Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Résumé

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Résumé

Les îlots pancréatiques, également appelés les îlots de Langerhans, sont un groupe de cellules endocriniennes qui produit des hormones pour la régulation du glucose et d'autres fonctions biologiques importantes. Les îlots se composent principalement de cinq types de cellules sécrétrices d'hormones : les cellules sécrètent le glucagon, les cellules sécrètent l'insuline, les cellules sécrètent la somatostatine, les cellules sécrètent la ghréline et les cellules PP sécrètent du polypeptide pancréatique. Soixante à 80 % des cellules des îlots sont des cellules d'A, qui sont la population cellulaire la plus importante pour étudier la sécrétion d'insuline. Les îlots pancréatiques sont un système modèle crucial pour étudier la sécrétion d'insuline ex vivo. L'acquisition d'îlots de haute qualité est d'une grande importance pour la recherche sur le diabète. La plupart des procédures d'isolement d'înet exigent techniquement difficile d'accéder au site de l'injection de collagène, des procédures dures et complexes de digestion, et des étapes multiples de purification de gradient de densité. Cet article comporte une méthode simple d'isolement d'îlet de souris à haut rendement avec des descriptions détaillées et des démonstrations réalistes, montrant les étapes spécifiques suivantes : 1) injection de collagène P à l'ampulla de Vater, une petite zone joignant le conduit pancréatique et le canal biliaire commun, 2) la digestion enzymatique et la séparation mécanique du pancréas exocrine, et 3) une seule étape de purification de gradient. Les avantages de cette méthode sont l'injection d'enzyme digestive en utilisant l'ampulla plus accessible de Vater, une digestion plus complète en utilisant la combinaison d'approches enzymatiques et mécaniques, et une étape de purification de gradient unique plus simple. Ce protocole produit environ 250 à 350 îlots par souris; et les îlots conviennent à diverses études ex vivo. Les mises en garde possibles de cette procédure sont des îlots potentiellement endommagés en raison de la digestion enzymatique et/ou de l'incubation prolongée de gradient, qui peuvent toutes être en grande partie évitées par la justification d'annonces soigneuses du temps d'incubation.

Introduction

Il y a deux méthodes communes dans la littérature pour l'isolement pancréatique d'îcle. Il faut l'exciser le pancréas et le découper en petits morceaux à l'aide de ciseaux chirurgicaux, puis le digérer dans une solution de collagène^1,2,3. Une autre méthode plus précise est d'utiliser le réseau de conduits présents dans le pancréas pour introduire l'enzyme digestive. Les sites suivants ont été utilisés pour l'injection d'enzymes digestives: la jonction de la bile et le conduit cystique, la vésicule biliaire dans le canal biliaire commun, ou le canal biliaire commun lui-même

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux (ACUC) de l'Université Texas A et M. Les outils chirurgicaux nécessaires sont indiqués à la figure 1 et le diagramme schématique de la procédure est indiqué dans la figure 2.

1. Solutions

1. Préparer la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) en ajoutant 100 ml de 10X HBSS (à partir du stock) à 900 ml d'eau distillée pour faire 1 L HBSS (1X).
2. Préparer la solution STOP (doit être fraîche et doit être utilisée dans un délai de 1 h) en ajoutant 50 ml de sérum b....

Résultats

L'achèvement approprié de cette procédure exige une certaine compréhension de l'anatomie de la souris dans la cavité abdominale. Cela permet d'identifier correctement l'ampulla de Vater et le serrage du canal biliaire commun. L'ensemble de la procédure prend normalement 1/2 h. Il est plus efficace d'isoler les îlots de 4 à 6 souris en même temps, de sorte que plusieurs échantillons peuvent être centrifuges ensemble. Le temps de la cueillette des îlots varie en fonction du nombre d'îlots et de l'efficacité de la digestion.......

Discussion

Ce protocole comprend la perfusion et la digestion du collagène, suivie s'il y a purification des îlots. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'injection efficace et la perfusion complète du pancréas^1,4,7. La méthode d'administration de ce protocole permet à l'enzyme de traverser les voies anatomiques pour mieux digérer le tissu exocrine entourant les îlots¹. En outre, cette technique est bi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 3 mL	BD	309657	Hoding de la collagénase P
Pince de protection	VWR	82027-396	Maintien de la peau de la souris pour faciliter la procédure d’incision
Pince incurvée	Sigma-Aldrich	Z168696	Maintien des tissus pendant l’ablation du pancréas
Isoflurane	Piramal	B13B16A	Pour anesthésier les souris avant une intervention chirurgicale
Boîtes de Pétri de 100 mm	VWR	30-2041	Utilisé pour la culture d’îlots de Langerhans
30 G. ½ ; aiguille	BD	305106	Pour la pénétration de l’ampoule de la cuve pour délivrer de la collagénase P - cette jauge est utilisée car elle s’adapte bien à la plupart des CBD Tube de
50 ml	VWR	89039-658	Contenant du tissu pancréatique digéré, de la collagénase P et des îlots purifiés
Coussinets absorbants avec barrière contre l’humidité imperméable	VWR	82020-845	Pour absorber le sang des procédés syriques
Centrifugeuse 5810R avec godet pivotant et capacité de décélération	Eppendorf	5811FJ478114	Utilisation pour les tissus en granulation, la pastille est formée au fond du tube conique - une centrifugeuse à godet pivotant est nécessaire. La fonction de décélération est également importante pour former les couches de dégradé.
Collagénase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	Pour la digestion du pancréas exocrine
Ciseaux chirurgicaux incurvés	Fisher-Scientific	13-804-21	Pour couper l’abdomen ouvert de souris
Microscope de dissection	Olympus	SZX16	Utilisé pour l’identification des structures anatomiques clés afin d’administrer avec précision la collagénase dans le pancréas
saline équilibrée de Hank 10x	Corning	20-023-CV	Cellules de lavage
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	Pour la formation de gradients
Source lumineuse	Leeds	LR92240	Amélioration de la visibilité du microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	Pour l’élimination de la RNase
RPMI-1640 Média sans L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Îlots de culture
Schwartz micro serrefines (Pince microvasculaire)	Outils de sciences fines	18052-01	Clampage du canal cholédoque et de l’artère hépatique
Bain d’eau agité	Boekel/Grant	8R0534008	Important pour la digestion mécanique du tissu exocrine
Petits ciseaux chirurgicaux	VWR	82027-578	Tissu de drainage qui s’attache au pancréas