G, I, K) motilité (E-F), vitesse de motilité (G-H), la distance de migration (I-J - N (F, H, J, L) cellules, y compris de la cellule )et la franchise de migration (K-L). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous décrivons une in vitro, non invasif et sans étiquette de méthode à l’aide de QPI pour caractériser quantitativement les phénotypes angiogénique et non-angiogénique des cellules humaines ostéosarcome. Plusieurs paramètres cellulaires ont été analysés en même temps par cette méthode intégrée, haut débit, y compris le taux de prolifération, en doublant le temps, la franchise de migration, vitesse de motilité, migration et motilité, volume cellulaire, épaisseur de la cellule, zone de cellule.

En comparaison avec les tests classiques qui permettent d’évaluer la morphologie cellulaire et les comportements de la cellule, cette méthode non seulement gagner du temps et main de œuvre, mais fournit également des informations plus précises et détaillées. Par exemple, l’emplacement du système QPI (à l’intérieur de l’incubateur de cellules) permet de réduire les perturbations causées par des changements environnementaux tels que photographier dans un milieu ambiant (température ambiante et atmosphère)23. En outre, cellule optique à épaisseur et volume, converti à partir de déphasage, pourraient être obtenus avec QPI, alors que la seule zone de cellule est mesuré par le procédé d’imagerie de cellules traditionnelles. Cette fonctionnalité de QPI génère l’information plus détaillée pour des comparaisons quantitatives des phénotypes cellulaires différentes.

Densité de semis appropriée des cellules d’intérêt est essentielle dans la méthode actuelle. Pendant la phase d’acquisition d’imagerie, les cellules sont censés être inférieure à une monocouche confluente en raison de la limitation de cette technique QPI cohérente qu’imaging acquisition ne peut être effectuée avec panneau d’un foyer, qui risquent de perdre des informations partielles dans la z direction (par exemple, les cellules superposées). En outre, la caractérisation à l’aide de QPI est limitée au format 2D, qui n’est pas optimal pour l’invasion des cellules dans la direction z dans la matrice extracellulaire. Plusieurs focales prédéfinis sont nécessaires pour le futur développement de méthodologie QPI.

En plus de comptage de cellules, imagerie QPI fournit également des images instructives pour l’étude de la mitose cellulaire sans supplémentaires étiquetage21,23,24. Tandis que la division cellulaire a été reconnue facilement par la diminution évidente dans la surface de la cellule et volume, pouvoir objectivement et quantitativement définir et différencier les étapes du cycle de la cellule pour les cellules individuelles doit encore être établie. Cette capacité serait considérablement faciliter la recherche en ce qui concerne l’analyse de cellules pour la différenciation des cellules souches, la réaction aux médicaments et arrêt du cycle cellulaire.

En raison de l’avantage d’être quantitative, sans étiquette et facile à utiliser, cette méthode peut aussi ont des applications cliniques utiles25,26,27,28,29,30 . Par exemple, ce système pourrait servir à la caractérisation de populations de cellules hétérogènes, y compris les cellules dormantes et actives dans les tumeurs humaines. Les différences morphologiques et comportementales de cellule caractérisée entre cellules cancéreuses dormantes et actif peuvent être potentiellement utilisés pour décrypter les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la dormance tumorale dans les cancers humains.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le soutien de la Breast Cancer Research Foundation et l’Advanced Medical Research Foundation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fiole T75Corning, NY, États-Unis353136
plaques à 6 puits.Corning, NY, États-Unis3506
Dulbecco' s milieu Eagle modifié (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, États-Unis11965092
Sérum fœtal bovin (FBS)  ;Atlanta Biologicals, GA, États-UnisS11550
Pénicilline StreptomycineThermo Fisher Scientific, MA, États-Unis15140122
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, États-Unis10010023
Compteur Beckman Z1 CoulterBeckman Coulter, IN, États-UnisZ1  ;
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenMicroscope M4
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenHStudioM4Software

Références

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Time lapse ImagingCell Morphology AnalysisProliferation Rate MeasurementMotility Speed TrackingAngiogenic Phenotype CharacterizationNon angiogenic Phenotype CharacterizationHuman Osteosarcoma CellsLabel free ImagingCancer Cell Dormancy

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