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Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

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DOI :

10.3791/57056

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3 mai 2018

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1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

Dans cet article

Résumé

Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.

Résumé

Lorsque les niveaux de l’état stationnaire RNA sont comparées entre deux conditions, il n’est pas possible de distinguer si les changements sont causés par des modifications de la production ou la dégradation de l’ARN. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure de la production d’ARN, à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage d’ARN suivie d’immunoprécipitation, qui permet l’investigation de l’ARN synthétisé dans un court délai (par exemple, 1 h). L’avantage de 5-Bromouridine-étiquetage et immunoprécipitation sur l’utilisation d’inhibiteurs de transcriptional toxiques, tels que le α-amanitine et l’actinomycine D, est qu’il n’y aucune ou très peu d’effets sur la viabilité cellulaire lors d’une utilisation à court terme. Cependant, parce que le 5-Bromouridine-immunoprécipitation capte seulement RNA produites dans le court délai d’étiquetage, produit lentement comme rapidement dégradés RNA peut être difficile à mesurer par cette méthode. L’ARN 5-Bromouridine-marqué capturé par 5-Bromouridine-immunoprécipitation peut être analysé par transcription inverse, quantitative PCR et séquençage de la génération suivant. Tous les types d’ARN peuvent être l’objet d’une enquête, et la méthode n’est pas limitée à la mesure des ARNm est présenté dans cet exemple.

Introduction

5-Bromouridine (BrU) immunoprécipitation (IP) permet l’étude de la production d’ARN dans les cellules avec no ou des effets très limités sur cellulaire physiologie au cours de la brève période1,2d’étiquetage. La méthode repose sur l’incorporation du dérivé synthétique de l’uridine BrU en ARN nouvellement synthétisé suivi par IP d’ARN marqué à l’aide d’anticorps anti-BrU (Figure 1).

On sait depuis des décennies que la synthèse de protéine peut être réglée de transcription, et l’existence de facteurs de transcription a émis l’hypothèse il y a plus de 50 ans3. Aujourd'hui, on sait que plusieurs maladies sont causées par le dérèglement de la transcription et de la stabilité de la RNA (complémentaire Figure S1 en référence4), et la capacité à mesurer les changements dans la production d’ARN est d’une grande importance dans la maladie de compréhension développement.

En revanche, outils pour réguler la production d’ARN fournissent de nouvelles possibilités pour le traitement de maladies causées par l’expression de protéines trop ou trop peu, ou l’accumulation de protéine comme dans la maladie de Parkinson (MP). La protéine prédominante, accumulant des agrégats comme insolubles dans PD est α-synucléine, et le niveau de la synucléine α est directement lié à la maladie, comme des causes de multiplication de gène du gène α-synucléine familial PD5. Par ailleurs, α-synucléine regroupe de manière dépendante de la concentration. Diminution de l’expression des ARNm de la synucléine α est donc une stratégie thérapeutique intéressante, qui a été réalisée avec succès à l’aide de l’interférence ARN pour diminuer la perte des neurones dans PD modèles rongeurs6,7.

Il est important de pouvoir mesurer les changements dans la production d’ARN causée par une maladie ou des interventions thérapeutiques. Méthodes de pointe pour mesurant les niveaux d’ARN, l’état stationnaire comme transcription inverse suivie par quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ne sont pas capables de distinguer les changements causés par la régulation de la transcription ou altérés Stabilité de RNA. Une méthode largement utilisée pour l’étude des taux de décomposition de RNA n’entrave de la machinerie transcriptionnelle utilisant des composés tels que le α-amanitine ou l’actinomycine D, suivie par des mesures de l’ARN en décomposition. Cependant, il y a certains problèmes liés à un blocage général de transcription dans des cellules, telles que l’induction de l’apoptose8,9. À côté des effets cytotoxiques, inhibiteurs de la transcriptionnelles présentent également de nombreux problèmes techniques, comme la lente absorption cellulaire de le α-amanitine et le manque de spécificité de l’actinomycine D (revu en référence10).

Pour éviter le blocage total de la transcription, analogues nucléotidiques ont été utilisées, comme 5-éthynyl uridine (UE 5), 4-thiouridine (TU-4) et BrU. Ceux-ci sont facilement absorbés par les cellules de mammifères et incorporés dans l’ARN nouvellement synthétisé, permettant pouls-étiquetage de l’ARN dans un délai spécifique. BrU est moins toxique que l’UE 5 et 4-TU, ce qui en fait le préféré analogique de choix11,12.

BrU-IP peut servir à enquêter sur les deux le taux de synthèse d’ARN et de la stabilité et donc distinguer les causes des changements dans l’ARN total. Cet article se concentrera sur la mesure de la synthèse d’ARN et se réfère pour faire référence à2 pour plus de détails sur l’étude de stabilité de RNA. Pour étudier la synthèse de l’ARN, les cellules sont brièvement étiquetés avec BrU par exemple pendant 1 h puis BrU-IP1 (Figure 1). Ceci permet des mesures de l’ARN synthétisé dans le court délai d’étiquetage et les changements observés donnera une meilleure estimation des règlements dans la synthèse de l’ARN qu’en mesurant les changements dans l’ARN total par RT-qPCR. Il convient de mentionner, toutefois, que même si le temps d’étiquetage est, par exemple, seulement 1 h, dégradation peut avoir encore une influence sur les niveaux d’ARN observés.

L’ARN à partir des expériences de BrU-IP ne conviennent pas pour analyse en aval par les deux RT-qPCR1 ou prochaine génération séquençage2,13. Autres méthodes de détection RNA standards, tels que le transfert de Northern ou dosage de ribonucléase de protection, peuvent également s’appliquer pour certains ARN.

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Protocole

Remarque : Exécutez toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire et garder les tampons sur la glace ou dans le réfrigérateur (à l’exception de l’élution de la mémoire tampon contenant du SDS). Le protocole est divisé en 5 sections : échantillons de la préparation de l’ARN ; préparation des perles de la propriété intellectuelle ; liaison de l’ARN marqué BrU de perles ; élution et la purification d’ARN de BrU-étiqueté lié par extraction de 3 étapes de phénol-phénol/chloroforme-chloroforme ; analyse de l’ARN (dans cet exemple à l’aide de la RT-qPCR)

1. préparation des échantillons d’ARN

  1. Cellules HEK293T comte utilisant une cellule automatisée contrer et 3 500 000 cellules dans un plat de Pétri de 10 cm dans 10 mL de milieu de croissance (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco additionné de 10 % de sérum de veau foetal et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine) des graines afin d’obtenir un total de > 40 µg RNA après extraction 48 h plus tard. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. 48 h après l’ensemencement, aspirer 8 mL de milieu de croissance et laisser 2 mL pour éviter le dessèchement des cellules. Ajouter 2 mM BrU et tout traitement à 8 mL aspiré des milieux de culture et enlever les résidus de 2 mL des cellules avant de rebrancher le 8 mL de milieu de culture contenant BrU. Évitez d’utiliser des supports neufs, à la demande de la BrU aux cellules, puisque ceci peut induire des changements dans l’expression des gènes.
  3. Incuber les cellules pendant 1 h avec BrU et traitement. Laver les cellules dans un tampon de 5 mL Hank et trypsinize les cellules à l’aide de trypsine de 0.05 % de 2 mL. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance pour arrêter la réaction, transférer les cellules dans un tube de 15 mL et tournez en bas les cellules pendant 2 min à 1 000 x g.
  4. Retirez le surnageant et extrait le culot cellulaire à l’aide d’un ARN de l’ARN total nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre méthode préférée et éluer exempte de RNase H2O. magasin de l’ARN à-80 ° C jusqu’au moment de procéder.

2. préparation des perles de la propriété intellectuelle

  1. Préparer les perles en lots pour le nombre d’échantillons à étudier plus un supplémentaire pour tenir compte des pertes pendant le pipetage et whirl mélange. Remettre en suspension les billes magnétiques de anti-souris IgG soigneusement par le mélange de tourbillon et retirer 20 perles µL par échantillon dans un tube de 1,5 mL de RNase-libre. Place le tube de 1,5 mL dans un support magnétique et laisser environ 20 s pour les perles pour recueillir sur le côté.
  2. Retirez le surnageant, sortir le tube du support magnétique et resuspendre dans 400 µL de tampon de BrU-IP 1 x par pipetage. Tourner le tube très brièvement pour 2 s dans une centrifugeuse de table-top, placez-le dans le socle magnétique et éliminer le surnageant. Répéter une fois l’étape de lavage.
  3. Liaison non-spécifique de bloc aux billes à l’aide de l’héparine. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampon de l’héparine et laisse tourner pour 30 min. Lavez les perles une fois, comme dans l’étape 2.2.
    Remarque : L’héparine est un polymère chargé négativement, qui sera en concurrence avec l’ARN pour la liaison. ARNt ou autres ARN non pertinent aussi peut être utilisé que si l’application en aval n’est pas séquençage.
  4. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x tampon de BrU-IP et ajoutez 1,25 µg/échantillon anti-α-bromodéoxyuridine anticorps, qui reconnaît également BrU. Incuber les perles pendant 1 h pendant la rotation, ou jusqu’au lendemain à la température ambiante.
  5. Laver les perles trois fois comme au point 2.2. Remettre en suspension les perles dans 50 µL/sample 1 x tampon de BrU-IP additionné de 1 mM BrU et laisser tourner pendant 30 min diminuer la sensibilité de l’anticorps lié aux talons et par la présente le risque de liaison non-spécifique au cours de la propriété intellectuelle.
  6. Laver les perles trois fois comme à l’étape 2.2 et remettre en suspension dans un tampon 50 µL/échantillon 1xBrU-IP.

3. liaison d’ARN marqué BrU à perles

  1. Mesurer les concentrations de RNA dans les extraits de RNA de l’étape 1.3 par spectrophotométrie UV-visible et diluer 40 µg RNA chaque échantillon libre de RNase H2O pour un volume total de 200 µL.
  2. Chauffer les échantillons d’ARN pendant 2 min à 80 ° C pour dénaturer l’ARN et essorage brièvement dans une centrifugeuse de table. Ajouter 200 µL 2 x inhibiteur de RNAse-IP + BSA/BrU.
  3. Ajouter 50 µL resuspendues et préparé des billes de l’étape 2.6 pour chaque échantillon et laisser tourner 1 h. lavage les perles quatre fois comme à l’étape 2.2.

4. élution et la Purification de l’ARN par Extraction au phénol-phénol/chloroforme-chloroforme 3 étapes

  1. Éluer l’ARN et d’effectuer l’extraction de phénol
    1. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon d’élution pour éluer l’ARN et rapidement par la suite ajouter 200 phénol µL, pH 6,6 (attention : toxique, voir note ci-dessous étape 4.1.2) pour éliminer toute non-RNA des molécules de l’échantillon.
    2. Tourbillon de mélanger l’échantillon et un essorage 3 min à 25 000 x g dans une centrifugeuse de table.
      NOTE : Phénol est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Le pH légèrement acide veille à ce que seulement les ARN et pas d’ADN, est extraite. L’ARN restera dans la phase aqueuse supérieure en raison de la nature hydrophile de charges. Les noyaux hydrophobes des protéines lient le phénol et passer à la phénol-phase organique inférieure.
  2. Effectuer l’extraction de phénol-chloroforme
    1. Aspirer autant phase supérieure possible (environ 190 µL de la 200 µL, selon l’expérience dans la manutention) et le mettre dans un tube avec 200 µL phénol/chloroforme, pH 6,6 (attention : toxique, voir la note). Veillez à aspirer la même quantité dans les trois échantillons.
    2. Tourbillon mélanger l’échantillon et un essorage pendant 3 min à 25 000 x g.
      NOTE : Chloroforme est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Chloroforme est ajouté au phénol, qui peut affecter l’analyse en aval de l’ARN par inhibition de la transcription inverse14 et amplification des réactions en chaîne15.
  3. Effectuer l’extraction de chloroforme en aspirant la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 180 µL) et transférer dans un tube contenant le 200 µL chloroforme. Tourbillon mélanger l’échantillon et tourner 3 min à 25 000 x g.
  4. Aspirer la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 170 µL) et transférez-le dans un tube contenant 17 µL (volume 1/10) 3M CH3COONa, pH 6,0. Pour neutraliser et précipiter RNA de la solution aqueuse, ajouter 2 glycogène µL (20 mg/mL), qui précipite ainsi que RNA et rend le culot de RNA plus visible.
  5. Ajouter 500 µL 96 % d’éthanol pour augmenter la liaison entre les ions salins et les ARN et les mélanger en renversant le tube une couple de fois. Maintenir le tube nuit à-20 ° C ou 15 minutes sur la glace sèche.
  6. Faites tourner l’échantillon à 25 000 x g, 4 ° C pendant 30 min. jetez surnageant sans déranger le culot et laver le culot dans 185 µL 75 % d’éthanol d’enlever n’importe quel sel résiduel. Tourner à 25 000 x g, 4 ° C pendant 5 min.
  7. Jeter le surnageant complètement sans déranger le culot et laisser le culot pour sécher 5-10 min avec un couvercle ouvert. Resuspendre dans 10 µL exempte de RNase H2O appliqué sur le côté du tube pour éviter de déranger le culot.

5. analyse de l’ARN

  1. Préparer le cDNA utilisant une ADNc de la transcription inverse nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre préféré méthode utilisant 2 µL d’échantillon RNA et 1 µg levure ARN total comme transporteur RNA pour la réaction de synthèse de cDNA (non utilisée si l’ADNc est utilisé pour l’ordonnancement de la génération suivante). Utilisez 1 µg RNA sans levure RNA pour préparation de cDNA de l’entrée correspondante.
  2. ADNc diluée 01:25 et mélange 9 µL dilué d’ADNc avec 10 µL qPCR Master 1 µL fluorogène sonde et mélange les deux spécifiés dans la Table des matières.
    Remarque : La dilution de l’ARNC dépend de la préparation de l’ARNC et qPCR méthode utilisée.
  3. Exécutez le programme suivant de qPCR (par exemple, sur un système rapide de Real-time PCR 7500 ou l’équivalent) : 2 min à 50 ° C, 20 s à 95 ° C, 40 cycles de 3 s à 95 ° C et 30 s à 60 ° C.

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Résultats

Nos premiers tests de temps de BrU-étiquetage ont été effectuées dans les cellules CPIRA-1. Les cellules ont été traitées avec BrU 0, 1, 2 et 4,5 h, suivie par l’extraction de l’ARN totale et BrU-IP. GAS5 et GAPDH ont été mesurés dans l’ARN BrU-IP, ce qui démontre que l’étiquetage 1 h est suffisant pour atteindre un changement environ 9 et 44 fois comparé à fond (0 h) pour GAPDH et GAS5, respectivement.

BrU-propriété intellectue...

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de BrU-IP pour la détermination de la production d’ARN par étiquetage des nouvellement produites RNA pendant 1 h avec BrU, suivie d’extraction de l’ARN immédiate et immunoprécipitation d’ARN marqué BrU. Cette méthode a déjà été décrit dans référence16, et cet article comprend quelques étapes supplémentaires pour augmenter la spécificité de la propriété intellectuelle et de la pureté de RNA, par prétraitement des billes avec de faibles concentrations de BrU, mais a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La Fondation de Lundbeck, Université d’Aarhus, Dandrite et Lundbeck a/s pris en charge ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Inhibiteur de la Rnase RibolockThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Mouton anti-souris IgGLife Technologies11202D
&alpha ;-Bromodeoxyuridinesouris anticorps BD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo FisherSpectrophotométrie ultraviolette-visible
Phénol saturé en eau pH 6,6ThermoFisherAM9712
Phénol :Chloroforme :IAA 25:24:1 pH 6.6ThermoFisherAM9732
Kit d’isolement d’ARN hautement purRoche11828665001
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
Sondes d’ARN TaqmanThermoFisherSNCA : Hs01103383_m1, 18sRNA : Hs03928985_g1, ACTB : Hs01060665_g1, HMBS : Hs00609296, NADH : Hs01072843_m1Sondes flurogéniques
7500 Système de PCR rapide en temps réelApplied Biosystems
HEK293T lignée cellulaireATCC
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumLonzaBE12-604F
Sérum de veau fœtalBiochromS0115
Pénicilline/StreptomycineBiochromA2213
de Hank5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 et 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoclave.
DEPC-H2O0,1 % de diéthylpyrocarbonate traité H2O
2xBrU-IP Tampon40 mM Tris-HCl pH 7,5 et 500 mM NaCl dans DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibiteur2xBrU-IP tampon complété par 1 &mu ; g/&mu ; L BSA et 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL d’héparine2xBrU-IP tampon 1:1 DEPC-H2O et complété par 1mg/mL d’héparine
1xBrU-IPtampon 2xBrU-IP dilué 1:1 dans du DEPC-H2O et complété par 0,5 &mu ; g/&mu ; L BSA et 20 U/mL Tampon
d’élution0,1 % SDS dans H2O sans ARNASE
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité ThermoFisher 4368814 Tampon Ribolock

Références

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  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
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  15. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
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Mots-clés

Immunopr cipitation de l ARNmesure de la synth se d ARNcellules HEK293Textraction d ARNbilles magn tiquesanticorps anti bromod soxyuridinetampon de Bromouridine IPmesure de la concentration d ARNextraction ph nol chloroforme

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