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Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

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DOI :

10.3791/57052

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14 février 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.

Résumé

Ici, une nouvelle technique appelée Tetrotoxin (TTX) Engineered résistance des Synapses à sonder (TERPS) est appliquée pour tester la monosynaptiques connexions entre les neurones de la cible. La méthode s’appuie sur la co-expression d’un activateur transgénique avec canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac, dans un neurone présynaptique spécifique. Connexions avec les partenaires post-synaptiques putatifs sont déterminées par cellule entière enregistrements en présence de TTX, qui bloque l’activité électrique dans les neurones qui n’expriment pas de NaChBac. Cette approche peut être modifiée pour fonctionner avec un activateur ou imagerie calcique comme journaliste de connexions. TERPS ajoute à l’ensemble croissant des outils disponibles pour déterminer la connectivité au sein des réseaux. Cependant, les TERPS est unique en ce qu’elle rapporte aussi fiable en masse ou volume et transmission de débordement.

Introduction

Un objectif majeur des neurosciences consiste à mapper les connexions entre les neurones pour comprendre comment l’information circule à travers des circuits. Nombreuses approches et les ressources sont devenues disponibles pour tester la connectivité fonctionnelle entre les neurones dans une gamme de systèmes de modèle1,2. Pour générer les schémas de câblage plus précis à l’aide d’électrophysiologie, il est important de résoudre si connexions observées entre deux cellules sont directs et monosynaptique versus indirecte et polysynaptiques. Un étalon-or pour faire cette distinction dans les neurones chez les mammifères est de mesurer la latence entre unique action potentials dans les cellules présynaptiques et l’apparition de courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) dans le deuxième neurone. Connexions monosynaptiques devraient avoir courts temps de latence de quelques millisecondes et faible variabilité3. Cette approche peut être compliquée dans les neurones d’invertébrés comme les synapses peuvent être chez leurs dendrites loin du site d’enregistrement somatique, provoquant des retards dans la détection en raison des distances longues électrotonique entre conductances postsynaptiques et l’enregistrement électrode. Ces retards peuvent introduire des ambiguïté concernant poly-par rapport aux cotisations monosynaptiques. En outre, petits événements synaptiques peut se désintégrer avant d’atteindre le site d’enregistrements somatique et conduire plus forte activité présynaptique, est susceptibles de recruter des événements polysynaptiques.

Diverses techniques ont été développés pour tester les connexions monosynaptiques chez les invertébrés. Une approche utilise des solutions de haute cation divalent (Hi-Di) contenant des excès de Mg++ et Ca++. Cette solution bloque les connexions polysynaptiques par probabilité de libération réductrice et croissant seuil de potentiel d’action pour favoriser la détection de monosynaptique entrée4,5. Déterminer le rapport précis entre la Mg++ ca++ nécessaire, cependant, n’est pas trivial et polysynaptiques contributions peuvent persister pendant une stimulation même modeste6. Une approche alternative appelée Reconstitution GFP entre partenaires synaptiques (GRASP) profite de la proximité entre les membranes préalables et postsynaptiques trouvé au niveau des synapses d’inférer une connexion monosynaptique 7. Ici, une composante de la protéine fluorescente verte (GFP) s’exprime dans un neurone, et le fragment complémentaire de la molécule est exprimé dans un partenaire postsynaptique putatif. La présence de fluorescence indique que les deux neurones sont très suffisamment proches pour permettre la reconstitution de la molécule GFP et implique l’existence d’une synapse. GRASP peut signaler les synapses faussement, cependant, si deux cellules ont étroitement accolées des membranes, comme dans un nerf ou fascicules. Variantes du GRASP éliminent ces faux positifs en attachant le fragment présynaptique de GFP directement à synaptobrévine, permettant ainsi la reconstitution qu’au synapses actives8. Tandis que le GRASP et ses variantes ont grandement contribués à établir la connectivité fonctionnelle chez la drosophile CNS, certaines connexions ne peuvent pas rendues visibles par emprise si les distances entre les partenaires de pré- et post-synaptiques est relativement importante. Ceci est particulièrement pertinent dans l’évaluation de la transmission de volume associée à la neuromodulation9 ou de l’inhibition GABAergique10.

Ici, une technique nouvelle et complémentaire est démontrée pour tester les connexions directes de monosynaptiques chez la drosophile CNS. Cette méthode, appelée tétrodotoxine Engineered résistance pour sonder Synapses (TERPS), fonctionne par la co-expression de la tétrodotoxine (TTX)-canal sodique résistant, NaChBac et un activateur d’optogenetic dans une cellule présynaptique pendant l’enregistrement de putatif partenaires postsynaptique9. En présence de TTX, toute l’activité induite par le potentiel d’action est supprimée dans les cellules autres que celles exprimant NaChBac. Le canal de NaChBac restaure sélectivement excitabilité dans les cellules présynaptiques ciblées, permettant la transmission synaptique évoquée par la lumière. Cette méthode permet de forte activation des neurones présynaptiques, telles que les connexions peuvent être résolues postsynaptique par somatique enregistrement tout en réduisant la probabilité de recrutement circuits polysynaptiques. Ce qui est important, cette technique permet l’étude de la transmission de volume et révèle la propagation du transmetteur libéré d’un neurone unique tout au long d’un circuit. En outre, les TERPS peut révéler la nature chimique de la connexion par le biais de pharmacologie traditionnelle. TERPS est adapté pour une utilisation dans n’importe quel système de modèle qui permet l’expression transgénique des canaux de sodium insensibles à la TTX.

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Protocole

1. préparer les mouches et identifier GAL4 promoteur lignes

  1. Sélectionnez une ligne de promoteur de GAL4 et traversez-la avec mouches transporter le transgène SAMU-NaChBac et un transgène d’optogenetic pour l’activation.
    Remarque : SAMU-CsChrimson11 est sélectionné en raison de sa conductivité élevée et la facilité avec laquelle il active les potentiels d’action induite par le NaChBac. Les SAMU-NaChBac et SAMU-CsChrimson sont disponibles depuis le référentiel de Stocks de Bloomington.
  2. Préparer le rétinal all-trans comme une solution dans l’éthanol (35 mM) et de conserver la solution dans le congélateur à-20 ° C.
  3. Mix 28 µL de ce stock dans environ 5 mL de pomme de terre réhydraté nourriture de flocon et ajouter ce mélange à la partie supérieure d’un flacon de milieu conventionnel de drosophile .
  4. Augmenter les mouches adultes exprimant le csChrimson de l’alimentation humaine contenant 0,2 mM tout-trans-rétinal pour 1 à 3 jours,11.

2. préparer le Stock TTX

  1. Créer une solution de 1 mM TTX dans l’eau distillée ou désionisée. Conserver cette solution dans un réfrigérateur de laboratoire pendant plusieurs mois. Vérifiez les politiques des institutions concernant le stockage de TTX comme classent les nombreuses institutions TTX comme une substance dangereuse ou contrôlée.

3. préparer les mouches pour l’électrophysiologie

  1. Recueillir des jour 1 – 3 mouches adultes vieux qui sont déclenchés sur la nourriture avec all-trans-rétinal.
    Remarque : Reportez-vous à Murthy et Turner en 2013 pour une description détaillée du patch serrage Drosophila neurones12,13.
  2. Mettre les mouches dans un flacon en verre de scintillation. Placer le flacon sur la glace pendant 1 min immobiliser les mouches.
  3. Grosses pinces permet d’insérer une mouche dans une chambre d’enregistrement sur mesure. La chambre se compose d’un 3 ½" cercle découpées au laser de 1/16" en acrylique. Découpez un trou de ¾" est dans le centre où il est attachée une feuille personnalisée avec 2 parties époxy. La grille contient une triangulaire en forme d’espoir que la mouche est insérée dans.
  4. Appliquer une cire ou époxy durcissable UV autour de l’animal pour le fixer solidement au sein de la chambre d’enregistrement.
  5. Illuminer la préparation avec une fibre optique à col de cygne pour la visualisation sous un stéréomicroscope. Réglez les fibres du col de cygne pour éclairage oblique en ajustant leur afin qu’ils illuminent la volée directement sur le côté.
  6. Ajuster le niveau de luminosité plus faible réglage possible qui permet encore une visualisation claire de la mouche. Cette intensité lumineuse varieront d’expériences individuelles.
    Remarque : Ce protocole peut être adapté à l’aide d’un in situ cerveau explantation méthode14.
  7. Récupérer un enregistrement externe saline. La solution saline contient en mM : 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxyméthyl) l’acide méthyl-2-aminoéthanethiol-sulfonique, tréhalose 8, glucose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2et 4 MgCl2 (270-275 mΩ ajustée). La solution saline est propagée avec 95 % O25 % CO2 (carbogen) et a un pH ajusté à 7,315.
  8. Recouvrir la préparation mouche de 4 à 6 gouttes de solution saline enregistrement extracellulaire. À ce stade, augmenter le niveau de lumière au microscope la dissection pour une meilleure visibilité.
  9. Aiguiser un fil de tungstène par électrolyse. Pour rendre le fil, préparer une solution saturée de KNO3 et appliquer environ 20 volts de courant tout en trempant l’extrémité du fil dans la solution 20 fois pour chaque 100 ms jusqu'à ce que la pointe est aiguisée. Utilisez le fil de tungstène affûté pour supprimer la cuticule sur la tête de la mouche et exposant ainsi le cerveau.
  10. Exposer davantage le cerveau en supprimant la trachée et les corps gras qui l’entourent. Si accédant les lobes antennaires, utiliser un fil de tungstène courbé ou un outil similaire pour rentrer doucement antennes sous la feuille d’enregistrement chambre pour augmenter la visibilité. Forte pince permet d’arracher délicatement l’enveloppe gliale couvrant la zone d’intérêt où les enregistrements seront fera.
  11. Transfert de la chambre d’enregistrement au banc d’essai électrophysiologie. Immédiatement le début de perfusion avec du sérum physiologique enregistrement externe barboter avec carbogen pour préserver le cerveau. Le réservoir de solution saline est placé au-dessus de la platine du microscope et est alimenté par gravité à la préparation. Utiliser une ligne vide et une fiole d’Erlenmeyer de 2 L pour recueillir la déchets saline.

4. obtention de l’enregistrement de la cellule entière

  1. Tirer les pipettes de patch sur un extracteur de pipette commerciale. Consulter le manuel des paramètres atteindre une pipette appropriée avec une résistance à la pointe près de 7 mΩ.
  2. Ajouter 4 µL de solution d’enregistrement interne dans une pipette de patch. La solution saline interne se compose de 140 aspartate de potassium, 10 HEPES, MgATP 4, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA et 1 KCl en mM.
  3. Mis en place l’amplificateur pince patch pour l’enregistrement de la cellule entière. Zéro de décalage de l’amplificateur et configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai. Ici, un amplificateur de pince AM systèmes Patch 2 400 est utilisé.
  4. Appliquez une pression positive par le biais de la pipette et approche de la cellule. Utilisez un micromanipulateur pour diriger la pipette et contacter la cellule. Relâcher la pression positive. Ensemble le potentiel de maintien de la membrane à -60 mV. La pipette doit former un joint de gigaohm avec la membrane de la cellule comme en témoigne une basse sub-picoamp tenant actuel.
    NOTE : Si à l’aide de GFP guidé ciblant les cellules, essayer de minimiser l’utilisation de la lumière épifluorescente prévient-on ChR2 activation et potentielle synaptique dépression. Aussi, attendez quelques minutes avant d’appliquer l’étape 5.
  5. Configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai de -50 mV à -60 mV. Ce paramètre est standard sur les amplificateurs de patch clamp. Impulsions de test révélera un grand transitoire capacitif qui représente le courant nécessaire pour recharger la pipette. Enlever capacitif transitoires en ajustant les boutons de compensation de capacité sur l’AM 2400 ou amplificateur similaire.
  6. Appliquer de brèves impulsions de pression négative pour rupture de la membrane cellulaire et obtenir la configuration cellule entière.
    Remarque : Une configuration cellule entière est observée lorsqu’il y a une forte augmentation dans les transitoires capacitif montrant la capacitance du neurone. Une légère augmentation de l’exploitation actuelle (de base) sans doute aussi on remarquera. Régler l’amplificateur à l’actuel mode de pince et potentiel de la cellule de -50 à -60 mV.

5. Testez la connectivité synaptique

  1. Configurer le système d’acquisition (DAQ) de données pour déclencher un pilote de LED pour générer des impulsions de lumière. Ici, un système DAQ de National Instruments est utilisé avec Matlab pour fournir un signal analogique à un conducteur de LED. L’intensité des LED est réglée via le signal analogique pour le conducteur. La LED est 620-630 nm longueur d’onde LED.
  2. Positionner la haute puissance LED rouge directement sous la préparation. Régler l’intensité lumineuse afin que 0,238 mW/mm2 atteigne la volée.
  3. Activer les neurones présynaptiques pendant l’enregistrement de la cellule postsynaptique d’intérêt. Atteindre la cellule d’activation optogenetically, pharmacogentically, ou par l’intermédiaire de la stimulation nerveuse. Ici, csChrimson et brèves impulsions de lumière rouge sont appliquées.
    NOTE : Les connexions synaptiques peuvent être surveillées en pince ampèremétrique comme EPSPs ou bride de tension comme EPSCs. Une connexion synaptique devrait être visible avant d’appliquer le TTX en réponse à une impulsion lumineuse de 40 ms. Si aucune connexion n’est observée, il est peu probable que les neurones sont synapses connectés soit mono - ou polysynaptically. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur des connexions excitatrices ou inhibitrices en conséquence.
  4. Si une connexion est observée dans un soluté physiologique, TTX s’ajoute le système de perfusion pour obtenir une concentration finale de 1 µM. utiliser une pompe de recirculation pour capturer et réutiliser la solution saline pour conserver la TTX. La pompe péristaltique va tirer la solution saline de la baignoire et remettez-le dans le réservoir de solution salin.
  5. Ajuster la vitesse de la pompe pour fournir un vide constant fort qui ne permet pas à ce niveau de sérum physiologique dans le bain pour montent et descendent.
    Remarque : L’application de TTX devrait entraîner la cessation de l’activité dans le neurone qui est surveillé à germes entiers de fortification. Cela confirme qu’assez TTX a été ajouté à la solution saline.
  6. Appliquez de nouveau brèves impulsions de lumière rouge (40 ms pour chaque impulsion). À ce stade, toute connexion synaptique qui reste est probablement monosynaptiques. Ajouter antagonistes pharmacologiques à la saline de recirculation pour tester la nature chimique des connexions synaptiques qui restent dans la TTX.
    Remarque : Lors de la combinaison optogenetics et fluorescent ciblant des neurones, il peut être important de ne pas activer constamment la population présynaptique des neurones tout en essayant d’obtenir un enregistrement. Cela peut conduire à la dépression synaptique et il est difficile de voir les connexions. Parce que csChrimson a une bande longue excitation qui s’étend largement dans la gamme de protéine fluorescente verte, un fluorophore rouge peut être utilisé pour visualiser les neurones et channel2rhodopsin (Ch2R) peut être utilisé pour exciter les populations cellulaires. Cela requiert génétique spécifique et un cube de filtre personnalisé. Pour générer des mouches appropriés, faire des mouches qui expriment le fluorophore rouge (DP ou mCherry) sous les systèmes d’expression binaire système LexA ou Q. Ceux-ci devront être croisé avec mouches exprimant un promoteur Gal4 et gènes effecteurs SAMU-Ch2R et SAMU-NaChBac. Le cube filtre optimal pour épifluorescence aura une gamme étroite d’excitation pour exciter le fluorophore rouge, mais pas exciter la Ch2R. en outre, l’ensemble du filtre devrait inclure un filtre d’émission longue passe pour collecter autant de lumière émise. Nous avons utilisé un filtre personnalisé de chrominance qui comprenait la partie numéros et580/25 x et t600lpxr (à partir de l’ensemble 49306), mais avec un filtre d’émission/barrière d’et610lp.

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Résultats

TERPS sert à distinguer les mono - et polysynaptiques contributions dans les connexions synaptiques entre les neurones. Alors que la stimulation faible d’une cellule peut être utilisée pour tester les connexions directes, une plus grande activité présynaptique de conduite souvent recrute polysynaptiques connexions (Figure 1 a). TERPS travaille en exprimant conjointement canal sodique insensibles à la TTX NaChBac et un activateur d’optogenetic et en testant le...

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Discussion

Analyse de la TERPS complimente les techniques actuelles utilisées pour circuit fissuration en permettant la détection des synapses entre les neurones. Plus précisément, l’approche indique monosynaptiques connexions par largement faire taire les potentiels d’action avec TTX tout en rétablissant l’excitabilité dans une population de sélectionner des neurones avec canal sodique insensibles à la TTX NaChBac. Libération synaptique est induite par la stimulation de l’optogenetic, tandis que les événements postsynaptiques sont...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Joshua Singer, Jonathan Schenk, ainsi que réfléchies évaluateurs pour commentaires sur le manuscrit. Nous tenons également à remercier Ben White et Harold Zakon pour des discussions sur la technique. Jonathan Schenk a fourni les données de la Figure 3 a. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de Whitehall et une R21 NIH au QG.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Utilisé comme activateur neuronal
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Résotores excitabilité dans les cellules du TTX
TetrodotoxineTochris1078autorisation spéciale peut être nécessaire pour acheter du TTX car il s’agit d’une substance contrôlée
tout trans-rétinienSigma-Aldrichall trans-rétinienR2500Nécessite un cofacteur pour la canalrhodopsine
Soudable Acier inoxydable 321  ; Feuille,  ; 0,002"  ; Épais,  ; 10"  ; LargeMcMaster Carr3254K7Utilisé pour fabriquer un porte-mouche personnalisé. La feuille personnalisée peut être découpée au laser à pololu.com à partir du fichier PDF fourni
Microscope de dissectionZeissStemi 2000-CUtilisé pour la dissection de la préparation
CireAlmoreEectra Waxer 66000Utilisé lors de la dissection pour fixer la mouche dans la feuille
Cire de paraffineJoann4917217Utilisé avec la pince
à épiler Numéro 5Outils de science fine#5COUtilisé pour la dissection et le dégainage
Ciseaux de dissectionOutils de science fine15001-08Utilisé pour enlever des parties de la cuticule lors de la dissection
Fil de tungstèneA-M Systems797500Utilisation avec l’électrolyse pour fabriquer des aiguilles aiguisées pour la dissection
Pompe péristaltique réciculanteSimply Pumps (Amazon)PM200Spour la recirculation
pour pompe péristaltiqueZitrades (Amazon)N/APWM Contrôleur de gradation pour lumières LED ou ruban, 12 Volt 8 ampères, Interrupteur de lumière à luminosité réglable Contrôleur de gradateur DC12V 8A 96W pour bande lumineuse à LED B
Versa-Mount  ; Régulateur d’air comprimé de précisionMcMaster Carr1804T1Pour l’application d’une pression positive pendant le patching
Boîtiers en verreWorld Precision InstrumentsTW150F-3Pour pipettes patch
Manomètre polyvalentMcMaster Carr3846K431Manomètre pour régulateur de pression
Caméra d’électrophysiologieDage MTI  ;IR-1000Tout appareil photo qui fonctionne dans la plage IR (850 nm) fonctionnera. Vous ne souhaitez pas utiliser l’éclairage rouge car cela peut activer csChrimson
IR LEDThorlabs  ;M850F2Pour fibre optique à éclairage oblique
pour LED IRThorlabsM89L01Couple à lentille d’objectif LED IR
nbsp ;Olympus 40XLUMPlanFLNCela peut être utilisé sur la plupart des microscipes et fonctionne bien pour visualiser les neurones des mouches.
LED ambréeM590L3dPour visualiser l’appel d’offres et la LED bleue mCherry
ThorlabsM470L3dPour visualiser le
filtres GFP GFPChroma49011Pour visualiser la GFP ou le canal stimulant2rhodopsin
Jeu de filtres mCherry personnaliséChroma  ; ET580/25X et T600LPXR (à partir de l’ensemble 49306) mais avec une optique de barrière/émission ET610LPÀ utiliser uniquement si vous souhaitez patcher les neurones identifiés avec channel2rhodopsin
Dichroic pour combiner des LED ambrées etbleues ThorlabsDMLP550RUtilisez uniquement un patch sous mCherry et excitez channel2rhodopsin avec de la lumière bleue.
LED rougesSupplyCree XPE 620 - 630 nmUtilisé pour piloter csChrimson
LED DriverLEDSupply3021-D-E-1000Utilisé pour piloter les LED pour la stimulation optogénétique
ManipulateurSutter InstrumentsMP-225Utilisé pour positionner la pipette pendant les enregistrements
Amplificateur PatchclampA-M SystemsModèle 2400Un amplificateur équivalent convient
Filtre Bessel WarnerInstruments  ;LPF 202AFiltre auxiliaire utilisé pour filtrer la trace de courant vers l’oscilloscope pendant le patching.
Système d’acquisition de données  ;National InstrumentsNI PCIe-6321  ;   ;   ;   ;   ;   ; 781044-01Utilisé pour enregistrer des données de l’amplificateur à l’ordinateur
Bloc de connexion - Borne BNC BNC-2090ANational Instruments779556-01Utilisé pour connecter l’amplificateur à la carte DAQ.
Feuille d’acier  ;McMaster Carr3254K7Feuille d’acier pour chambre d’enregistrement personnalisée
AimantsK& J MagneticsD42Pour fixer la chambre d’enregistrement au support d’anneau
1/16" Cell Cast Acrylic ClearPololuUtilisé pour fabriquer une chambre d’enregistrement personnalisée. L’acrylique peut être découpé au laser à pololu.com partir du fichier PDF fourni
Une Contrôleur de vitesse TTX& Thorlabs jeu de

Références

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Mots-clés

Neurones de Drosophilaenregistrements en cellule enti reactivation optog n tiqueapplication de t trodotoxineantagonistes pharmacologiquesanalyse de la transmission volum triquetest des connexions synaptiquesconfiguration du dispositif d lectrophysiologie

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